金纳米颗粒及其制备方法、复合材料和应用
阅读说明：本技术 金纳米颗粒及其制备方法、复合材料和应用 (Gold nanoparticle, preparation method thereof, composite material and application ) 是由 蒋兴宇 王乐 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了金纳米颗粒及其制备方法、复合材料和应用。本申请的第一方面,提供金纳米颗粒,该金纳米颗粒上修饰有硫代脯氨酸,硫代脯氨酸至少部分具有氨基保护基。申请人在实验过程中发现,仅含硫代脯氨酸修饰的金纳米颗粒会因为硫代脯氨酸中氨基与羧基的反应而发生自组装,形成大颗粒,进而无法暴露出活性位点,使其抗菌活性大大降低。而本申请中采用氨基保护基对至少一部分的硫代脯氨酸中的氨基进行保护后,形成氨基保护的硫代脯氨酸与氨基未保护的硫代脯氨酸共同修饰金纳米颗粒,这种情况下,自组装的聚集颗粒会解组装,从而重新使得其中的活性位点暴露出来,抗菌活性大大提高。(The invention discloses a gold nanoparticle, a preparation method thereof, a composite material and application. In a first aspect of the present application, gold nanoparticles are provided, which are modified with thioproline, which at least partially has an amino protecting group. In the experimental process, the applicant finds that the gold nanoparticles modified by the thioproline only can be self-assembled due to the reaction of amino and carboxyl in the thioproline to form large particles, so that active sites cannot be exposed, and the antibacterial activity of the gold nanoparticles is greatly reduced. In the application, after the amino protection group is adopted to protect the amino in at least one part of the thioproline, the gold nanoparticle modified by the thioproline protected by the amino and the thioproline unprotected by the amino is formed, and under the condition, the self-assembled aggregated particles can be disassembled, so that the active sites in the gold nanoparticle are exposed again, and the antibacterial activity is greatly improved.)
技术领域
本申请涉及抗菌技术领域，尤其是涉及金纳米颗粒及其制备方法、复合材料和应用。
背景技术
细菌伤口感染，特别是烧伤创面感染、手术后切口感染及褥疮感染对人体健康是一个严重的威胁，甚至会直接导致死亡。自抗生素从问世以来，在过去的近100年内拯救了无数人的生命。抗生素的滥用诱发细菌出现了严重的耐药性，细菌感染导致死亡的病患数量急剧增加。然而，新型抗生素的发展却非常缓慢，并且传统的抗生素制备工艺涉及复杂的发酵或合成过程。因此，探索一种新的抗菌策略来对抗超级细菌迫在眉睫。
金纳米颗粒具有比表面积大，表面功能化程度高，物理化学性质独特的特性，可以用于开发和制备新型抗菌药物，其独特的抗菌机理和良好的生物相容性，相比传统抗生素也具备更大的优势。匹多莫德可用于预防急性感染，缩短病程，减少疾病的严重程度，可作为急性感染期的辅助用药。硫代脯氨酸(L-thioproline,T)是制备匹多莫德的重要原料，通过巯基与金纳米颗粒形成金-硫键，有望制备抗菌活性优异且合成方法简便的新型金纳米抗菌剂。然而制备过程中发现产物的抗菌活性较低，难以达到预期。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有更优异的抗菌活性的金纳米颗粒。
