一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法
阅读说明：本技术 一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法 (Method for detecting exosome membrane protein based on telomerase amplification ) 是由 崔大祥 徐艳 徐颖湉 朱君 杨迪诚 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物检测领域,提供了一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法,以外泌体膜蛋白为靶标,以免疫磁珠捕获外泌体,设计带有识别序列的发夹结构探针,并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号,实现外泌体膜蛋白的可视化检测。本发明还包括该发夹结构探针及其应用。本发明的分离方法便捷,所用材料部分已商品化,生物安全性高。本发明的检测过程适合临床检测需求,不需借助专业仪器,反应仅需水浴锅进行,适应基层医疗检测需求,成本低廉、检测灵敏、特异性高且可视化,可以很好的对外泌体膜蛋白进行分析。(The invention belongs to the field of molecular biological detection, and provides a method for detecting exosome membrane protein based on telomerase amplification. The invention also comprises the hairpin structure probe and application thereof. The separation method is convenient and fast, the used materials are partially commercialized, and the biological safety is high. The detection process of the invention is suitable for clinical detection requirements, does not need to use professional instruments, only needs a water bath for reaction, meets the requirements of basic medical detection, has low cost, sensitive detection, high specificity and visualization, and can well analyze exosome membrane protein.)
技术领域
本发明属于分子生物检测领域，涉及一种外泌体膜蛋白含量的检测方法，具体涉及一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法。本发明以前列腺癌标志物miRNAs为靶标，设计与之互补的发夹结构识别探针，与靶标识别后暴露末端端粒酶识别引物，利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检的方法。
背景技术
液体活检技术可以对体液（如血液、血浆、血清、尿液和胃液）中的生物标志物进行检测，是一种新型的无创诊断技术。由于癌症的发生与发展的过程中会释放一系列癌症组分到血液当中，液体活检可以通过对这些癌症组分的分析，实现癌症的早期筛查、分子分型、预后、用药指导以及复发监测等临床应用。目前的临床研究中，液体活检技术主要应用于对游离循环肿瘤细胞（CTCs）检测、循环肿瘤DNA（ctDNA）检测、外泌体及循环RNA（Circulating RNA）检测等。
外泌体是一种直径约为30-150 nm活细胞分泌的膜性囊泡结构。外泌体主要来源于晚期核内体，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中。外泌体参与调控癌症发展，癌细胞增殖和迁移、新生血管生成、细胞死亡逃逸、侵袭和转移。外泌体表面富集了大量的肿瘤特异性蛋白，并且其内部富含丰富的核酸内含物，为判断癌症发展和转移提供了丰富的信息。因此，癌源相关外泌体已成为检测癌症进展的潜在生物标志物。
发明内容
针对现有检测的需求，本发明目的在于提供一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法。
本发明再一目的在于：提供一种带有识别序列的发夹结构探针。
本发明再一目的在于：提供上述带有识别序列的发夹结构探针的应用。
本发明的目的通过以下方案实现：一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法，以外泌体膜蛋白为靶标，以免疫磁珠捕获外泌体，设计带有识别序列的发夹结构探针，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，实现外泌体膜蛋白的可视化检测。
本发明提供了一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法，所述的基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法包括以下步骤：
（1）磁珠捕获外泌体：
包括磁珠包被外泌体膜蛋白抗体和捕获外泌体的步骤，羧基化磁珠活化后偶联外泌体膜蛋白抗体，然后与外泌体孵育，形成混合物I；
（2）发夹结构探针识别外泌体：
取单链识别序列与block(封闭)序列孵育，使探针序列形成发夹结构，然后与混合物I混合，洗涤、重悬，形成混合物II；
（3）端粒酶扩增：
在混合物II中加入含有端粒酶的模板和dNTPs，扩增端粒酶，洗涤、重悬获得混合物Ⅳ；
（4）检测：
在混合物Ⅳ加入显色试剂，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
ABTS是一种介体物质，也称为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)，2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，可以用来测定漆酶酶活力，可通过漆酶氧化ABTS的速率来决定漆酶酶活力的大小。其用途包括：游离氯的光谱试剂，酶联免疫吸附试验的显色底物，过氧化物酶的底物，用于ELISA 实验，该底物产生一种可溶性的显绿色的螯合物，等等。
