一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法
阅读说明：本技术 一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法 (Method for improving blood circulation tumor cell capture ) 是由 鲍伟胜 鲍岳洋 王春雷 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法,包括如下步骤：S1、将待检测血液通过膜芯片的过滤,将CTC留在膜上；S2、加入荧光标记的rVAR2/anti-CD45荧光抗体/DAPI到膜上；S3、荧光显微镜CTC计数。本发明应用rVAR2荧光染色俘获后的CTC,俘获/识别CTC不依赖于CTC表面表达单一蛋白,尽可能的把上皮细胞来源的CTC和间质细胞性质的CTC一起俘获；这样提高了俘获的效率和准确性,而且俘获方法经济、简便。(The invention discloses a method for improving blood circulation tumor cell capture, which comprises the following steps: s1, filtering the blood to be detected through a membrane chip, and keeping CTC on the membrane; s2, adding fluorescent-labeled rVAR2/anti-CD45 fluorescent antibody/DAPI to the membrane; s3, fluorescence microscopy CTC count. According to the invention, the captured CTC is stained by rVAR2 fluorescence, the CTC is captured/identified without depending on the single protein expressed on the surface of the CTC, and the CTC from epithelial cells and the CTC with the characteristics of mesenchymal cells are captured together as far as possible; thus, the efficiency and accuracy of the capture are improved, and the capture method is economical and simple.)
技术领域
本发明涉及一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法。
背景技术
CTC是指进入到血液循环中的肿瘤细胞。CTC检查是测定血液中流动癌细胞的一种检查。通过CTC检查能够识别出影像检查无法发现的超早期微小癌，临床上能够比以往传统的诊断方法更早的发现肿瘤，能得知超早期的原发癌发病率，以及超早期的癌症转移或复发。肺癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤患者CTC是血中观察肿瘤预后治疗效果的重要生物标记物。肿瘤病人血中CTC数目越多，病人的预后越差。
目前，CTC的俘获技术基于原理有两大类-物理方法和化学方法。化学方法比较代表的是美国FDA唯一批准的CTC俘获技术。技术核心原理是利用抗原-抗体的结合来俘获肿瘤细胞。基于抗原和抗体的化学方法有些缺点：a)抗原与抗体的结合容易致CTC的凋亡，使得俘获的CTC数目减少。这点已经被大量的研究证实；b)不能俘获EMT细胞-即从上皮到间质转化的细胞，这类细胞不表达传统的上皮细胞表面抗原标记物，所以不被抗体识别和俘获。这类细胞恶性度最大，是肿瘤转移的元凶。
物理方法是根据细胞的形态大小和密度的不同。根据形态大小的不同是主要的方法。这类方法简便，不易致CTC的凋亡，也能俘获EMT细胞。基于肿瘤细胞大小技术的CTC俘获后，需要对俘获的肿瘤细胞进行识别和计数，富集的肿瘤细胞用荧光抗体来鉴定。CTC被荧光确定为CK+、CD45-和DAPI+，这也是当前对CTC荧光诊断的金标准。但CK在生长过程中也呈现表达下调，甚至消失。同时，癌症干细胞也缺乏CK的表达。因此，捕获CTC时以CK检测将丢失某些特定的CTCs，使检测的细胞数目减少。
针对EMT细胞，荧光抗体鸡尾酒中可以用vimentin的荧光抗体。但多抗体的应该一方面增加检测的成本和检测的复杂性，另一方面又增加了非特异性结合的白细胞。同时，EMT细胞不是所有肿瘤患者血液中都会存在的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中血液中CTC检测的数目不准确的缺陷，提供一种利用ofCS(癌胚硫酸软骨素)特异性的表达在几乎所有的肿瘤细胞的表面和VAR2特异性与ofCS结合的特点，用rVAR2来荧光俘获CTC,提高CTC检测的数目和灵敏度。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法，包括如下步骤：
S1、将待检测血液通过膜芯片的过滤，将CTC留在膜上；
S2、加入荧光标记的rVAR2/anti-CD45荧光抗体/DAPI到膜上；
S3、荧光显微镜CTC计数。
