一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法
阅读说明：本技术 一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法 (Method for constructing colorectal cancer cisplatin resistant strain ) 是由 胡清云 刘彩云 许澎 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法,属于生物工程技术领域。本发明提供了一种新型的耐药株构建方法,将磁珠分选法与常规的耐药株筛选法结合,选用P-糖蛋白(P-gp)作为耐药靶点,用其编码基因ABCB1的抗体标记细胞,通过磁珠分选将具备耐药性的细胞群从亲本株中分离出来。该方法构建周期短、成功率高、构建菌株耐药性稳定。(The invention relates to a method for constructing a colorectal cancer cisplatin resistant strain, belonging to the technical field of biological engineering. The invention provides a novel drug-resistant strain construction method, which combines a magnetic bead sorting method with a conventional drug-resistant strain screening method, selects P-glycoprotein (P-gp) as a drug-resistant target, marks cells by using an antibody of a coding gene ABCB1 thereof, and separates a cell population with drug resistance from a parent strain through magnetic bead sorting. The method has the advantages of short construction period, high success rate and stable drug resistance of the constructed strain.)
技术领域
本发明涉及一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
目前耐药株的筛选主要有两种方法：浓度梯度递增法和高浓度冲击法。
浓度梯度递增法：通过MTT测定亲本细胞的IC50，选择1/10的IC50浓度作为起始浓度对细胞进行冲击，处理24h后恢复培养，同浓度冲击数次直到细胞可在该浓度中稳定生长后再逐步提高药物浓度重复上述步骤处理细胞，直到细胞的耐药指数达到目的值后终止冲击，培养细胞在维持浓度中正常生长且IC50值稳定。
高浓度冲击法：将细胞用高浓度的药物在梯度递增的短时间段内(例如1h、2h、3h、4h、5h)进行冲击，每冲击1次恢复培养至正常状态再进行冲击，待细胞可以在一定浓度的药物下正常生长且达到目的耐药指数时停止药物处理，更换含维持浓度药物的培养基正常培养。
但现有的耐药株筛选方法存在以下缺点：
(1)浓度梯度递增法诱导细胞产生耐药性的过程很长，通常需要6-8个月；
(2)构建耐药株细胞的主要目的是探索肿瘤细胞对临床化疗药物的耐药过程，来达到优化治疗的目的，但是梯度递增法的作用过程与临床上化疗药物的大剂量短疗程的基础原则存在差异；
(3)高浓度冲击法由于冲击细胞的药物浓度较高，对细胞状态的调整较困难，且细胞的耐药性不稳定。
化疗是治疗恶性肿瘤的方法之一，主要是通过化学药物来杀死肿瘤细胞，但是在化疗过程中，有些肿瘤细胞会产生耐药性，大大影响了肿瘤的治疗效果，因此探索肿瘤的耐药机制对于改善化疗效果，选择正确的化疗方法具有十分重要的意义。顺铂属于广谱化疗药物，常用于结直肠癌的治疗中。筛选结直肠癌细胞顺铂耐药株，可用于分析研究结肠癌细胞耐药的分子机制、病理机制，也可用于其他抗结肠癌药物筛选或靶标筛选，具有很高的研究应用价值和临床意义。