本申请的目的还在于提供一种金纳米颗粒的制备方法。
本申请的目的还在于提供一种复合材料。
本申请的目的还在于提供该金纳米颗粒的应用。
本申请的第一方面，提供金纳米颗粒，该金纳米颗粒上修饰有硫代脯氨酸，硫代脯氨酸至少部分具有氨基保护基。
根据本申请实施例的金纳米颗粒，至少具有如下有益效果：
申请人在实验过程中发现，仅含硫代脯氨酸修饰的金纳米颗粒会因为硫代脯氨酸中氨基与羧基的反应而发生自组装，形成大颗粒，进而无法暴露出活性位点，使其抗菌活性大大降低。而本申请中采用氨基保护基对至少一部分的硫代脯氨酸中的氨基进行保护后，形成氨基保护的硫代脯氨酸与氨基未保护的硫代脯氨酸共同修饰金纳米颗粒，这种情况下，自组装的情况大大减少，其中的活性位点能够更多地被暴露出来，抗菌活性大大提高。
在本申请的一些实施方式中，硫代脯氨酸上的氨基保护基可以分为烷氧羰基类氨基保护基(诸如苄氧羰基Cbz、叔丁氧羰基Boc、笏甲氧羰基Fmoc、烯丙氧羰基Alloc、三甲基硅乙氧羰基Teoc)、酰基类氨基保护基(诸如邻苯二甲酰基Pht、对甲苯磺酰基Tos、三氟乙酰基Tfa)和烷基类氨基保护基(诸如三苯甲基Trt、2,4-二甲氧基苄基Dmb、对甲氧基苄基Pmb、苄基Bn)等。
在本申请的一些实施方式中，氨基保护基为烷氧羰基类氨基保护基，优选为Boc。Boc作为目前广泛使用的保护基，具有良好的稳定性，因而优选采用Boc对硫代脯氨酸的氨基进行保护。
在本申请的一些实施方式中，不具有氨基保护基的硫代脯氨酸与具有氨基保护基的硫代脯氨酸的摩尔比为1：(0.1～10)，即两者之比在1：0.1到1：10之间。
在本申请的一些实施方式中，不具有氨基保护基的硫代脯氨酸与具有氨基保护基的硫代脯氨酸的摩尔比为4：(1～16)。当两类硫代脯氨酸的比例在上述范围时，金纳米颗粒的分散性和Boc保护达到较好的平衡，可以暴露出较多的活性官能团，大大优化了金纳米颗粒的抗菌活性。
在本申请的一些实施方式中，不具有氨基保护基的硫代脯氨酸与具有氨基保护基的硫代脯氨酸的摩尔比为1：(1～4)，优选为1：(1～2)。
在本申请的一些实施方式中，不具有氨基保护基的硫代脯氨酸与具有氨基保护基的硫代脯氨酸的摩尔比约为1：1。当两类硫代脯氨酸的比例约为1：1时，实现了金纳米颗粒的抗菌活性的最大化。其中，“约”数是指1：1的比值±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％、±0.1％的误差范围。
本申请的第二方面，提供金纳米颗粒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将硫代脯氨酸、氯金酸、还原剂混合反应，得到金纳米颗粒；硫代脯氨酸至少部分具有氨基保护基。
在本申请的一些实施方式中，混合反应体系还包括表面活性剂。
在本申请的一些实施方式中，表面活性剂选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂。
在本申请的一些实施方式中，阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵和十二烷基二甲基苄基氯化铵中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，非离子表面活性剂选自吐温和聚乙二醇中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾、硼氢化锂、柠檬酸、柠檬酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸盐中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，氨基保护基选自Cbz、Boc、Fmoc、Alloc、Teoc、Pht、Tos、Tfa、Trt、Dmb、Pmb、Bn中的至少一种；优选为Boc。
在本申请的一些实施方式中，硫代脯氨酸中，不具有氨基保护基的硫代脯氨酸与具有氨基保护基的硫代脯氨酸的摩尔比为4：(1～16)，优选的，摩尔比约为1：1。
在本申请的一些实施方式中，氯金酸与硫代脯氨酸的比例为1：(0.1～10)。
在本申请的一些实施方式中，还原剂与氯金酸的摩尔比为(1～10)：1，优选为(2～8)：1，优选为3：1。
在本申请的一些实施方式中，混合反应体系还包括有机胺。
在本申请的一些实施方式中，有机胺选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙二胺中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，金纳米颗粒的平均粒径为1～35nm，优选为1～10nm。
