一种异恶唑类化合物作为粘度荧光探针的应用
阅读说明：本技术 一种异恶唑类化合物作为粘度荧光探针的应用 (Application of isoxazole compound as viscosity fluorescent probe ) 是由 王宇光 陈圆 刘贝 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一类检测细胞内粘度变化的荧光探针分子,该探针合成路径简便,以水为反应溶剂,减少了有机溶剂的使用,响应可持续发展理念,实现了溶剂的零排放。反应中巧妙地使用了TPGS-750-M在水中形成微胶束来解决有机化合物在水中的溶解性问题,充分利用了水的优秀理化性质,反应条件温和,反应高效。并且表面活性剂TPGS-750-M通过处理可以回收利用,完全符合环境友好的原则。该探针对粘度变化敏感,能实现溶液中粘度的检测,并且可以实现细胞内粘度检测与成像,在荧光生物标记领域也有潜在的应用价值。(The invention provides fluorescent probe molecules for detecting viscosity change in cells, the synthesis path of the probe is simple and convenient, water is used as a reaction solvent, the use of an organic solvent is reduced, the sustainable development concept is responded, and zero emission of the solvent is realized. In the reaction, TPGS-750-M is skillfully used to form micro-micelles in water so as to solve the problem of solubility of organic compounds in water, and the excellent physicochemical properties of water are fully utilized, so that the reaction condition is mild, and the reaction is efficient. And the surfactant TPGS-750-M can be recycled through treatment, and completely accords with the environment-friendly principle. The probe is sensitive to viscosity change, can realize detection of viscosity in a solution, can realize intracellular viscosity detection and imaging, and has potential application value in the field of fluorescence biomarker.)
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种在水相中合成的对粘度敏感的异恶唑类荧光探针及其在细胞内粘度检测中的生物应用。
背景技术
异恶唑是许多生物活性分子中常见的结构骨架。异恶唑的衍生物也具有广泛的生物活性，如神经毒素(A)、抗抑郁药样活性物质(B)、抗β-内酰胺酶抗生素(C)、和合成雄激素丹那唑(D)与抑制促性腺激素产生的组蛋白脱乙酰化酶(HADC)探针(E)。此外，异恶唑衍生物还可作为合成不同有机化合物的主要前体。
粘度作为影响生物过程的主要参数之一，很大程度上决定了物质的流动性以及扩散控制反应的反应速率。细胞内粘度异常是很多疾病细胞水平功能性障碍的重要指标，如常见的高血压、糖尿病以及阿兹海默症等等。荧光探针灵敏度高，特异性好，操作简单，因此粘度敏感的荧光探针可以作为测量细胞内粘度的重要工具。
基于技术现状，本发明拟提供一种异恶唑类对粘度敏感的荧光探针。该探针对粘度的变化敏感，随着粘度浓度的增加，探针的荧光强度增加，可以很好的应用于细胞内粘度的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异恶唑类化合物作为粘度荧光探针的应用。本发明的探针一对溶液的粘度变化敏感，随着溶液粘度的增大，探针的荧光强度显著增强；该探针对细胞基本无毒性，可用于活细胞中的粘度检测及成像。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了式(III)所示的异恶唑类化合物作为粘度荧光探针的应用，简称为探针一。
本发明尤其推荐上述式(III)所示的异恶唑类化合物作为粘度荧光探针在活细胞的黏度检测中的应用。
进一步，所述应用为：将所述活细胞置于含所述式(III)所示的异恶唑类化合物的培养基中孵育后，通过荧光检测比较黏度。
优选地，所述式(III)所示的异恶唑类化合物的培养基中式(III)所示的异恶唑类化合物的浓度为5μM。
进一步，所述孵育的条件为37℃，20min。
进一步优选所述荧光检测的条件为：采用共聚焦成像在410nm的激发波长下进行检测。
本发明中，所述式(III)所示的异恶唑类化合物按下述方法：
制备方法包括以下步骤：
S1：依次向反应瓶中加入N-氯代丁二酰亚胺(NCS)与式(I)所示的苯甲醛肟，之后向反应体系添加表面活性剂并将混合溶液在室温下搅拌1-4小时；
S2:依次向反应体系中加入一定量的碱与式(II)所示的4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应4-12小时。
S3：反应结束后，向反应瓶中加入乙酸乙酯，搅拌五分钟后分离并抽干有机相即得：
制备方法在上述技术方案的基础上，还可以做如下进一步的改进。
进一步，以式(II)所示的4-二甲基氨基苯乙炔为标准，NCS的用量为4- 二甲基氨基苯乙炔的1.8倍当量；
进一步，反应所用碱选自下列物质之一：Et3N、K2CO3、哌啶，以式(II) 所示的4-二甲基氨基苯乙炔为标准，优选为1.3当量的三乙胺；
进一步，反应所用的表面活性剂选自下列物质之一：SDS、TPGS-750-M、 TritonX-100，优选为2wt.％的TPGS-750-M。
将上述反应过程中的物质(II)换为物质(IV)即可制备出探针二(V)反应式如下：
本发明中所制备的异恶唑类荧光探针一对粘度变化敏感且细胞毒性小，可用于活细胞中的粘度检测。