细胞在药物的作用下，自身理化特性会发生改变，细胞膜表面出现P-糖蛋白(P-gp)，使细胞逐渐产生耐药性。P-gp蛋白又叫多药耐药蛋白1(MDRP1)，由ABCB1编码，起到一个外排泵的作用，在ATP供能下，将进入细胞内的药物主动泵出到细胞外，从而减少药物对细胞的伤害。
本发明拟用低浓度的顺铂处理结直肠癌细胞，再用ABCB1抗体进行标记，通过磁珠分选的方法将ABCB1标记的细胞群分离出来，便可初步得到具有一定耐药指数的结直肠癌细胞。再在此基础上继续耐药株的筛选或维持培养，以期提高耐药细胞的筛选效率及稳定性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种结直肠癌顺铂耐药株的构建方法。本发明提供了一种新型的耐药株构建方法，将磁珠分选法与常规的耐药株筛选法结合；选用了P-糖蛋白(P-gp)作为耐药靶点，用其编码基因ABCB1的抗体标记细胞，通过磁珠分选将具备耐药性的细胞群从亲本株中分离出来。该方法构建周期段、成功率高、构建菌株耐药性稳定。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种顺铂耐药株的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)测定顺铂作用后的肿瘤细胞的IC50值，选择所述IC50值的0.8-1.2倍浓度的顺铂预处理肿瘤细胞；
(2)再以ABCB1抗体对顺铂预处理后的肿瘤细胞进行标记，将ABCB1标记的细胞群分离出来，即得顺铂耐药株。
进一步地，所述步骤(1)中，所述肿瘤细胞为人结直肠癌细胞。
进一步地，所述所述测定顺铂作用后的肿瘤细胞的IC50值利用MTT法进行，包括以下步骤：
1)用0.25％的胰酶消化对数期细胞，将细胞收集至离心管中，计数；
2)细胞铺板：取1块96孔板，按照实验分组，每组样品设置5个平行孔，每孔5000个细胞铺至96孔板中；
3)放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养24h后加药；
4)配置不同浓度梯度的顺铂，加入到96孔板中；
5)72h后，取出96孔板，每孔避光加入10μL MTT溶液，放入细胞培养箱孵育4h；
6)取出96孔板，小心弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO溶解紫色结晶；
7)490nm波长下测定MTT值；
8)用GraphPad处理数据并计算IC50，作为步骤(2)中顺铂的使用浓度。
进一步地，所述预处理肿瘤细胞具体是：将肿瘤细胞扩培10皿，加入顺铂处理24h，撤掉顺铂，更换正常培养基，培养24h后，按1：1传代；待细胞长至对数生长期，收集细胞。
进一步地，所述步骤(2)中，利用磁珠分选或流式分选分离ABCB1标记的细胞群。
更进一步地，所述利用磁珠分选分离ABCB1标记的细胞群，包括以下步骤：
1)取对数生长期的细胞用胰酶消化，收集到离心管中，并计数；
2)取1×108个细胞，300g离心10min，去掉上清；
3)用1mL buffer重悬，加入100μL PE-CD243 Antibody，混匀；
4)4℃避光孵育10min；
5)300g离心10min，去上清，加入1mL buffer清洗掉未标记的抗体；
6)300g离心10min，重复清洗1次；
7)弃上清，加入800μL buffer重悬细胞；
8)加入200μL Anti-PE磁珠，混匀，4℃孵育15min；
9)用1mL buffer清洗细胞两次，300g离心10min，弃上清；
10)加入500μL buffer重悬细胞；
11)将MACS分离器放在磁力架上，再将MS分选柱放入分离器中，将细胞悬液滴加过柱，此时CD243标记了的细胞会吸附在分选柱上，再用buffer冲洗3次去掉多余细胞，每次加入500μL；
12)将MS分选柱从分离器上取下，放入收集管中，加入1mL buffer，使用推进器将标记了CD243的细胞洗脱下来，收集管得到的就是CD243的阳性细胞，即ABCB1标记的细胞；
13)流式鉴定分选后的细胞。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的菌株。
进一步地，所述菌株为HCT116/DDP。
进一步地，所述菌株为HCT15/DDP。