在本申请的一些实施方式中，该制备方法包括以下步骤：
(1)将硫代脯氨酸、氯金酸、表面活性剂、有机胺溶于去离子水或超纯水中，冰浴至完全溶解；硫代脯氨酸至少部分具有氨基保护基；
(2)搅拌条件下加入还原剂混合反应，透析，过滤灭菌，得到金纳米颗粒。
本申请的第三方面，提供一种组合物，该组合物包括前述的金纳米颗粒。含有前述金纳米颗粒的组合物中金纳米颗粒的活性位点被充分地被暴露出来，具有优异的抗菌活性。
本申请的第四方面，提高一种抗菌剂，该抗菌剂包括作为活性成分的前述的金纳米颗粒。
在本申请的一些实施方式中，该组合物或抗菌剂还包括药学上可接受的载体，以此形成入注射剂、片剂、胶囊、透皮剂、稀释剂等不同的剂型。可以理解的是，在组合物或抗菌剂中，还可以进一步包括其它抗菌活性成分，通过两者或更多种的相互组合，协同增效获得更好的抗菌效果。
本申请的第五方面，提供一种复合材料，该复合材料包括基材和负载于基材的前述的金纳米颗粒。负载有前述的金纳米颗粒的复合材料具有良好的抗菌效果，可以高效抑菌或除菌，极大地避免细菌感染等问题的出现。
其中，基材的非限制性实例包括天然或合成高分子材料，具体包括蚕丝蛋白、壳聚糖、纤维素、明胶、胶原以及聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等一些生物相容性良好的材料。可以理解的是，作为基材的同样可以是生物陶瓷、生物玻璃、金属等其它具有良好生物相容性的材料。负载的方法包括但不限于掺杂在基材中或在基材表面形成抗菌涂层等方式。
该复合材料具有良好的抗菌活性，在医疗领域中可以作为诸如敷料、人工血管、支架或其它植入物或其构成部件使用。
本申请的第六方面，提供前述的金纳米颗粒在制备医疗耗材和医疗器械中的应用。将上述的金纳米颗粒引入到医疗耗材和医疗器械中，提高这些耗材或器械在使用时的抑菌抗感染的效果。
其中，前述组合物、抗菌剂、复合材料等抗菌产品具有抗革兰氏阴性菌和具有多药耐药性的临床分离菌的作用。
在本申请的一些实施方式中，革兰氏阴性菌优选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克列伯杆菌(KlebsiellaPneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等，具有多药耐药性的临床分离菌为具有多药耐药性的大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克列伯杆菌、鲍曼不动杆菌等。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是实施例1～5和对比例1～2中所用的L-硫代脯氨酸和Boc-L-硫代脯氨酸的结构式(a)以及制备得到的金纳米颗粒的形貌表征结果(b)～(h)。
图2是实施例1～5和对比例1～2中制备得到的金纳米颗粒的结构示意图(a)以及实施例6中细菌纤维素膜敷料的抗菌原理示意图(b)。
图3是实施例3制备得到的金纳米颗粒的抗菌机理表征结果。
图4是实施例6中制备得到的负载不同浓度LB11的BC纤维膜的宏观照片及形貌表征结果。
图5是实施例6中制备得到的负载不同浓度LB11的BC纤维膜的抗菌性能表征结果。
图6是实施例6中制备得到的负载LB11的BC纤维膜的生物安全性表征结果。
图7是实施例6中制备得到的负载LB11的BC纤维膜的动物实验结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以下实施例中使用的试剂如下：
三乙胺，吐温80，甲醇，硼氢化钠，购自sigma公司；
三水氯金酸，购自国药集团化学试剂有限公司；
Boc-L-硫代脯氨酸，购自上海吉至生化科技有限公司；
过滤器，购自密理博(Millipore)公司；
透析袋(14kDa MW cut-off，Solarbio)液体LB培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；
大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞杆菌(K.p)、鲍曼不动杆菌(A.b)、肺炎克列伯杆菌(P.a)的敏感株及对应的多药耐药株，购自北京佑安医院；
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉成纤维细胞(HAF)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例1
本实施例提供一种金纳米颗粒，该金纳米颗粒上修饰有硫代脯氨酸，该硫代脯氨酸包括摩尔比为4：1的L-硫代脯氨酸与Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LB41。