本发明使用的表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Trition X-100)为市售产品，生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸(TPGS-750-M，水溶性维生素E)为自制，优选为2wt.％的TPGS-750-M；
进一步优选地，所述TPGS-750-M按如下方法制备：
(1)搅拌条件下，向生育酚和琥珀酸酐的甲苯溶液中加入三乙胺。随后继续搅拌。反应结束后，向反应混合物中加入水，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机层用1mol/L的盐酸和水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并在真空减压下除去溶剂，得到黄色液体，将其使用硅胶柱色谱法纯化。洗脱液经真空减压下除去溶剂后得到呈白色固体状的生育酚琥珀酸酯；
(2)将含有生育酚琥珀酸酯，聚乙二醇单甲醚-750和对甲苯磺酸的甲苯混合物使用迪安-斯达克榻分水器回流。反应结束后，冷却至室温，将混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，并用二氯甲烷萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空减压下除去溶剂后得到目标产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明所述的粘度探针一是一类检测细胞内粘度变化的荧光探针分子，该探针合成路径简便，以水为反应溶剂，减少了有机溶剂的使用，响应可持续发展理念，实现了溶剂的零排放。反应中巧妙地使用了TPGS-750-M在水中形成微胶束来解决有机化合物在水中的溶解性问题，充分利用了水的优秀理化性质，反应条件温和，反应高效。并且表面活性剂TPGS-750-M通过处理可以回收利用，完全符合环境友好的原则。该探针对粘度变化敏感，能实现溶液中粘度的检测，并且可以实现细胞内粘度检测与成像，在荧光生物标记领域也有潜在的应用价值。
附图说明
图1为粘度荧光探针一的核磁共振氢谱图；
图2为粘度荧光探针一的核磁共振碳谱图；
图3为粘度荧光探针二的核磁共振氢谱图；
图4为粘度荧光探针二的核磁共振碳谱图；
图5为粘度荧光探针一荧光强度与不同粘度PBS/甘油溶剂的荧光发射光谱图；
图6为最大吸收波长处的荧光强度的对数与粘度的对数的线性关系图，其中横坐标是粘度的对数，纵坐标是荧光强度的对数；
图7为粘度荧光探针一荧光强度与不同粘度PBS/甘油溶剂的荧光发射光谱图；
图8为粘度荧光探针一在PBS/甘油条件下，选择性结果的荧光发射光谱图。1-24分别为(1)空白；(2)Mn2+；(3)Ser；(4)Phe；(5)Arg；(6)Cys；(6)BSA；(7)H2S； (8)GSH；(9)Hcy；(10)CO3 2-；(11)OAc-；(12)NO3-；(13)HSO3 -；(14)PO4 3-；(15)Cl-； (16)Fe3+；(17)K+；(18)ClO-；(19)H2O2；(20)ONOO-；(21)Zn2+；(22)Cu2+；(23)Li+； (24)Glyceral；
图9为不同浓度粘度荧光探针一的细胞毒性研究；
图10为含有5μM探针一和不同粘度浓度的海拉细胞中粘度的共聚焦荧光图像：(a,d)分别载有5mM制霉菌素的海拉细胞的荧光图像，激发波长为410nm； (b,e)分别载有5mM制霉菌素的海拉细胞的明场。发射在450-500nm之间收集；(c,f)分别载有5mM制霉菌素的海拉细胞的混合通道。发射在450-500nm 之间收集。
图11为TPGS-750-M的1H NMR谱图；
图12为TPGS-750-M的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
本发明使用的表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚 (TritionX-100)为市售产品，生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸溶液(TPGS-750-M，水溶性维生素E)为自制，优选为2wt.％TPGS-750-M。
实施例中使用的表面活性剂TPGS-750-M为自制，制备方法如下：
第一步
第二步
第一步：向搅拌下的生育酚(4.3g，10mmol)和琥珀酸酐(1.5g，15mmol) 的甲苯(20mL)溶液中加入三乙胺(0.35mL，2.5mmol)。随后，在60℃下继续搅拌5h。反应结束后，向反应混合物中加入水(10mL)，然后用二氯甲烷 (3×10mL)萃取。合并的有机层用1mol/L的盐酸(3×50mL)和水(2×30 mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并真空浓缩，得到生育酚琥珀酸酯粗品，最后利用重结晶方法得到呈白色固体状的生育酚琥珀酸酯(5.25g，收率99％)。结晶条件为：结晶时间26小时，结晶温度4℃，正己烷/生育酚琥珀酸酯粗品的用量8mL/g。
第二步：将含有生育酚琥珀酸酯(2.97g，5.6mmol)，聚乙二醇单甲醚-750 (4g，5.33mmol)和对甲苯磺酸(0.15g，0.79mmol)的甲苯(20mL)混合物使用迪安-斯达克榻分水器回流5小时。反应结束后，冷却至室温，将混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，并用二氯甲烷(3×10mL)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠(3×50mL)，饱和氯化钠(2×30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空减压下除去溶剂后得到目标产物(6.6g，98％)，产率80％，淡黄色蜡状固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.27(m,2H),3.70-3.65(m,60H),3.55(m,2H), 3.38(s,3H),2.93(t,J＝7.2Hz,2H),2.79(t,J＝7.2Hz,2H),2.58(t,J＝6.8Hz,2H), 2.08(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),1.81-1.75(m,2H),1.52(m,3H),1.38(m,3H), 1.27-1.23(m,12H),1.14(s,3H),1.07(s,3H),0.87-0.84(m,12H)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ172.2,170.9,149.5,140.6,126.7,125.0,123.0,117.4,,75.1,72.0, 70.6,70.58-70.33(m,多个碳),69.1,64.0,59.0,39.4,37.55-37.29(m,多个碳), 32.79-32.69(m,4C),29.2,28.9,28.0,24.816,24.805,24.5,22.8,22.7,21.1,20.6, 19.77-19.61(m,多个碳),1 13.0,12.1,11.8.