进一步地，所述菌株为HCT8/DDP。
本发明的有益效果：
1、用本发明所述方法构建耐药株大大缩短了耐药株的周期，常规构建周期需要6-8个月，本发明所述方法构建耐药株2-3个月可以构建成功；
2、本发明所述方法构建耐药株成功率高，且与临床化疗原则不冲突；
3、本发明所述方法构建的耐药株耐药性稳定，在维持培养一段时间后耐药性不会回复，细胞状态也稳定。
附图说明
图1：MTT检测顺铂作用于HCT116细胞的IC50曲线图。
图2：MTT检测顺铂作用于HCT116/DDP细胞的IC50曲线图。
图3：MTT检测顺铂作用于HCT15细胞的IC50曲线图。
图4：MTT检测顺铂作用于HCT15/DDP细胞的IC50曲线图。
图5：MTT检测顺铂作用于HCT8细胞的IC50曲线图。
图6：MTT检测顺铂作用于HCT8/DDP细胞的IC50曲线图。
具体实施方式
(1)本发明中，除MTT法可以检测IC50之外，也可以用MTS、CCK8等试剂，一般根据细胞和药物特性来选用试剂，MTT法成本较低，无特殊要求一般选用MTT法。
(2)本发明中，磁珠分选全套用的美天旎，也可以选用其他品牌的磁珠分选试剂或仪器，也可以用流式分选来替代磁珠分选，原理都是抗原抗体的免疫结合。
(3)MTT法测定IC50
1)用0.25％的胰酶消化对数期细胞，将细胞收集至离心管中，计数。
2)细胞铺板：取1块96孔板，按照实验分组，每组样品设置5个平行孔，每孔5000个细胞铺至96孔板中。
3)放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养24h后加药。
4)配置不同浓度梯度的顺铂，加入到96孔板中。
5)72h后，取出96孔板，每孔避光加入10μL MTT溶液，放入细胞培养箱孵育4h。
6)取出96孔板，小心弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO溶解紫色结晶。
7)490nm波长下测定MTT值。
8)用GraphPad处理数据并计算IC50。
(4)MACS磁珠分选CD243(ABCB1)阳性细胞群
1)取对数生长期的细胞用胰酶消化，收集到离心管中，并计数。
2)取1×108个细胞，300g离心10min，去掉上清。
3)用1mL buffer重悬，加入100μL PE-CD243(ABCB1)Antibody，混匀。
4)4℃避光孵育10min。
5)300g离心10min，去上清，加入1mL buffer清洗掉未标记的抗体。
6)300g离心10min，重复清洗1次。
7)弃上清，加入800μL buffer重悬细胞。
8)加入200μL Anti-PE磁珠，混匀，4℃孵育15min。
9)用1mL buffer清洗细胞两次，300g离心10min，弃上清。
10)加入500μL buffer重悬细胞。
11)将MACS分离器放在磁力架上，再将MS分选柱放入分离器中，将细胞悬液滴加过柱，此时CD243标记了的细胞会吸附在分选柱上，再用buffer冲洗3次去掉多余细胞，每次加入500μL。
12)将MS分选柱从分离器上取下，放入收集管中，加入1mL buffer，使用推进器将标记了CD243的细胞洗脱下来。收集管得到的就是CD243的阳性细胞。
13)流式鉴定分选后的细胞。
实施例1：HCT116顺铂耐药株(HCT116/DDP)的构建
1、HCT116细胞的复苏
1)从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中快速摇晃融化，加入5mL DMEM完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％P/S)混匀。
2)1000rpm离心4min，弃上清，加1mL DMEM完全培养基，将细胞悬液加入10cm培养皿中，补加7mL培养基，放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养。
2、MTT法测定HCT116亲本细胞耐顺铂药物的IC50值为10.55μg/mL，因此选择10μg/mL顺铂来预处理细胞。
3、将细胞扩培10皿，加入10μg/mL顺铂处理24h，撤掉药物，更换正常培养基，培养24h后，按1：1传代。
4、待细胞长至对数生长期，收集细胞进行MACS磁珠分选。
5、分选出的CD243阳性细胞重新接种至培养皿中恢复培养。