较好的，所述的磁珠包被的外泌体膜蛋白抗体为CD63、CD81、CD9、ALIX、ANNEXIN、EpCAM、RAB5中的任意一种。
较好的，所述的发夹结构探针由两条单链DNA构成，其中识别单链序列从5，端到3，端主要包含外泌体膜蛋白aptamer、间隔序列和端粒酶识别引物序列；block序列从5，端到3，端主要包含端粒酶引物序列互补序列和外泌体膜蛋白核酸适配体部分互补序列，二者杂交后形成发夹结构识别探针。
较好的，所述的发夹结构探针中，识别单链序列从5’端到3’端主要包含外泌体膜蛋白核酸适配体、间隔序列和端粒酶识别引物序列，
单链识别序列选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO 9、SEQ ID NO 11中的任意一种；
block序列从5‘端到3’端包含端粒酶引物序列互补序列和外泌体膜蛋白核酸适配体部分互补序列，
block序列选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO 12中的任意一种；
单链识别序列和block序列以摩尔比1:1混合、孵育，杂交后形成发夹结构识别探针。
较好的，所述的端粒酶识别序列末端为TGTT或AGTT。
具体而言，本发明的方法包括以下步骤：
（1）磁珠捕获外泌体：
a）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min；活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用；
b）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1；
（2）发夹结构探针识别外泌体：取单链识别序列与block序列以摩尔比1:1 90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针，取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II；
（3）端粒酶扩增：100 μL步骤（2）得到的混合物II中加入20 μL端粒酶提取物和1mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr，反应完成后，采用磁分离去除上清，采用10 mMPBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋，得到混合物Ⅳ；
（4）检测：在步骤（3）得到的混合物Ⅳ加入Hemin，过氧化氢、（H2O2）及ABTS，混合均匀，根据靶标浓度的不同，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
较好的，所述aptmer识别外泌体膜蛋白为PSMA、HER-2、EpCAM、CD63、CD81、MUC1中的任一种。
本发明以外泌体膜蛋白为靶标，以免疫磁珠捕获外泌体，设计带有识别序列的发夹结构探针，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，实现外泌体膜蛋白的可视化检测。发夹结构探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列。端粒酶（telomerase）与识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列可以与血晶素结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，采用化学发光的方式对miRNAs含量进行高选择性、高灵敏度、简便快速的定量分析。
本发明还提供了一种带有识别序列的发夹结构探针，所述的发夹结构探针由两条单链DNA构成，一条单链探针包括识别膜蛋白的核酸适配体和端粒酶识别（引物）序列，另一条是block序列，与核酸适配体及端粒酶识别序列部分互补；
其中，识别单链序列从5，端到3，端包含外泌体膜蛋白核酸适配体、间隔序列和端粒酶识别引物序列；
block序列从5，端到3，端包含端粒酶引物序列互补序列和外泌体膜蛋白核酸适配体部分互补序列，二者杂交后形成发夹结构识别探针。
较好的，所述的单链识别序列和block序列的组合选自但不限于以下组合：
SEQ ID NO 1(DNA1)和SEQ ID NO 2(DNA2)；
SEQ ID NO 3(DNA3)和SEQ ID NO 4(DNA4)；
SEQ ID NO 5(DNA5)和SEQ ID NO 6(DNA6)；
EQ ID NO 7(DNA7)和SEQ ID NO 8(DNA8)；
SEQ ID NO 9(DNA9)和SEQ ID NO 10(DNA10)；
SEQ ID NO 11(DNA11)和SEQ ID NO 12(DNA12)。
本发明还提供了序列的发夹结构探针在制备外泌体膜蛋白可视化检测试剂中的应用。
为实现这样的目的，在本发明的技术方案中，首先羧基化磁珠活化后偶联外泌体膜蛋白抗体以快速捕获外泌体。设计发夹结构探针，该探针由两条单链DNA构成，一条单链单链探针包括识别膜蛋白的核酸适配体（aptamer）和端粒酶识别序列，另一条是block序列与aptamer及端粒酶识别序列部分互补。发夹结构探针在与外泌体膜蛋白充分结合后，打开探针的茎环结构，漏出3，端端粒酶识别引物。再加入端粒酶后，端粒酶与暴露的引物序列结合，在存在dNTP时，可以在引物末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列。进一步地，加入血晶素（hemin），形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，即可对外泌体膜蛋白的含量进行可视化测定。
本发明还提供了端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法的应用，所述的基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法用于外泌体膜蛋白可视化检测。
较好的，外泌体膜蛋白为靶标，以免疫磁珠捕获外泌体，设计带有识别序列的发夹结构探针，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，根据靶标浓度的不同，观测溶液颜色变化，获得外泌体膜蛋白的可视化检测结果。初步结果可以根据溶液颜色判断，使用肉眼即可获得定性结果。
