一种afb1诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法
阅读说明：本技术 一种afb1诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法 (AFB (active carbon boron)1Cell model establishing method for inducing chicken liver injury ) 是由 刘文超 郭艳 赵志辉 高振 赵越 邱盛坚 金永燕 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法,其步骤是：1)配制含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基,培养基中含有青霉素和链霉素；2)将黄曲霉毒素B-(1)溶解于二甲基亚砜溶液中,并用步骤1)中所述的培养基稀释,得到诱导液,诱导液中黄曲霉毒素B-(1)终浓度为0.05～0.25μg/mL,二甲基亚砜终浓度为0.01～0.025％；3)培养鸡肝癌细胞系至长势良好且状态稳定；4)当鸡肝癌细胞系生长至贴壁70～80％时,加入步骤2)中所述诱导液,诱导培养6～24h,即得。(The invention discloses a method for establishing a cell model of chicken liver injury, which comprises the following steps: 1) preparing a DMEM/F12 culture medium containing 10% fetal bovine serum at a final concentration, wherein the culture medium contains penicillin and streptomycin; 2) subjecting aflatoxin B 1 Dissolving in dimethyl sulfoxide solution, diluting with the culture medium in step 1) to obtain inducing solution containing aflatoxin B 1 The final concentration is 0.05-0.25 mug/mL, and the final concentration of dimethyl sulfoxide is 0.01-0.025%; 3) culturing the chicken liver cancer cell line until the growth vigor is good and the state is stable; 4) and (3) when the chicken liver cancer cell line grows to 70-80% of the adherent wall, adding the induction liquid in the step 2), and performing induction culture for 6-24 hours to obtain the chicken liver cancer cell line.)
技术领域
本发明属于细胞模型建立领域，尤其涉及一种黄曲霉毒素B1 (AFB1)诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法。
背景技术
据联合国粮农组织(FAO)调查表明，全世界约25％以上的谷物受到霉菌毒素(Mycotoxins)的污染，其中，以黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF)的污染最为严重。据中国饲料原料调查研究表明，我国玉米中 AF的污染比例高达84％。AF是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，目前已发现的AF约20种，其中，AFB1因毒性最强、危害最大、分布最广而被列入一级致癌物。同时，AFB1也是最有潜力的细胞毒性物质，它进入机体产生活性氧簇(ROS)从而引起氧化应激反应，造成慢性或急性中毒，最终导致器官损伤。据报道，AFB1对动物具有肝毒性、遗传毒性和免疫毒性作用，其中，家禽对AFB1高度易感。用AFB1污染的饲料饲喂家禽会导致急性肝损伤、生产性能下降和抗病能力降低，甚至死亡，给养禽业带来巨大的经济损失。
作为动物的解毒器官，肝脏是AFB1作用的主要靶器官。虽然动物本身对AFB1具有一定的解毒代谢能力，但幼龄动物器官发育不完全，长时间的摄入AFB1会刺激肝细胞产生大量ROS和促进肝细胞凋亡，从而影响幼龄动物肝脏的发育和正常功能，严重危害动物健康生产。
细胞是体外试验和分子机制研究的重要模型，对寻找防治AFB1诱导鸡肝脏损伤的作用靶点具有重要作用。目前常被用来构建肝细胞损伤模型的细胞多为鸡的原代肝细胞，然而鸡的原代肝细胞在应用过程中存在分离培养过程复杂，细胞状态不稳定等缺点。现有技术中缺乏一种操作简便且效果稳定的AFB1诱导的鸡肝细胞损伤模型，严重制约了AFB1诱导鸡肝脏损伤的体外分子机制研究和防治药物筛选。鸡肝癌细胞系(LMH)是由一位日本学者在1981年所建立，生长特性为贴壁，形态特性为上皮细胞样。LMH生长较为迅速且易于培养，存活率高，活性好。因此，本发明以LMH为模型细胞，通过观察不同质量浓度的AFB1对LMH的存活率和凋亡比例的作用，评估AFB1诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法，可为进一步研究AFB1诱导鸡肝细胞损伤的作用机制奠定基础，也为生产中防治AFB1对鸡肝脏损伤研究提供体外试验模型。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明是一种AFB1诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法，旨在构建操作简单且效果稳定的鸡肝细胞损伤模型，为AFB1诱导鸡肝脏损伤的防治研究提供试验模型。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法，其步骤是：1)配制完全培养基；2)将AFB1溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并用完全培养基稀释，得到诱导液； 3)培养鸡肝癌细胞系；4)将诱导液加入培养好的鸡肝癌细胞系中，即得。
优选的，完全培养基为含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12 培养基。
优选的，诱导液中所述AFB1的终浓度为0.05-0.25μg/mL。