实施例1：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在50mL的反应瓶中加入241mg(1.8mmol)NCS、182mg(1.5mmol)苯甲醛肟(式I)，然后将10mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时后，再依次加入182μL(1.3mmol)Et3N，145mg (0.1mmol)4-(N,N二甲基氨基)苯乙炔(II)，室温下反应8h后，向反应瓶中加入15mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相再加入15mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相中的TPGS-750-M用二氯甲烷萃取可得到分离回收(见实施例6)，合并两次得到的有机相，减压下悬蒸除去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯(v/v，下同)＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺260.9mg，白色固体，收率为96.5％。纯度98.7％。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.89(dd,J＝7.9,1.4Hz,2H),7.73(d,J＝8.9Hz, 2H),7.51-7.45(m,3H),6.78(d,J＝8.9Hz,2H),6.65(s,1H),3.06(s,6H)；13C NMR (126MHz,CDCl3)δ171.25,162.84,151.44,129.75,129.62,128.84,127.11,126.81, 111.87,94.66,40.21GC-MS(EI):m/z 264[M+].
实施例2：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时后，再依次加入7μL(0.05mmol)Et3N，14.5mg (0.1mmol)4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相中的TPGS-750-M用二氯甲烷萃取可得到分离回收(见实施例6)，合并两次得到的有机相，减压下悬蒸除去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺16.6mg，白色固体，收率为63％。
实施例3：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入21μL(0.15mmol)Et3N，14.5mg(0.1mmol)4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相中的TPGS-750-M用二氯甲烷萃取可得到分离回收(见实施例6)，合并两次得到的有机相，减压下悬蒸除去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III) 所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺24.5mg，白色固体，收率为93％。
实施例4：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时后，再依次加入28μL(0.2mmol)Et3N，14.5mg (0.1mmol)4-N’N二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相中的TPGS-750-M用二氯甲烷萃取可得到分离回收(见实施例6)，合并两次得到的有机相，减压下悬蒸除去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III) 所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺23.7mg，白色固体，收率为90％。
实施例5：探针3,5-二苯基异恶唑(V)的合成
在50mL的反应瓶中加入241mg(1.8mmol)NCS、182mg(1.5mmol)苯甲醛肟(I)，然后将10mL新配制的2wt.％的TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入168μL(1.2mmol)Et3N， 14.5mg(0.1mmol)4-N’N二甲基氨基苯乙炔(IV)，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入15mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相再加入15mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层有机相后，下层水相中的TPGS-750-M用二氯甲烷萃取可得到分离回收(见实施例6)，合并两次得到的有机相，减压下悬蒸除去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(V)所示的3,5-二苯基异恶唑214.6mg，白色固体，收率为97％。式(V) 的结构表征如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.86(dd,J＝17.0,7.9Hz,4H),7.53-7.43(m,6H), 6.84(s,1H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ170.44,163.01,130.26,130.05,129.15, 129.04,128.96,127.49,126.84,125.87,97.50；GC-MS(EI):m/z 221[M+].