6、细胞状态正常后测定HCT116/CD243+细胞的IC50为94.46μg/mL，耐药指数8.95，已经具备耐药株的特性，选择1/10IC50浓度约10μg/mL来维持培养细胞。
7、待HCT116/CD243+细胞在维持培养浓度中能够正常生长且传代5次后再测定。
传代5次后，细胞耐药指数依然稳定，HCT116顺铂耐药株(HCT116/DDP)构建成功。
表1：HCT116顺铂耐药株(HCT116/DDP)MTT结果
图1和图2为根据表1的数据计算出的细胞存活率得出的耐药曲线图，再根据耐药曲线的公式分别计算出HCT116和HCT116耐药株的IC50(半致死剂量)，两者比值就是耐药指数8.95。
实施例2：HCT15顺铂耐药株(HCT15/DDP)的构建
1、HCT15细胞的复苏
1)从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中快速摇晃融化，加入5mL DMEM完全培养基(90％1640+10％FBS+1％P/S)混匀。
2)1000rpm离心4min，弃上清,加1mL DMEM完全培养基，将细胞悬液加入10cm培养皿中，补加7mL培养基,放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养。
2、MTT法测定HCT15亲本细胞耐顺铂药物的IC50值为10μg/mL，因此选择10μg/mL顺铂来预处理细胞。
3、将细胞扩培10皿，加入10μg/mL顺铂处理24h，撤掉药物，更换正常培养基，培养24h后，按1：1传代。
4、待细胞长至对数生长期，收集细胞进行MACS磁珠分选。
5、分选出的CD243阳性细胞重新接种至培养皿中恢复培养。
6、细胞状态正常后测定HCT15/CD243+细胞的IC50为31μg/mL，耐药指数3.1，已经具备耐药株的特性，选择1/10IC50浓度约3μg/mL来维持培养细胞。
7、待HCT15/CD243+细胞在维持培养浓度中能够正常生长且传代5次后再测定。
传代5次后，细胞耐药指数依然稳定，HCT15顺铂耐药株(HCT15/DDP)构建成功。
表2：HCT15顺铂耐药株(HCT116/DDP)MTT结果
图3和图4为根据表2的数据计算出的细胞存活率得出的耐药曲线图，再根据耐药曲线的公式分别计算出HCT15和HCT15耐药株的IC50，两者比值就是耐药指数3.1。
实施例3：HCT8顺铂耐药株(HCT8/DDP)的构建
1、HCT8细胞的复苏
3)从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中快速摇晃融化，加入5mL DMEM完全培养基(90％1640+10％FBS+1％P/S)混匀。
4)1000rpm离心4min，弃上清，加1mL DMEM完全培养基，将细胞悬液加入10cm培养皿中，补加7mL培养基,放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养。
2、MTT法测定HCT8亲本细胞耐顺铂药物的IC50值为9.2μg/mL，因此选择10μg/mL顺铂来预处理细胞。
3、将细胞扩培10皿，加入10μg/mL顺铂处理24h，撤掉药物，更换正常培养基，培养24h后，按1：1传代。
4、待细胞长至对数生长期，收集细胞进行MACS磁珠分选。
5、分选出的CD243阳性细胞重新接种至培养皿中恢复培养。
6、细胞状态正常后测定HCT15/CD243+细胞的IC50为43.65μg/mL，耐药指数4.75，已经具备耐药株的特性，选择1/10IC50浓度约4μg/mL来维持培养细胞。
7、待HCT15/CD243+细胞在维持培养浓度中能够正常生长且传代5次后再测定。
传代5次后，细胞耐药指数依然稳定，HCT8顺铂耐药株(HCT8/DDP)构建成功。
表3：HCT8顺铂耐药株(HCT116/DDP)MTT结果
图5和图6就是根据表3的数据计算出的细胞存活率得出的耐药曲线图，再根据耐药曲线的公式分别计算出HCT8和HCT8/DDP耐药株的IC50，两者比值就是耐药指数4.75。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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