一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法
阅读说明：本技术 一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法 (Method for sorting circulating tumor cells by combining optomechanical force with particles ) 是由 刘威 陈贝 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法,属于生物医药技术领域。本发明方法为将功能化微粒与含CTCs和白细胞(WBCs)的样本孵育,通过光力将结合功能化微粒的CTCs与白细胞分离,达到分选循环肿瘤细胞的目的；所述的功能化微粒为修饰有靶向CTCs的特异性分子的微粒。本发明通过CTCs与功能化微粒结合使其折射率显著增大、与白细胞有明显差异,在光力下将CTCs与白细胞分离。本发明可高效地捕获和识别CTCs,在捕获CTCs的同时快速的识别CTCs；本发明利用光力,从白细胞中无接触、无损的分离CTCs,保证了分选细胞的纯度和细胞的活性。(The invention discloses a method for sorting circulating tumor cells by combining optomechanical force with particles, and belongs to the technical field of biological medicines. The method comprises the steps of incubating functionalized particles and samples containing CTCs and White Blood Cells (WBCs), and separating the CTCs and the white blood cells combined with the functionalized particles by light force to achieve the purpose of sorting circulating tumor cells; the functionalized particles are modified with specific molecules targeting CTCs. According to the invention, the CTCs are combined with the functionalized particles, so that the refractive index of the CTCs is obviously increased, the CTCs are obviously different from leukocytes, and the CTCs are separated from the leukocytes under the action of light. The invention can efficiently capture and identify the CTCs, and can rapidly identify the CTCs while capturing the CTCs; the invention utilizes the light force to separate CTCs from leukocytes in a non-contact and non-destructive manner, thereby ensuring the purity of sorted cells and the activity of the cells.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，随着外周血扩散到人体其他组织部位，造成肿瘤的扩散和增殖。因此，CTCs被认为是肿瘤转移的种子，是造成癌症病人死亡的重要原因。CTC作为液体活检的重要手段之一，可以通过检测CTC在外周血中的数量变化，实现对肿瘤的动态检测、治疗效果评估和个性化治疗。
携带着癌症病人基因信息的CTCs在血液中数量稀少(每毫升血液中约1-10个)，因此从血液中高效的分离CTCs是非常困难的。现在开发的分离CTCs的方法大都是基于CTCs的性质(尺寸、密度、介电常数等)，然而因为CTCs和白细胞在这些方面具有很多重叠的性质，所以在分离CTCs的同时，经常会收集到白细胞，这就导致了分选CTCs的纯度降低。近年来，许多纳米颗粒和纳米结构被开发用来分选CTCs，尽管得到了不错的分选效率，但是由于纳米颗粒和纳米结构对白细胞存在明显的非特异性吸附的问题，所以纳米尺度上的细胞分选纯度仍然是不理想的。因此，高效和高纯度的分离CTCs是现在急需克服的问题。