优选的，将诱导液加入培养好的鸡肝癌细胞系的条件为，当细胞系贴壁为70～80％加入诱导液。
优选的，将诱导液加入培养好的鸡肝癌细胞系中，诱导培养时间为6～24h。
一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法，其步骤是：1)配制含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养基中含有青霉素和链霉素；2)将AFB1溶解于DMSO中，并用步骤1)中所述的培养基稀释，得到诱导液，诱导液中AFB1终浓度为0.05-0.25μg/mL， DMSO终浓度为0.01～0.025％；3)培养鸡肝癌细胞系至长势良好且状态稳定；4)当鸡肝癌细胞系细胞生长至贴壁70～80％时，加入步骤 2)中所述诱导液，诱导培养6～24h，即得。
一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法，其步骤是：1)配制含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养基中含有青霉素和链霉素；2)将AFB1溶解于DMSO中，并用步骤1)中所述的培养基稀释，得到诱导液，诱导液中AFB1终浓度为0.1μg/mL，DMSO 终浓度为0.01％；3)培养鸡肝癌细胞系至长势良好且状态稳定；4) 当鸡肝癌细胞系细胞生长至贴壁70～80％时，加入步骤2)中所述诱导液，诱导培养12h，即得。
本发明的有益效果是，确定了构建AFB1诱导鸡肝脏损伤的细胞模型的最适浓度及作用时间，通过建立这个细胞损伤模型，为进一步深入研究AFB1诱导鸡肝脏损伤的作用机制及新型药物的应用提供简便且稳定的肝细胞损伤模型，对降低养殖业的经济损失具有重要意义。
附图说明
图1是不同浓度AFB1刺激12h对LMH生长状态的影响。其中图1A的AFB1浓度为0，但含0.02％DMSO；图1B的AFB1浓度为0；图1C的AFB1浓度为0.05μg/mL；图1D的AFB1浓度为0.1μg/mL；图1E的AFB1浓度为0.15μg/mL；图1F的AFB1浓度为0.2μg/mL。
图2是AFB1刺激12h对LMH细胞存活率的影响。与对照组相比， *P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图3是AFB1刺激12h对LMH细胞凋亡率的影响。与对照组相比， *P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图4是AFB1对LMH细胞凋亡率的影响(流式细胞图)。其中图4A的AFB1浓度为0，含0.02％DMSO；图4B的AFB1浓度为0；图4C的AFB1浓度为0.05μg/mL；图4D的AFB1浓度为0.1μg/mL；图4E的AFB1浓度为0.15μg/mL；图4F的AFB1浓度为0.15μg/mL。
图5是AFB1刺激12h对LMH细胞培养液中肝功能指标的影响。与对照组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、实施方案及优势更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。以下所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。
材料和方法
1.主要材料
鸡肝癌细胞系(LMH)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、二甲基亚砜 (DMSO)、双抗完全培养液50mL：44.5mL DMEM/F12培养基+5mL 胎牛血清FBS+0.5mL双抗(青霉素和链霉素)、pH 7.2的DPBS、0.25％ Trypsin-EDTA、0.25％Trypsin、Cell Counting Kit-8、Annexin V-FITC/PIApoptosis Detection Kit。
其中DMEM/F12基础培养基、双抗、澳洲胎牛血清、0.25％ Trypsin-EDTA、0.25％Trypsin均购自Gibco；DPBS购自Hyclone； Cell Counting Kit-8、谷草转氨酶(AST)测试盒、谷丙转氨酶(ALT) 测试盒、丙二醛(MDA)测试盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；AFB1、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
2.主要仪器
5％CO2培养箱、倒置荧光显微镜、水浴锅、超净台、普通移液器、Synergy HTX型多功能酶标仪等。其中，Synergy HTX型多功能酶标仪购自BioTek Instruments,Inc.,USA。
实施例1
鸡肝脏损伤的细胞模型的建立：
(1)完全培养液配制方法如下(50mL体系)：44.5mL DMEM/F12 培养基+5mL胎牛血清FBS+0.5mL双抗(青霉素和链霉素)。
(2)将AFB1溶解于DMSO中，再用完全培养基稀释，得到AFB1终浓度为0.05-0.25μg/mL，DMSO终浓度为0.01～0.025％的培养液，即诱导液。
(3)培养鸡LMH，获取长势良好且状态稳定的细胞用于后续试验。
(4)取所述细胞接种于细胞培养板，保持每个孔细胞量一致，细胞贴壁后约占孔底的70-80％，往培养孔中加入不同浓度诱导液培养 6～24h。
实施例2
细胞存活率检测：
用CCK-8法检测每组的细胞存活率，以第1组为对照组，对其他 6个试验组进行统计学分析。找出细胞存活率较对照组开始显著降低的最低AFB1浓度所在试验组及适宜作用时间段。细胞存活率计算公式为：
结果如下表所示：
表1.LMH相对细胞存活率的影响(％)
注：不同肩标字母表示差异显著，P<0.05。
实施例3
按用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果如下表所示：
注：不同肩标字母表示差异显著，P<0.05。
实施例4
用AST和ALT测试盒检测培养液中酶活力，结果如下：
表3.LMH细胞肝功能指标的影响
注：不同肩标字母表示差异显著，P<0.05。
实施例5
用超声破碎仪处理5-10min使细胞破碎，超声时间2s，间隙时间3s，功率 50％。用MDA测试盒检测细胞中MDA含量：
表4.LMH细胞MDA含量的影响
注：不同肩标字母表示差异显著，P<0.05。
结果表明，通过一系列试验确定了AFB1可以明确地作用于LMH。通过建立这个细胞损伤模型，为进一步深入研究AFB1诱导鸡肝脏损伤的作用机制及新型药物的应用提供简便且稳定的肝细胞模型，对降低养殖业的经济损失具有重要意义。
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