进一步的，将rVAR2包裹在磁珠的表面做成rVAR2磁珠来俘获和富集血中的CTC，再用Pan-CK或者EpCAM荧光抗体来识别CTC。
重组VAR2蛋白(rVAR2)的荧光标记:市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列、Alexa系列、DyLight系列、Cy系列、IR Dye系列等。使用最多的为Alexa系列和CFTM系列。根据激发光的不同又有蓝色、绿色、橙红色、红色、远红外、近红外等分类。荧光标记的rVAR2的作用相当于ofCS的荧光抗体，特异性的与ofCS相结合。它的荧光染料的选择要与CD45抗体的荧光染料和DAPI的荧光色素要区分开来。
CD45荧光抗体：它的荧光染料的选择要与rVAR2和DAPI的荧光色素要区分开来。
DAPI：DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处，结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍，常用与荧光显微镜观测。DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。
本发明是基于基于肿瘤细胞形态大小的CTC俘获方法，在CTC俘获后，截留在膜芯片，利用rVAR2荧光来识别CTC。也有很多的技术方案不是以膜芯片为CTC的截留载体的，但凡应用到rVAR2荧光染色均受到本专利的保护。
rvAR2可以包裹在磁珠的表面做成rVAR2磁珠，利用该磁珠来俘获和富集血中的CTC，再用Pan-CK或者EpCAM荧光抗体来识别CTC。这种方法，也是本专利的保护范围。
目前，CTC的俘获主要涉及对血液中循环肿瘤细胞的俘获，其它体液中CTC的俘获方法与血液中CTC的俘获方法相同。因此，凡是对血液外CTC的俘获应用到rVAR2识别CTC均是本专利的保护范围。
有效效果：
本发明应用rVAR2荧光染色俘获后的CTC，替代基于CTC表面蛋白标记物的抗体荧光染色方法如CK、EpCAM对CTC的识别，俘获/识别CTC不依赖于CTC表面表达单一蛋白，尽可能的把上皮细胞来源的CTC和间质细胞性质的CTC一起俘获；这样提高了俘获的效率和准确性。应用rVAR2荧光俘获比CK+Vimentin两种荧光俘获更经济和简便。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例中肺癌上皮细胞A549截留在膜芯片中的镜检图；
图2是rVAR2荧光染色的CTC(rVAR2+/CD45-/DAPI+)的镜检图；
图3是CK荧光抗体俘获的CTC(Pan-CK+/CD45-/DAPI+)的镜检图；
图4是实施例ctc数目分布结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法，包括如下步骤：
S1、将待检测血液通过膜芯片的过滤，如：FR1检测系统，将CTC留在膜上；FR1检测系统(皖合械备20200336号)是一种超低压力系统，可高效和高纯度的俘获人体血液内的肿瘤细胞，用于肿瘤的早期诊断和肿瘤的精准治疗。血液在低压条件下通过膜芯片。由于肿瘤细胞的体积比正常的白细胞大，不能通过膜孔而留着膜上面。留在膜上面的细胞主要是白细胞和少量的肿瘤细胞。红细胞由于体积下，几乎全部被过滤掉了。轻轻的清洗膜，去掉一些红细胞，使膜的表面比较干净；
S2、加入荧光标记的rVAR2/anti-CD45荧光抗体/DAPI到膜上；具体的，膜上加入荧光标记的rVAR2蛋白，CD45荧光抗体和DAPI；其中DAPI也可以在荧光rVAR2和CD45荧光抗体孵育后，再单独加入DAPI孵育；
S3、荧光显微镜CTC计数(VAR2+/CD45-/DAPI+)。具体的，清洗膜，去掉多余的荧光染料。在荧光显微镜下观察肿瘤细胞的情况并计数。
验证过程
RareCTCap FR1检测系统对CTC的俘获率计算--肿瘤细胞的截留率(spiked-in)检测
1)取2.4x106/ml肺癌上皮细胞A549200ul，加入2mM Calcein-AM 100ul,室温下染色15分钟。离心200g 5分钟，倒掉上清液，用PBS冲洗细胞两次，以去除多余的染料。然后，将细胞重新悬浮在含有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中。
2)、通过连续稀释的统计取样，将细胞稀释至10-100个细胞/50μL的理想浓度。随后，使用微量移液管将50μL稀释细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板中，在显微镜下计数移植悬浮液中的细胞数。重复计数三次，以确定悬浮液中细胞的实际数量。重复这些操作后，调整用于加入1ml全血中细胞悬浮的体积，以制备肿瘤细胞加标样本。
3)一定量的肿瘤细胞加入到1ml健康人的全血中，混溶。血液通过FR1检测系统(皖合械备20200336号)检测；本实验中的膜孔的大小为6x40uM,膜的总面积为6x6mm，真空泵的压力为2.0±0.1Kpa，流速为500ul/min。
4)膜上活的肿瘤细胞的计数。由于Calcein-AM只与活细胞的细胞核结合，在荧光显微镜蓝光的激发下发出绿光，而被观察和计数。
5)实验结果：
如图1所示，在10x物镜下，观察并计数显微镜视野下绿色荧光细胞的数目即可得出所俘获肿瘤细胞的数目。肿瘤细胞A549的俘获率为90±5％。
FR1检测系统高的(＞85％)的肿瘤细胞俘获效率是保证其临床应用的关键。