该金纳米颗粒的制备方法如下：
(1)在圆底烧瓶中，将0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸，0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸，0.05毫摩尔的三水氯金酸，50微升的三乙胺和30毫克的吐温80溶于10毫升超纯水中，并在冰水浴中混合10分钟直至分子完全溶解。
(2)使用磁力搅拌器，调节至1000rpm，向圆底烧瓶中加入新制的3mg/mL的硼氢化钠溶液(上海阿拉丁)，瓶中的溶液颜色立即变成棕色，保持此反应条件再反应2小时，得到Boc-L-硫代脯氨酸的金纳米颗粒(BLT)。
(3)将BLT用透析袋透析48小时除去未反应的化学物质，通过0.22微米过滤器过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。
实施例2
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸中L-硫代脯氨酸与Boc-L-硫代脯氨酸的摩尔比约为2：1，制备过程中选择0.034毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.016毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LB21。
实施例3
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸中L-硫代脯氨酸与Boc-L-硫代脯氨酸的摩尔比为1：1，制备过程中选择0.025毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.025毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LB11。
实施例4
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸中L-硫代脯氨酸与Boc-L-硫代脯氨酸的摩尔比约为1：2，制备过程中选择0.016毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.034毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LB12。
实施例5
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸中L-硫代脯氨酸与Boc-L-硫代脯氨酸的摩尔比约为1：4，制备过程中选择0.01毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.04毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LB14。
对比例1
本对比例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸为L-硫代脯氨酸，制备过程中选择0.05毫摩尔的L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸。将该金纳米颗粒记为LT。
对比例2
本对比例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别仅在于，硫代脯氨酸为Boc-L-硫代脯氨酸，制备过程中选择0.05毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸代替实施例1中0.04毫摩尔的L-硫代脯氨酸和0.01毫摩尔的Boc-L-硫代脯氨酸，10毫升超纯水替换为10毫升甲醇。将该金纳米颗粒记为BLT。
金纳米颗粒比较
1.形貌观察
分别取实施例1～5和对比例1～2制备得到的金纳米颗粒，采用透射电子显微镜表征硫代脯氨酸修饰的金颗粒的形态，结果如图1所示。其中，(a)为L-硫代脯氨酸和Boc-L-硫代脯氨酸的结构式，(b)～(h)分别是对比例1(LT)、实施例1(LB41)、实施例2(LB21)、实施例3(LB11)、实施例4(LB12)、实施例5(LB14)、对比例2(BLT)的TEM图，标尺均为20nm。从图中可以看出，对比例1中修饰有L-硫代脯氨酸的金纳米颗粒LT已经明显自组装形成大颗粒，而实施例1～5和对比例2采用了Boc-L-硫代脯氨酸进行修饰的金纳米颗粒后，大颗粒自组装程度有了明显下降，颗粒分散性更好。并且，随着硫代脯氨酸中Boc-L-硫代脯氨酸比例的增加，颗粒的分散性逐渐上升。
2.抗菌活性实验
