制备铼螯合mag3寡核苷酸的新方法
阅读说明：本技术 制备铼螯合mag3寡核苷酸的新方法 (Novel method for preparing rhenium chelated MAG3 oligonucleotide ) 是由 E·D·丰德 D·J·汉森 J·霍恩舍梅尔 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种制备式(III)化合物：以及铼螯合MAG3寡核苷酸的新方法。(The present invention relates to a process for preparing a compound of formula (III):)
本发明涉及一种制备铼螯合MAG3(巯基乙酰基三甘氨酸)以及铼螯合MAG3寡核苷酸的新方法。
由于铼放射性核素186Re和188Re在治疗性核医学中的潜在应用以及锝放射性核素99mTc在医学诊断成像中的应用前景，铼(Re)和锝(Tc)在核医学中显示出巨大的潜力。186Re和188Re放射性核素都是γ和β发射剂，而99mTc放射性核素只是γ发射剂；它们在医学成像和治疗中表现出良好的核特性。在欧洲和世界其他地区，铼和锝类放射性药物被广泛应用于医学诊断成像和治疗性核医学中
MAG3配体是一种成熟的成像配体，它与铼(Re)或锝(Tc)形成稳定的金属络合物。许多不同的生物活性分子，诸如糖、siRNA和反义寡核苷酸，仅举几例，已用MAG3官能化。由于放射性同位素诸如186Re或188Re用于肿瘤或肾功能的诊断或治疗，所得的Re或Tc络合物在放射性药物领域可能具有医学意义。但是对于放射性金属与生物活性分子的结合，基础研究仍然是必要的。大多数铼(V)类放射性药物缺乏稳定性(在生理条件下)或选择性(在靶向细胞方面，或在制备精确定义的药剂方面)，并且其合成仍有待改进。
例如Alsbaiee等人在Tet Lett 2012,53,1645-1651,International Journal ofPharmaceutics,2002,248,173-182中描述了铼螯合的MAG3官能化玫瑰花状纳米管的合成。P.Winnard等人在Nuclear Medicine&Biology,Vol.24,pp.425-432,1997中描述了NHS-MAG3的两步制备及其用于DNA的锝-99m标记的用途。
Alsbaiee和Winnard没有公开铼螯合MAG3寡核苷酸的合成。
发明人发现了一种合成铼螯合MAG3和铼螯合MAG3寡核苷酸的新方法。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种在一锅法反应中制备式(III)铼螯合MAG3化合物的新方法：
在第二方面，本发明涉及一种制备式(IV)铼螯合MAG3寡核苷酸化合物的新方法：
在第三方面，本发明涉及一种在一锅法反应中制备式(III)或式(IV)化合物的新方法。
下面将更详细地描述本发明的其他方面。
定义
术语“偶联剂”表示能够使两种有机分子例如羧酸和胺、醇或硫醇共价偶联的化合物。更具体地，在本发明的上下文中，偶联剂表示能够帮助羧酸偶联到胺的偶联反应的化合物。偶联剂可作为水溶性HCl盐使用。EDC是超过其他碳二亚胺的一个实例。EDC的副产品是水溶性的，可以很容易地通过水处理来去除。其他偶联剂的实例为DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、EDC-HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl)、BOP、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、PyBrOP(溴化三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐)、TSTU(N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)脲四氟硼酸盐)、TNTU(O-(双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚氨基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐)、T3P(2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂己环-2,4,6-三氧化物)、HCTU(O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU、HATU(N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉正离子氯化物)、CDI(1,1'-羰基二咪唑)等。
术语“烷基”单独或组合表示具有1至8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，并且更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C1-C8烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的特定实例是甲基、乙基和丙基。
术语“氨基”在单独或组合下指伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NH-)或叔氨基(-N-)。
术语“氨基寡核苷酸”表示包含非芳香族NH2的寡核苷酸。NH2基团可以例如位于寡核苷酸的3'或5'末端，例如3'寡核苷酸-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-NH2-5’
术语“氨基保护基”表示氨基的保护基。胺是在有机反应中经常需要保护基的官能团。氨基甲酸酯，例如叔丁氧基羰基(Boc，例如通过浓强酸(例如HCl或CF3COOH)或加热至>80℃去除)、苄氧基羰基(Cbz，例如通过氢解去除)或9-芴甲氧基羰基(Fmoc，例如通过碱去除，例如哌啶)是常用的胺保护基。可以使用具有不同脱保护条件的保护基的其他选择，例如美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学的Peter Wipf及其同事所描述的，他们开发了一种对伯胺、仲胺和杂环胺有用的保护基：2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基氧羰基(Tempoc)。乙酰基(Ac)在寡核苷酸合成中是常见的，用于保护胞嘧啶中的N4和腺嘌呤核酸碱基中的N6，并且可以通过碱处理去除，最常见的是用氨水或气态氨或甲胺处理。Ac太稳定，不容易从脂肪族酰胺中去除。苯甲酰基(Bz)在寡核苷酸合成中也是常见的，用于保护胞嘧啶中的N4和腺嘌呤核酸碱基中的N6，并且通过碱处理去除，最常见的是用氨水或气态氨或甲胺处理。Bz太稳定，不容易从脂肪族酰胺中去除。本领域技术人员也可以考虑其他常用的合适的氨基保护基，例如DMF或iBu。