实施例6：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在500mL的反应瓶中加入2.41g(18mmol)NCS、1.82g(15mmol)苯甲醛肟(I)，然后将100mL新配制的2wt.％的TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4.5小时。再依次加入1.82mL(13mmol)Et3N，1.45g (10mmol)苯乙炔(II)，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入50mL 乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，下层水相再加入50 mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，下层水相中的TPGS-750-M分别用50mL二氯甲烷萃取两次，合并二氯甲烷萃取液，减压蒸去二氯甲烷，回收得1.6g TPGS-750-M；合并两次得到的乙酸乙酯相，减压蒸去溶剂，固体残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5- 异恶唑基)苯胺2.564g，白色固体，收率为97％。HPLC检测纯度为98.8％。
实施例7：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入13.8mg(0.1mmol) K2CO3，14.5mg(0.1mmol)4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，合并两次得到的乙酸乙酯相，减压蒸去溶剂，残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺8.5mg，白色固体，收率为32％。
实施例8：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入10.2μL(0.1mmol)哌啶，14.5mg(0.1mmol)4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，合并两次得到的乙酸乙酯相，减压蒸去溶剂，残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺18.2mg，白色固体，收率为69％。
实施例9：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL新配制的2wt.％TPGS-750-M水溶液加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入14μL(0.1mmol)Et3N， 14.5mg(0.1mmol)4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，下层水相再加入2mL乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收取上层乙酸乙酯相后，合并两次得到的乙酸乙酯相，减压蒸去溶剂，残留物经柱层析分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，收集含目标产物的洗脱液，减压蒸去溶剂，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺24.8mg，白色固体，收率为94％。
实施例10：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL SDS(15mol％)加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌4小时。四小时后，再依次加入14μL(0.1mmol)Et3N，14.5mg(0.1mmol) 4-二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入3mL乙酸乙酯，搅拌5min后分离并抽干有机相，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3- 苯基-5-异恶唑基)苯胺14.5mg，白色固体，收率为55％。
实施例11：探针N,N-二甲基-4-(3-苯基-5-异恶唑基)苯胺(III)的合成
在5mL的反应瓶中加入24.1mg(0.18mmol)NCS、18.2mg(0.15mmol) 苯甲醛肟(式I)，然后将1mL TritonX-100加入瓶中，并将混合液在室温下搅拌 4小时。四小时后，再依次加入14μL(0.1mmol)Et3N，14.5mg(0.1mmol)4- 二甲基氨基苯乙炔，室温下反应8h。反应结束后，向反应瓶中加入3mL乙酸乙酯，搅拌5min后分离并抽干有机相，得到如式(III)所示的N,N-二甲基-4-(3- 苯基-5-异恶唑基)苯胺15.8mg，白色固体，收率为60％。
实施例12：探针一(III)对粘度的敏感性
(1)材料和方法
称取一定量探针一溶解在二甲亚砜中配置成5mM母液，实验中所有光谱测定均在磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中进行。