将大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞杆菌(P.a)、肺炎克列伯杆菌(K.p)、鲍曼不动杆菌(A.b)的敏感株及对应的多药耐药株(M E.coli、M P.a、M K.p、M A.b)接种在液体LB培养基中，浓度为1×104CFU/mL。将硫代脯氨酸修饰的金纳米颗粒或常见的抗生素，稀释2-128倍后分别加入接有细菌的培养基中，记录细菌在37℃培养24小时后材料的最低抑菌浓度(MIC)，结果表1所示。
表1.金纳米颗粒抗菌活性表征结果
从上述抗菌活性的表征结果可以看出，相比于对比例1所提供的全部以L-硫代脯氨酸进行修饰的金纳米颗粒LT，实施例1～5所提供的至少部分为Boc-L-硫代脯氨酸的修饰配体的金纳米颗粒对于E.coli、P.a、K.p、A.b的敏感株以及多药耐药株这些不同细菌的最小抑菌浓度都有明显的下降，而对比例2所提供的全部以Boc-L-硫代脯氨酸进行修饰的金纳米颗粒BLT的最小抑菌浓度比对比例1还高。
参考图2的(a)，是实施例2～4和对比例1～2的金纳米颗粒的示意图，该图中的BLT表示Boc-L-硫代脯氨酸，LT表示硫代脯氨酸，结合图1的形貌分析和表1的结果，表明对比例1的LT组由于高度自组装无法暴露活性位点，因而抗菌活性较低。随着配体中Boc-L-硫代脯氨酸含量的增加，由于Boc的保护，抑制了自组装，颗粒之间的分散程度变高，进而暴露出了较多的活性位点，其抗菌活性不断提高。然而，对于对比例2的BLT组由于活性集团氨基全部被Boc保护，无法暴露，因而抗菌活性相比于对比例1的LT组反而下降。
综合考虑，L-硫代脯氨和Boc-L-硫代脯氨酸的摩尔比为1:1时修饰的金纳米颗粒(LB11)较为分散，能够暴露较多的活性位点，具有最佳的抗菌效果。
3.抗菌机理验证
为了进一步探索金纳米颗粒的抗菌机制，将不同的多药耐药株与不同浓度的金纳米颗粒LB11在摇床上以260转每分钟的转速振荡4小时。随后将细菌离心后进行固定、脱水、再切成超薄切片，通过透射电子显微镜进行观察，结果如图3所示，标尺均为1μm。从图中可以看出，对照组(浓度为0)细菌菌体完整，而在浓度为8μg/mL和16μg/mL的LB11处理后，部分细菌出现内容物与细胞膜的分离，其它大部分都出现明显的菌体破坏或解体现象。
实施例6
本实施例提供一种敷料，该敷料包括基体和负载于基体的金纳米颗粒，基体为细菌纤维素膜(BC)，金纳米颗粒为实施例3的LB11。该敷料的制备方法如下：
(1)以10％的接种量接种葡糖木醋杆菌(Acetobacter xylinum，ATCC53582)，30℃条件下在培养基中(蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠6.8g/L和柠檬酸钠1.5g/L)培养，通过控制发酵时间获得不同厚度的细菌纤维素膜。将细菌纤维素膜在水中浸泡24小时，然后用1％的NaOH溶液煮沸处理2小时。再用纯水浸泡1周，每天更换纯水，4℃保存备用。
(2)将步骤(1)制备得到的BC纤维膜在真空干燥器中干燥24小时，将不同浓度的LB11加入96孔板中，加入干燥后的BC纤维膜浸泡，混匀后在4℃冰箱中静置48小时，获得负载LB的细菌纤维素复合膜。
由于伤口表面潮湿的环境，为细菌的繁殖提供了便利，与此同时外渗液体阻碍伤口的愈合。随着伤口敷料研究的进展，理想的功能性医用伤口敷料应满足有效覆盖整个创面、具有一定的弹性、吸收伤口的渗出液、隔绝受损皮肤与外界环境，防止伤口感染、促进伤口愈合。因此，在本方案中，采用细菌纤维素这一天然高聚物作为敷料的基材，利用其超细网状结构、高持水能力、高机械性能、高渗透性以及可降解性和低毒性等优点制备得到具有高抗菌活性的敷料。
参考图2的(b)，是本实施例所提供的细菌纤维素膜敷料(BC-LB11)的制备和抗菌原理的示意图，将制备好的BC纤维膜浸泡于LB11的分散液中，使得LB11负载到BC纤维膜上形成细菌纤维素膜敷料。在将细菌纤维素膜敷料敷于诸如皮肤等患处时，其中负载的LB11逐渐释放，通过破坏患处附近的细菌的菌体结构等方式起到抗菌杀菌的作用。以下通过具体实验加以说明。
纤维素膜对比实验
1.纤维素膜形态比较
分别取负载不同浓度LB11的BC纤维膜拍摄其宏观照片并通过扫描电子显微镜观察微观结构，其中，不负载LB11的BC纤维膜记为BC，LB11浓度为32μg/mL的BC纤维膜记为BC32，LB11浓度为64μg/mL的BC纤维膜记为BC64，以此类推。结果如图4所示，其中，电镜图的标尺均为1μm，电镜图的左下角为对应的BC纤维膜的宏观照片。从图中可以看出，负载后的纤维膜具有颗粒附着，随着浓度增加，附着颗粒明显增多。
2.纤维素膜的抗菌性能实验