术语“芳基”在单独或组合下指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环系统或双环系统，所述系统任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、链烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基，特别是苯基。
术语“螯合物”表示含有配体(例如有机物)的化合物在两个或更多个点处与中心金属原子结合的事实。它通常涉及多齿(多键)配体和单个中心原子之间形成或存在两个或更多个单独的配位键。这些配体被称为螯合剂(chelants、chelators、chelating agents或sequestering agents)。它是典型的离子和分子与金属离子结合的一种类型。根据本发明的式(II)化合物是螯合物或螯形络合物的实例。
本发明的螯合剂部分可包括选自氮原子、硫原子、氧原子和磷原子组成的组的任何数量的原子组合。在某些特定实施例中，螯合剂部分包括三至五个此类原子的组合。在一些实施例中，螯合剂能够通过与其他原子诸如氮原子、硫原子、氧原子和/或磷原子的配位来螯合任何价数的金属离子。在某些实施例中，螯合剂能够螯合三至五价金属离子。任何价的金属离子预期都可以螯合到本发明的螯合剂上。这些价金属离子的实例包括，但不限于186Re、188Re、Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、In-111、Tl-201、Ga-67和Ga-68。
术语“卤素”或“卤代”在单独或组合下指氟、氯、溴或碘并且特别地指氟、氯或溴，更特别地指氟。术语“卤代”与另一种基团组合，指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至四个卤素(即一个、两个、三个或四个卤素)取代的所述基团。
术语“硫醇”表示-SH基团。
“硫醇保护基”是硫醇基的保护基并且还用来保护羟基。羟基保护基的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的特定实例是DMT和TMT，尤其是DMT。
术语“LNA单体”指的是LNA核苷酸，指的是其核苷是本文定义的LNA核苷的核苷酸。
术语“一锅法合成”表示一种提高化学反应效率的策略，由此反应物仅在一个反应器中进行连续的化学反应而无需中间分离或纯化步骤。这是化学家非常希望的，因为避免冗长的分离过程和中间化合物的纯化可以节省时间和资源，同时提高化学产率。
术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。此外，可通过无机碱或有机碱与游离酸的加成制备这些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以呈两性离子的形式存在。特别优选的本发明的药用盐是钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。
术语“铼络合物的前体”表示能够螯合式(I)化合物的铼原子。铼络合物的前体的实例是市售的ReOCl3(PPh3)2(氧代三氯双(三苯基膦)铼(V))。其他实例有Re(NPh)Cl3(PPh3)2、ReO2(PPh3)2I或Re(NPh)Cl3(PPh3)2。
单独或组合使用的术语“保护基”表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点，从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性的保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。
“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例是2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的一个特定实例是2-氰基乙基。
根据本发明，铼络合物是Re(V)络合物。
如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能团，则应用本领域熟知的方法，可以在关键步骤之前引入适宜的保护基(如在例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，1999，Wiley，New York的“有机化学中的保护基(Protective Groups in Organic Chemistry)”中所述)。可以使用文献中描述的标准方法，在合成的晚期移除这类保护基。保护基的实例是叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、苄氧基羰基(Cbz)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)。
本文所述的化合物可以包含几个非对称中心，并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物的形式存在。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内部或之间自我互补性的程度跨寡核苷酸全长小于50％即可
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括以下修饰，其中例如通过用以下取代而修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。
2'糖修饰的核苷。