rVAR2对spiked in肿瘤细胞俘获后CTC的计数
1)将通过连续稀释得到的100个左右的肺癌上皮细胞A549加入到1ml健康人的全血中，混匀。血液通过FR1检测系统(皖合械备20200336号)检测。本实验中的膜孔的大小为6x40uM,膜的总面积为6x6mm，真空泵的压力为2.0±0.1Kpa，流速为500ul/min。
2)准备两份有A549肺癌上皮细胞截留的血液，分别通过FR1检测系统，获得两张膜芯片，膜上有截留的A549细胞。分别用于rVAR2和Pan-CK荧光溶液对俘获的肿瘤细胞的计数。
3)对膜分别进行细胞固定、膜通透性增加等处理。
4)对于rVAR2荧光染色：将1：100～1：1000rVAR2-Alexa Fluor 568和1：100anti-CD45–FITC抗体的混合溶液与膜上细胞进行避光温育1小时。清洗后，将1：1000DAPI溶液与膜避光温育10分钟，清洗；荧光显微镜观察并计数CTC。rVAR2荧光染色的CTC(rVAR2+/CD45-/DAPI+)如图2所示。
5)对于pan-CK荧光染色：将1：100～500anti-Pan-CK-efluor抗体和1：100anti-CD45–FITC抗体的混合溶液与膜上细胞进行避光温育1小时。清洗后，将1：1000DAPI溶液与膜避光温育10分钟，清洗；荧光显微镜观察并计数CTC。CK荧光抗体俘获的CTC(Pan-CK+/CD45-/DAPI+)如图3所示。
6)荧光显微镜下观察CTC的细胞图像。
7)结果
a)rVAR2荧光染色的细胞表现为：rVAR2+/CD45-/DAPI+；数目为89；CTC俘获率为89％(89/100)；
b)Pan-CK荧光染色的细胞表现为：Pan-CK+/CD45-/DAPI+；数目为86；CTC俘获率为86％(86/100)；
根据rVAR2荧光染色细胞的表现rVAR2+/CD45-/DAPI+，说明染色的细胞是肿瘤细胞CTC而不是白细胞。白细胞是CD45阳性，anti-CD45抗体连接的FITC发出绿色的光；再者血液中白细胞的数量众多。虽然白细胞的表面也表达CS,但它不能与VAR2特异性的结合。ofCS大量的表达在实体肿瘤细胞上，且与rVAR2独特的结合。ofCS通过CSPG(硫酸软骨素的蛋白多糖)与细胞膜相连接。所以，rVAR2+/CD45-/DAPI+的细胞必定是肿瘤细胞即本次实验的A549肺癌上皮细胞。
大部分的肿瘤细胞表面表达pan-CK蛋白，利用Pan-CK的荧光抗体就能够把CTC标记出来。Pan-CK+/CD45-/DAPI+是A549肺癌上皮细胞的荧光染色特点。Pan-CK荧光标记的CTC数目与rVAR2荧光标记的CTC数目几乎相同，也从另外一个方面佐证了rVAR2荧光标记的是A549肺癌上皮细胞。
rVAR2对肺癌患者血液中CTC俘获的计数
1、分别取三个肺癌患者的外周血三次，每次4mL。每个4ml的外周血分别通过FR1检测系统(皖合械备20200336号)进行血液过滤，血中可能有的CTC则留在膜芯片上；
2、根据细胞荧光免疫化学的标准操作程序，对应的膜芯片分别用rVAR2、Pan-CK、Vimentin来荧光染色计数；
3、rVAR2荧光染色：俘获在膜芯片上的CTC用rVAR2-Alexa Fluor 568/anti-CD45-FITC抗体/DAPI进行荧光染色，如果有细胞呈现rVAR2+/CD45-/DAPI+荧光表象的，称为rVAR2荧光染色阳性的CTC；
4、Pan-CK荧光染色：俘获在膜芯片上的CTC用anti-Pan-CK-efluor抗体/anti-CD45-FITC抗体/DAPI进行荧光染色，如果有细胞呈现Pan-CK+/CD45-/DAPI+荧光表象的，称为Pan-CK荧光染色阳性的CTC；
5、Vimentin荧光染色：俘获在膜芯片上的CTC用anti-Vimentin-eflour抗体/anti-CD45-FITC抗体/DAPI进行荧光染色，如果有细胞呈现Vimentin+/CD45-/DAPI+荧光表象的，称为Vimentin荧光染色阳性的CTC。
结果如图4所示。由图4可知：
a)3个肺癌患者4ml外周血中含有的CTC数目是不相同的；病人1和3血中分别发现有Vimentin+/CD45-/DAPI+的肿瘤细胞，Vimentin+提示这是EMT细胞(上皮向间质转化的细胞)，该细胞缺乏上皮细胞的蛋白标记如EpCAM、Pan-CK等，但胞浆中表达有波形蛋白-Vimentin.
b)rVAR2荧光标记的CTC明显比Pan-Ck荧光标记的CTC数目要多，即使加上EMT细胞。提示肿瘤患者血液中仍然有Pan-CK-/CD45-/DAPI+的双阴性的CTC存在。肿瘤在发展过程中，细胞表面的蛋白会有不同的变化的。CK、EpCAM可能会下调其表达，甚至消失。这种双阴性细胞部分会转变为EMT细胞，其余的仍然维持为pan-CK-/CD45-/DAPI+的细胞状态。pan-CK-/CD45-/DAPI+CTC不能够被Pan-CK荧光抗体和Vimentin荧光抗体标记。这样不能被标记的CTC就会影响CTC检测的结果。
c)由此可见，应用rVAR2荧光标记俘获后的CTC不依赖CTC表面表达单一的标记蛋白，它既能够俘获CK阳性的CTC，又能够俘获CK阴性的CTC，从而能够更为全面的对通过膜芯片而俘获的CTC进行识别，提高检测的灵敏度，助于该技术在肿瘤早筛和肿瘤精准治疗上的应用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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