以105CFU/mL在琼脂细菌培养板上分别接种100μL的E.coli、P.a、K.p、A.b的敏感株以及对应的多药耐药株并旋涂均匀，分别取BCP(负载2μg/mL的多粘菌素B)、BC、BC32、BC64，裁剪出直径6mm的圆形膜片贴于涂有细菌的培养板上静置10分钟，倒置放入37℃培养箱中，24小时后观察抑菌圈大小。结果如图5所示，各组的照片中不同膜片位置均与A.b组相同。从图中可以看出，E.coli、P.a、K.p、A.b以及对应的多药耐药株组中，相比于BC膜片，BC32、BC64都出现了更大更明显的抑菌圈，表明其抗菌性能有很大提升，与表1的检测结果相对应。
3.生物安全性实验
测试人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉成纤维细胞(HAF)在金纳米颗粒处理下的生长状态来评估其的体外细胞毒性。将LB11负载浓度不同的纤维膜(BC、BC128、BC256)与HUVEC或HAF接种在共聚焦培养板上，在37℃，5％CO2下培养24小时后，加入细胞染料，通过共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞密度，结果如图6所示，(a)为HUVEC细胞的染色结果，(b)为HAF细胞的染色结果，从图6中可以看出，无论是HUVEC还是HAF，对于不同负载浓度的BC纤维膜，钙黄绿素染色(Calcein)和赫斯特染色(Hochest)均出现明显的荧光，而PI染色则无明显红色荧光，表明BC纤维膜上负载的金纳米颗粒未对两种细胞产生细胞毒性作用。
4.动物模型实验
在SD大鼠背上构建直径为2.0厘米的圆形伤口，分别使用P.a和M P.a感染，并将感染大鼠分为四组，分别在伤口处敷以BC、BC32、BC64和纱布(对照组)，观察伤口的愈合进程。结果如图7所示，(a)为不同组的P.a感染大鼠的伤口愈合进程照片，(b)为不同组的M P.a感染大鼠的伤口愈合进程照片。从图中可以看出，手术3天后，无论是P.a还是MP.a感染的大鼠，负载LB11的纤维膜治疗的伤口大小均明显减小，并且负载浓度越高，治疗效果越好，在第14天基本完全愈合。该结果表明，LB11的掺入对抗多药耐药细菌伤口感染表现出有效的杀菌作用，能够更好的伤口愈合。
实施例7
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例1的区别在于，Boc-L-硫代脯氨酸替换为等摩尔量的Fmoc-L-硫代脯氨酸。抗菌活性检测结果发现该金纳米颗粒具有与LB41类似的对革兰氏阴性菌敏感株及对应的多药耐药株的抗菌活性。
实施例8
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例3的区别在于，Boc-L-硫代脯氨酸替换为等摩尔量的Pht-L-硫代脯氨酸。抗菌活性检测结果发现该金纳米颗粒具有与LB11相近的对革兰氏阴性菌敏感株及对应的多药耐药株的抗菌活性。
实施例9
本实施例提供一种金纳米颗粒，与实施例3的区别在于，Boc-L-硫代脯氨酸替换为等摩尔量的Dmb-L-硫代脯氨酸。抗菌活性检测结果发现该金纳米颗粒具有与LB11相近的对革兰氏阴性菌敏感株及对应的多药耐药株的抗菌活性。
实施例10
本实施例提供一种医疗器械，该医疗器械的表面涂覆有抗菌涂料形成的抗菌涂层，该抗菌涂料中包含实施例7～9中任一种金纳米颗粒。
综合上述实施例可以看到，本申请实施例提供一种成本低廉、合成便捷、生物安全性优良、针对多药耐药菌疗效好的小分子活化金纳米颗粒抗菌剂，并通过天然高聚物细菌纤维素负载用于治疗皮肤感染。其中，通过开发一步合成法来制备硫代脯氨酸以及带有氨基保护基团的共修饰金纳米颗粒作为纳米抗菌剂，提高了金纳米颗粒针对革兰氏阴性细菌的敏感株和临床分离的多药耐药株的抗菌活性。实施例中制备得到的金纳米颗粒通过破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，导致细菌死亡。另外，进一步通过天然高聚物细菌纤维素负载金纳米颗粒用于开发新型功能性抗菌敷料。细菌纤维素具有多孔的微观结构，高机械性能、高渗透性作为抗菌皮肤敷料在实现抗菌的同时能够促进伤口的愈合。通过皮肤伤口感染模型验证了抗菌纤维素膜具有治疗皮肤感染伤口的可行性。
与现有技术相比较，本申请实施例的有益效果在于：硫代脯氨酸及带保护基团的共修饰的金纳米颗粒合成方法便捷；Boc保护基团有效抑制了氨基酸导致的颗粒自组装，暴露出更大的活性位点，提高了金纳米颗粒针对革兰氏阴性菌的敏感株和多药耐药株抗菌性能；细菌纤维素具有较强的力学性能及高的孔隙率，能够隔绝污染物并吸水透气且具有较好的浸润性，能够与不同形状的伤口完美贴合，具有高稳定性、大规模生产的潜力和广泛的临床应用前景。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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