2’糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)的核苷或包含能够在核糖环中2'碳与和第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2’修饰的核苷，并且发现许多2’修饰的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。其他实例可参见例如：Freier和Altmann，Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443；Uhlmann，Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213；以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2'取代的修饰的核苷的示意图。
关于本发明，2’修饰不包括2’桥接的分子如LNA。
锁定核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含链接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人(Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76)、Seth等人(J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81)和Mitsuoka等人(Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238)。
2'-4'桥键可以位于核糖环平面的下方(β-D-构型)，或位于该环平面的上方(α-L-构型)，分别如式(A)和式(B)中所示。
应当认识到，除非另外说明，否则LNA核苷可处于β-D或α-L立体异构形式。
本发明的LNA核苷的特定实例在方案1中给出(其中B如上所定义)。
方案1
特定的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。
具体实施方式
一方面，本发明涉及一种制备式(III)化合物的方法，该方法包括以下步骤:
a)使式(I)化合物：
其中R为H或硫醇保护基，
与铼络合物的前体在溶剂中反应，得到式(II)化合物：
b)添加N-羟基琥珀酰亚胺和偶联剂，得到式(III)化合物：
其中步骤a)和b)在一锅法反应中进行。
在根据本发明的方法的一个实施例中，包括进一步的步骤c)，添加氨基寡核苷酸和碱，得到式(IV)化合物：
在根据本发明的方法的一个实施例中，步骤a)和b)是在一锅法合成中进行的。在一个实施例中，步骤a)、b)和c)是在一锅法合成中进行。
在根据本发明的方法的一个实施例中，铼络合物的前体选自由以下所组成的组：ReOCl3(PPh3)2、Re(NPh)Cl3(PPh3)2、ReO2(PPh3)2I和Re(NPh)Cl3(PPh3)2。
在根据本发明的方法的一个实施例中，铼络合物的前体为ReOCl3(PPh3)2。
在根据本发明的方法的一个实施例中，R为H。
在根据本发明的方法的一个实施例中，R是选自由以下所组成的组的硫醇保护基：乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)以及甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。
在根据本发明的方法的一个实施例中，R是选自由乙酰基(Ac)和苯甲酰基(Bz)组成的组的硫醇保护基。
在根据本发明的方法的一个实施例中，步骤a)中的溶剂是极性非质子溶剂和极性质子溶剂的混合物。在根据本发明的方法的一个实施例中，溶剂是DMF和MeOH的混合物。在根据本发明的方法的一个实施例中，溶剂是体积比为约1:1的DMF和MeOH的混合物。
在根据本发明的方法的一个实施例中，在步骤a)中进一步使用碱。在根据本发明的方法的一个实施例中，碱是NaOMe。
在一个实施例中，本发明的方法包括以下步骤:
c)使式(I)化合物：
其中R是H或选自由乙酰基(Ac)和苯甲酰基(Bz)所组成的组的硫醇保护基，
与ReOCl3(PPh3)2，
在体积比为约1:1的DMF:MeOH中反应，得到式(II)化合物：
d)添加N-羟基琥珀酰亚胺和EDC-HCl，得到式(III)化合物：
c)添加氨基寡核苷酸和碱，得到式(IV)化合物：
其中寡核苷酸包含至少一种2’糖修饰的核苷或LNA核苷
在一个实施例中，本发明的方法中寡核苷酸是反义寡核苷酸。在一个实施例中，本发明的方法中，反义寡核苷酸包含本文定义的2’糖修饰的核苷或LNA核苷。
MAG3可从通常的供应商处商购获得，例如Sigma Aldrich或ABX。式(I)化合物可商购获得，例如以NHS-MAG3乙酰基保护的形式从不同的供应商，例如Sigma Aldrich(Natureprotocols 2007-4-21，Yi Wang等)获得。
除非另有说明，所有起始产品、试剂和溶剂均可商购获得。
在步骤b)中，使用溶剂。其可为极性非质子溶剂、极性质子溶剂或其混合物。
极性非质子溶剂的实例有DCM(二氯甲烷)、N-甲基吡咯烷酮、THF(四氢呋喃)、ETOAc(乙酸乙酯)、丙酮、DMF(二甲基甲酰胺)、MeCN(乙腈)、DMSO(二甲基亚砜)和PC(碳酸丙烯酯)或其混合物。
在根据本发明的方法的一个或所有实施例中，极性非质子溶剂是DMF。
极性质子溶剂的实例是甲酸、正丁醇、IPA(异丙醇)、EtOH(乙醇)、MeOH(甲醇)、AcOH(乙酸)和水或其混合物。
在根据本发明的方法的一个或所有实施例中，极性质子溶剂是MeOH。
在根据本发明的方法的一个或所有实施例中，溶剂可为极性非质子溶剂和极性质子溶剂的混合物，例如DMF:MeOH，例如体积比为约1:1的DMF:MeOH。
在步骤c)中，可使用溶剂。在一个实施例中，使用N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐。
步骤b)的偶联剂可选自由以下偶联剂组成的组：DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、EDC-HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl)、BOP、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、PyBrOP(溴化三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐)、TSTU(N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)脲四氟硼酸盐)、TNTU(O-(双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚氨基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐)、T3P(2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂己环-2,4,6-三氧化物)、HCTU(O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU、HATU(N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉正离子氯化物)、CDI(1,1'-羰基二咪唑)等。