光力作为识别和分离微量物质的有效手段，可以实现对细胞的非接触、无损伤的精准操纵。因此，光力在细胞分选上有巨大的应用潜力。然而，CTCs和白细胞具有相似的光学常数，因此，通过光力精准的分离和快速识别CTCs和白细胞仍然是个挑战。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法，为将功能化微粒与含CTCs和白细胞(WBCs)的样本孵育，通过光力将结合功能化微粒的CTCs与白细胞分离，达到分选循环肿瘤细胞的目的。所述的功能化微粒为修饰有靶向CTCs的特异性分子的微粒。该方法原理：由于功能化微粒表面修饰了靶向CTC的特异性分子，可与样本中的CTCs发生特异性结合。结合功能化微粒的CTCs的光学常数(折射率)显著增大，达到与白细胞的折射率有明显差异的目的。在激光照射下，结合功能化微粒的CTC受到的光力明显大于白细胞，结合功能化微粒的CTC朝着远离激光的位置运动进而与白细胞分离。
所述的靶向CTCs的特异性分子为能特异性识别和结合CTCs表面的生物标记物，所述的CTCs表面的生物标记物包括上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、前列腺特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45、CD146。优选的，所述的靶向CTCs的特异性分子为能特异性识别和结合CTCs表面的生物标记物的抗体，所述的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、前列腺特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45、anti-CD146。
优选的，所述的微粒为折射率大于1.4的粒子，微粒的粒径为4～8μm；所述的微粒表面修饰有活性基团，所述的活性基团包括羧基、氨基或巯基等基团。所述的微粒可为不同波段光的荧光微粒，可通过荧光粒子结合循环肿瘤细胞实现识别CTCs的目的。
优选的，所述的功能化微粒，即修饰有靶向CTCs的特异性分子的微粒，通过包括以下步骤的方法制备：首先活化微粒表面修饰的活性基团，然后微粒与链酶亲和素(streptavidin，简称SA)结合，再通过SA与biotin的特异性结合方式在SA的基础上修饰生物素化的靶向CTCs的特异性分子。
优选的，所述的含CTCs和白细胞的样本通过包括如下步骤的方法得到：获取癌症病人的血液样本，经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层，即得到含CTCs和白细胞的样本。进一步地，所述的临床癌症病人为术后转移和复发程度高的晚期癌症病人；所述癌症包括结肠癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等，优选获取术后或化疗后的癌症病人的血液样本。
优选的，所述的光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法在微流控芯片中进行，其原理示意图如图1所示。在流体作用下，结合功能化微粒的CTC和白细胞沿着不同的路径移动，实现CTC与白细胞分离的目的。更为优选的，所述的光力结合微粒分选循环肿瘤细胞的方法包括如下步骤：(1)将功能化微粒与加到含CTCs和白细胞的样本中，孵育使功能化微粒与含CTCs特异性结合。(2)将步骤(1)得到的混合样通入微流控芯片中，打开激光，分离出结合功能化微粒的CTCs。所述的孵育的条件优选为37℃孵育2h。其中，所述的激光由激光器产生，激光器耦合光纤到微流控通道。
所述的微粒为荧光微粒时，通过上述方法分离的CTC结合有荧光微粒，而白细胞没有荧光，能够实现对CTC的快速鉴别。基于此，本发明还提供上述方法在分离和识别CTCs中的应用。
本发明还提供上述方法中所用到的功能化微粒在制备识别、捕获或富集CTCs的试剂盒中的应用。
一种光力结合微粒分选目标细胞的方法，为将功能化微粒与含目标细胞和干扰细胞的样本孵育，通过光力将结合功能化微粒的目标细胞与干扰细胞分离，达到分选目标细胞的目的。所述的功能化微粒为修饰有靶向目标细胞的特异性分子的微粒。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种高效捕获和识别CTCs的方式，其有望在癌症转移的预警和预防领域发挥重要作用。
(2)修饰有靶向CTCs的特异性分子的荧光微粒，可以在捕获CTCs的同时快速的识别CTCs。
(3)修饰有靶向CTCs的特异性分子的荧光微粒结合CTC后，可以利用光力，从白细胞中无接触、无损的分离CTCs，保证了分选细胞的纯度和细胞的活性。
附图说明