作为本发明的一个优选实施例,可以以前列腺癌标志物PSMA为靶标，设计与之互补的发夹结构识别探针，与靶标识别后暴露末端端粒酶识别引物。利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检的方法。
本发明的优越性在于：
（1）本发明设计发夹结构探针，以识别靶标膜蛋白后露出的引发序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行外泌体膜蛋白可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。
（2）本发明的检测过程不需借助专业仪器，反应仅需水浴锅进行，适应基层医疗检测需求。
（3）本发明成本低廉、检测灵敏、特异性高且可视化。可以很好的对外泌体膜蛋白进行分析，适用于临床检测需求。
附图说明
附图1为实施例1测得外泌体膜蛋白PSMA含量的紫外吸收值。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。以下具体的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA1（100µM）与10 µL block序列DNA2（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。
在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变为深蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化，附图1为实施例1测得外泌体膜蛋白PSMA含量的紫外吸收值，由图1可知，该方法可对外泌体特定膜蛋白进行含量测定。
可见，本发明的方法成功的识别大量的外泌体膜蛋白，与对照的差异十分显著，通过观察溶液的颜色，即可获得定性结果。
实施例2
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA3（100µM）与10 µL block序列DNA4（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上诉混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例 3
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA5（100µM）与10 µL block序列DNA6（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上诉混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例4
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA7（100µM）与10 µL block序列DNA8（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例5
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA9（100µM）与10 µL block序列DNA10（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上诉混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例6
1、磁珠捕获外泌体
（1）磁珠包被外泌体膜蛋白抗体：10 mg羧基化磁珠经MES缓冲液（pH6.0）清洗后，溶于0.5 mL MES缓冲液（pH6.0），后加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与12 mg/ mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混合均匀后，室温活化30min。活化后的磁珠磁分离清洗，溶解于MES缓冲液（pH6.0），加入2mg/mL抗体充分混合均匀，4℃反应过夜，用含有0.1%Tween20 PBS（pH7.4）充分清洗，重悬于含有0.1%Tween20及0.1%BSA的 PBS（pH7.4）备用。
（2）捕获外泌体：采用超速离心法分离提取外泌体，50 µL 0.5 mg/mL磁珠与50µL外泌体充分混合，室温孵育1hr后，磁分离，充分清洗，沉淀物重悬于50 µL Tb缓冲液（22 mMTris-HCl，120 mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8），记为混合物1。
2、发夹结构探针识别外泌体：
取10 µL单链识别序列DNA11（100µM）与10 µL block序列DNA12（100µM）90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，发夹结构识别探针。取10 µL发夹结构识别探针与混合物I充分混合后，室温反应1hr，磁分离充分清洗后，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）洗涤三次，沉淀采用100 µL Te缓冲液重旋，记为混合物II。
3、端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上诉混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4、检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上诉混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。上述已描述了实施案例，应理解为本发明的优选实例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内做出变化和修改，不应受到上述实施案例的限制。
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种基于端粒酶扩增的外泌体膜蛋白检测方法
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<212>RNA
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