在根据本发明的方法的一个实施例中，偶联剂是EDC-HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl)。
本发明的方法可以通过以下非限制性的实施例来实现：
1.一种制备式(III)化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使式(I)化合物：
其中R为H或硫醇保护基，
与铼络合物的前体在溶剂中反应，得到式(II)化合物：
b)添加N-羟基琥珀酰亚胺和偶联剂，得到式(III)化合物：
其中步骤a)和b)在一锅法反应中进行。
2.根据实施例1的方法，该方法进一步包括步骤c)添加氨基寡核苷酸和碱以得到式(IV)化合物：
3.根据实施例2的方法，其中步骤a)、b)和c)在一锅法合成中进行。
4.根据实施例1至3中任一项的方法，其中铼络合物的前体选自由以下所组成的组：ReOCl3(PPh3)2、Re(NPh)Cl3(PPh3)2、ReO2(PPh3)2I和Re(NPh)Cl3(PPh3)2。
5.根据实施例4的方法，其中铼络合物的前体是ReOCl3(PPh3)2。
6.根据实施例1至5中任一项的方法，其中R是H。
7.根据实施例1至5中任一项的方法，其中R是选自由以下所组成的组的硫醇保护基：乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)以及甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。
8.根据实施例6或7的方法，其中R是选自由乙酰基(Ac)和苯甲酰基(Bz)组成的组的硫醇保护基。
9.根据实施例1至8中任一项的方法，其中步骤a)中的溶剂是极性非质子溶剂和极性质子溶剂的混合物。
10.根据实施例8的方法，其中DMF:MeOH的体积比为约1:1。
11.根据实施例1至10中任一项的方法，其中在步骤a)中进一步使用碱。
12.根据实施例11的方法，其中碱是NaOMe。
13.根据实施例1至12中任一项的方法，该方法包括以下步骤：
a)使式(I)化合物：
其中R是选自由乙酰基(Ac)和苯甲酰基(Bz)所组成的组的硫醇保护基，
与ReOCl3(PPh3)2，
在体积比为约1:1的DMF:MeOH中反应，得到式(II)化合物：
b)添加N-羟基琥珀酰亚胺和EDC-HCl，得到式(III)化合物：
c)添加氨基寡核苷酸和碱，得到式(IV)化合物：
其中所述寡核苷酸包含至少一种2’糖修饰的核苷或LNA核苷，且步骤a)、b)和c)是在一锅法反应中进行的。
14.根据实施例1至13中任一项的方法，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
15.根据实施例14的方法，其中反义寡核苷酸包含至少一种2’糖修饰的核苷或LNA核苷。
16.根据实施例1至15中任一项的方法，其中偶联剂为选自由以下偶联剂组成的组：DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、EDC-HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl)、BOP、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、PyBrOP(溴化三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)、TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐)、TSTU((N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)脲四氟硼酸盐)、TNTU(O-(双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚氨基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐)、T3P(2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂己环-2,4,6-三氧化物)、HCTU(O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU、HATU(N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉正离子氯化物)、CDI(1,1'-羰基二咪唑)等。
17.根据实施例16的方法，其中偶联剂是EDC-HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl)。
实例
将脱气的(N2和/或氩气)DMF:MeOH(2.5mL，比例1:1)添加到含有受保护的Mag-3-COOH(10mg,27umol)、ReOCl3(PPh3)2(45mg,54umol)和NaOMe(29.4mg，554umol)的烧瓶中。然后将所得溶液搅拌60分钟。此后，使用N2流将反应混合物蒸发至约0.5mL体积。然后，添加N-羟基琥珀酰亚胺(9.4mg,82umol)和EDC-HCl(6.3mg,33umol)，并将所得混合物搅拌过夜。反应过夜后，将混合物用0.5mL DMSO稀释并搅拌15分钟。然后添加氨基修饰的寡核苷酸(30mg溶于0.5mL NaHCO3 pH＝8.5)。将所得混合物搅拌过夜，以提供所需的寡核苷酸化合物(即与铼螯合的Mag-3缀合的氨基寡核苷酸)。
纯化：通过向上述反应混合物中添加2％LiClO4的丙酮溶液，从一锅法反应中沉淀寡核苷酸。然后将烧瓶旋转、离心并倾析。剩余的残余物(沉淀的寡核苷酸)然后溶解在水中，并通过反相HPLC纯化。
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