通过以不同比例混合PBS和甘油来制备粘度溶液。通过将探针一(5.0mM， 10.0μL)的储备溶液分别加入到不同比例混合的PBS-甘油溶液(10.0mL)中配制成探针一的最终浓度为5.0μM的不同粘度的PBS-甘油溶液。将这些溶液超声处理10分钟以消除气泡并使其在恒定温度下放置1h。然后，在410nm的激发下记录荧光光谱，激发和发射狭缝宽度设定在5nm。探针的荧光发射强度与溶剂的粘度之间的关系通过Forster-Hoffmann方程很好地表达如下：
lg(If)＝k lgη+c
其中If是荧光强度，η是溶液的粘度，k和c是常数。
(2)不同粘度的PBS-甘油缓冲液的配置
分别取甘油10、20、30、40、50、60、70、80、90、95mL于100mL的容量瓶内，然后沿着玻璃棒往容量瓶内缓慢加入PBS溶液，距离标线1厘米左右时改为用胶头滴管滴加，最后使液体的弯月面与标线正好相切，常温下(25℃) 静置1h后待用。
(3)探针一和探针二对粘度的敏感性
将探针一和探针二分别溶解于二甲亚砜中配置成5mM的母液。取探针一与探针二的10μL的上述母液分别加入到10mL不同粘度的PBS-甘油溶液中(实施例12，(2)所配置),常温下(25℃)静置30min后将其分别分为两份。其中一份使用粘度测定仪(上海平轩科技仪器有限公司，NDJ-8S)测定粘度，另外一份用于荧光检测。
加过探针一之后的PBS(0.01％DMSO,pH 7.4)-甘油溶液粘度分别为： 99.56cp、198.76cp、290.12cp、386.01cp、482.66cp、579.25cp、676.36cp、769.58cp、 863.95cp、954.52cp；另外一份分别加到96孔板内，在410nm的激发波长下进行荧光检测，由图5可知，随着体系粘度的增加，探针一的荧光强度逐渐增强，且在99.56cp到954.52cp粘度范围内，探针的荧光强度的对数与粘度的对数呈现良好的线性关系(附图6)，线性公式：y＝1.39347x-1.17522，线性关系数 R2＝0.99598。这说明探针一可以在甘油体系中对粘度有很好的响应关系。
加过探针二之后的PBS(0.01％DMSO,pH 7.4)-甘油溶液粘度分别为： 99.58cp、198.81cp、290.19cp、386.09cp、482.72cp、579.35cp、676.47cp、769.67cp、 864.01cp、954.59cp；在410nm的激发波长下进行荧光检测，其荧光强度如附图7，粘度和其对应的最大吸收波长处的荧光强度列于下表：
由上表和图7可知随着体系粘度的增加，探针二的荧光强度逐渐增强，但是与探针一相比，其荧光强度的增加幅度不够明显(从50.31增加到129.37)，即它在甘油体系中对粘度的响应关系不明显。而探针一的荧光强度的增加幅度非常明显(从38.15增加到965.46)且其最大吸收波长处的荧光强度对数与粘度的对数呈现良好的线性关系，它在甘油体系中对粘度有很好的响应关系。
实施例13：探针一的选择性研究
选取ROS类(活性氧簇)、RCS类(活性碳簇)、生物硫醇类中的常见物质及金属离子等作为选择性测试的被分析物，具体包括(1)Blank；(2)Mn2+；(3)Ser； (4)Phe；(5)Arg；(6)Cys；(6)BSA；(7)H2S；(8)GSH；(9)Hcy；(10)CO32-；(11)OAc-； (12)NO3-；(13)HSO3-；(14)PO43-；(15)Cl-；(16)Fe3+；(17)K+；(18)ClO-；(19)H2O2； (20)ONOO-；(21)Zn2+；(22)Cu2；(23)Li+；(24)Glyceral.将上述被分析物均配成50 mM的水溶液母液。分别向10mL、5μM探针一的PBS缓冲液(0.1％DMSO,pH 7.4)中加入10μL上述生物相关被分析物。常温下静置30min后进行荧光检测。结果为图8，由该图可知，在激发波长为410nm时，除了粘度引发了些许的荧光增强之外，其它物质基本没有引起明显的荧光光谱变化，证明了探针一在发射波长460nm处对粘度具有很好的专一性。
实施例14：探针一的细胞毒性研究
利用MTT法测试了探针一对海拉细胞的毒性。将海拉细胞培养在96孔细胞培养板上(1×104个细胞/孔)，在37℃细胞培养箱(含5％CO2)中孵化24h，培养基为带有10％胎牛血清和适量抗性(青霉素100U/ml和链霉素100ug/ml) 的高糖DMEM培养基。随后将探针一(0-50μM)加入其中并温育24h。将50μL MTT加入每个孔中，并将细胞在37℃，5％CO2下温育4h。然后除去培养基，并向每个孔中加入DMSO(150μL)，在410nm处检测吸收值。由图9可知，探针一对海拉细胞基本无毒性，适用于细胞中的粘度检测及成像。
实施例15：探针一的细胞成像
将海拉细胞培养在96孔细胞培养板上(1×104个细胞/孔)，在37℃细胞培养箱(含5％CO2)中孵化24h，培养基为带有10％胎牛血清高糖DMEM培养基。将上述海拉细胞分为实验组与对照组，向上述实验组细胞的培养液内加制霉菌素使其终浓度为5μM，并用该培养基继续孵育实验组细胞30min，对照组不做该处理。其后，上述实验组和对照组的海拉细胞培养基内分别加入探针一使培养基中探针一的最终浓度为5μM，用该培养基继续孵育20min。然后使用410nm的激发波长用共聚焦显微镜分别对上述细胞在共聚焦成像皿上进行细胞成像。结果表明，在制霉菌素不存在时细胞仅显示可忽略的荧光(图10a、c)。用5mM制霉菌素处理的细胞观察到明显的黄色荧光(图10d、f)。这些数据显示探针一能够使用荧光方法在活海拉细胞中实现粘度检测。