图1是光力结合荧光微粒分离和识别CTCs原理图。
图2是荧光PS微粒靶向MCF-7细胞的SEM图。
图3是荧光PS微粒捕获表达Epcam的MCF-7和不表达Epcam的Hela细胞的荧光图。
图4是PS-CTCs在微流控通道中的位移图。
图5是实施例3结果图。(a)PS-CTC的回收效率与流速的关系，(b)PS-CTC的收集纯度与流速的关系，(c)收集的PS-CTC的细胞活性，(d)收集的PS-CTC的细胞活性的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：PS微粒修饰抗体用于捕获CTCs
取200μL(10mg/mL)的表面带有羧基的橙色荧光PS球(购自天津贝乐思，粒径5微米，折射率约为1.6)，10000rpm离心10分钟。然后用MES溶液彻底清洗PS球，然后在200μLEDC/NHS溶液(4mg/mL EDC和6mg/mL NHS在0.1M MES溶液中)中浸泡30min。离心后，与50μg/mL的SA溶液混合，4度10h。接着用PBS洗涤3次，与20μg/mL生物素化抗EpCAM抗体室温孵育2h。离心洗涤后，与1mL的MCF-7(105)细胞共同孵育2h。然后用2.5％戊二醛固定。样品经15％、30％、50％、70％、80％、90％、100％酒精浓度脱水，超临界二氧化碳干燥。通过扫描电子显微镜观察，结果如图2，癌细胞表面附有PS球，说明PS球修饰抗体成功靶向目的细胞。
修饰完抗体的PS球捕获不同的细胞(MCF-7细胞和Hela细胞)，然后DAPI染色细胞，荧光显微镜下观察捕获的情况，结果如图3。阳性表达EpCAM的MCF-7细胞表面附有很多微球，而阴性表达EpCAM的Hela细胞表面没有微球，这说明修饰的PS球具有特异性靶向的能力。MCF-7细胞表面显示出橙色荧光，Hela细胞表面没有荧光，这显示出可以通过荧光鉴定细胞。
实施例2：微流控系统分选PS-CTCs
微流控分选系统由两个主要组件组成，微流控器件和光学分选系统(1064纳米激光器耦合的光纤)。微流控器件由PDMS制成，使用标准软光刻技术制造，其结构如图1所示；通道的整体高度为100微米，宽度为150微米，样品入口宽度为75微米，另外2个PBS入口为50微米，靶向细胞出口的宽度为50微米，背景细胞的出口的宽度为100微米。样品和PBS液流由玻璃注射器输送到通道中，流速为30μL/h，注射器由注射泵驱动。接着使用光学分选系统，打开激光，激光器耦合的光纤的功率为1W，显微镜下观察分选过程。光学分选系统由激光器和光纤组成，1064nm红外激光由固态激光器产生；光由激光器耦合光纤到微流控通道。
按照上述操作，将实施例1中PS球捕获的CTC(MCF-7)流入微流控系统，打开链接光纤的激光器，测得光纤的功率为1W，观察激光作用的PS-CTC在微通道内的移动，结果如图4。细胞的在沟道内的移动状态，随着时间的增加，PS-CTC在光力的作用下，沿着远离光纤的方向运动，同时受到注射泵的推力，PS-CTC在微流控通道的上端运动。
实施例3：
(1)流速与CTC回收效率间的关系：将10000个乳腺癌细胞(MCF-7)加入300μL的DMEM中，其中含有实施例1中PS球修饰抗体(4mg/mL)，37度孵育2小时，并设置不同的流速通过实施例2中的微流控分选系统收集；收集的细胞显微镜下计数，回收效率＝收集的细胞/投入的细胞×100％。结果如图5a所示，随着流速的增加，回收效率逐渐减少。
(2)流速与CTC回收纯度间的关系：将10000个乳腺癌细胞(MCF-7)加入300μL的DMEM中，其中含有实施例1中PS球修饰抗体(4mg/mL)，37度孵育2小时，接着加入105个FDA染色的白细胞，将混合样品按照不同的流速通过实施例2中的微流控分选系统收集，收集的细胞显微镜下计数，回收纯度＝PS-CTC细胞的数量/(PS-CTC细胞的数量+白细胞的数量)×100％。结果如图5b所示，随着流速的增加，回收的CTC细胞纯度逐渐减少。
(3)使用碘化丙啶PI和二乙酸荧光素FDA评估细胞活力。PI是一种红色荧光核酸染料，染色死细胞，而FDA是一种绿色荧光核酸染料，染色活细胞。PI和FDA溶液5μg/mL，用于细胞的活性测试。为了测试细胞活力，将10000个乳腺癌细胞(MCF-7)加入300μL的DMEM中，其中含有实施例1中PS球修饰抗体(4mg/mL)，37度孵育2小时，并通过实施例2中的微流控分选系统设置100μL/h的流速收集；新鲜传代的MCF-7细胞作为对照组。活细胞和死细胞分别用PI和FDA染色，随后在荧光显微镜下计数。结果如图5c和5d所示，PS-CTC的细胞活性约为95％，说明整个微流控分离系统不影响细胞的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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