发明内容

本发明目的在于减轻前述困难。

根据本发明的第一个方面，提供一种制备低内毒素碱性壳聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使壳聚糖与碱性溶液接触，以形成混合物；和

(b)让混合物保持至少约12小时。

根据本发明的另一个方面，提供一种制备低内毒素碱性壳聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使壳聚糖与碱性溶液接触，以形成混合物；

(b)让混合物保持至少约12小时；和

(c)干燥混合物。

本发明的方法提供得到具有低内毒素浓度的碱性壳聚糖的有效方式。所述方法有利的是不需要洗涤步骤、冲洗步骤、使用表面活性剂或相转移剂、无菌设备和/或使用无内毒素的水。另外，也不需要专用空气过滤或无菌条件。本发明的方法优选不包括使壳聚糖乙酰化的步骤。

本文所用术语“碱性溶液”是指具有大于pH 7.5的pH值的溶液。

由于内毒素的分子量可显著不同，因此，内毒素浓度以内毒素单位(EU)/克材料测定。内毒素浓度的测定是内毒素水平相对于具体量参比内毒素的定量。

例如，在本发明中，内毒素浓度以内毒素单位(EU)/克壳聚糖测定。本文所用术语“低内毒素”是指具有小于100内毒素单位(EU)/克壳聚糖的内毒素浓度。

因此，本发明的方法适用于制备具有小于100EU/g内毒素浓度的碱性壳聚糖。

优选所得碱性壳聚糖具有小于50EU/g的内毒素浓度，更优选小于20EU/g，甚至更优选小于15EU/g，最优选小于10EU/g。

已发现，低浓度碱性溶液在本发明方法中优选。在所述方法中使用的碱性溶液的浓度可以为约0.01M至约1M。优选碱性溶液的浓度小于1M。优选碱性溶液的浓度为约0.02M至0.2M，甚至更优选碱性溶液的浓度为约0.04M至0.06M，一般0.05M。碱性溶液的浓度可以为约0.01M、0.05M、0.10M、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.55M、0.60M、0.65M、0.70M、0.75M、0.80M、0.85M、0.90M或0.95M。已利用0.1M碱性溶液的浓度观察到良好结果。

在一些实施方案中，碱性溶液与壳聚糖的量可以为约1份壳聚糖比约10份碱性溶液至约10份壳聚糖比约1份碱性溶液。优选碱性溶液与壳聚糖的量为约1份碱性溶液比约2份壳聚糖，更优选约1份碱性溶液比约1份壳聚糖。

碱性溶液可包含碱或碱土金属(alkaline earth)组分，所述碱或碱土金属组分选自单独或组合的以下组分：金属氢氧化物、金属碳酸盐、金属亚硫酸氢盐、金属过硅酸盐(persilicate)、共轭碱和氢氧化铵。

适合的金属包括钠、钾、钙或镁。

优选碱组分为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。一般使用氢氧化钠。

可通过在本领域已知的任何适合方法使碱性溶液与壳聚糖接触。例如，可使碱性溶液喷到壳聚糖上，或者可使壳聚糖与碱性溶液混合。优选碱接触的壳聚糖均匀分布。

优选使壳聚糖与碱性溶液混合。在低分子量，壳聚糖可完全或部分溶于碱性溶液。可使壳聚糖与碱性溶液混合最多约30分钟，更优选约10分钟。在一些实施方案中，可使壳聚糖与碱性溶液混合大于30分钟。在一些实施方案中，可将壳聚糖和碱性溶液的混合物间歇搅拌步骤(b)的持续时间。

将壳聚糖和碱性溶液的混合物保持一段其中内毒素被碱破坏的时间。将壳聚糖和碱性溶液的混合物保持至少约12小时。已发现，壳聚糖和碱性溶液的混合物保持的时间越长，得到的碱性壳聚糖的内毒素浓度越低。在混合物已保持约12小时时，已观察到适合的低内毒素浓度。本发明方法的另一个优势是，可保持混合物，而不需要不断混合壳聚糖与碱性溶液。

在一些实施方案中，混合物可保持至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 小时。

优选保持混合物至少48小时。

在一些实施方案中，混合物可保持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70天或更长时间。

在一些实施方案中，混合物保持约2至4星期(或14至30天)或更长时间。优选混合物保持24小时和70天之间，更优选7天和35天之间，最优选14天和21天之间。

通过使壳聚糖与0.1M氢氧化钠溶液接触，并保持混合物约12至16天，优选约14天，已观察到良好结果。

可在室温和室内压力保持混合物。室温和室内压力是指约20-25℃温度和约1大气压(atm)压力。有利的是，所述混合物不需要保持在无菌环境。

优选混合物在洁净容器中储存。混合物可在惰性气氛下储存。

混合物可进一步包含防腐剂。有利的是，防腐剂可消除例如混合物长期保持时可能发生的微生物生长的风险。防腐剂可以为任何生物相容性且适用于碱性环境的防腐剂。适合的防腐剂包括银离子、锌离子、氯己定(chlorohexadine)或其组合。

本发明的方法可包括或可不包括干燥步骤。可通过在本领域已知的任何常规干燥方法进行干燥步骤。优选在烘箱中或通过空气干燥器过滤进行干燥步骤。同样，干燥步骤不需要专用无菌设备。

已发现，一旦混合物已在干燥步骤干燥，混合物的内毒素水平就不再显著增加。这对进一步处理混合物是有利的。

因此，本发明提供具有小于100EU/g内毒素浓度的低内毒素碱性壳聚糖。低内毒素碱性壳聚糖可以为水不溶性。在低分子量，低内毒素碱性壳聚糖可显示一些水溶性。

根据本发明的另一个方面，提供一种可由本文所述方法得到的低内毒素碱性壳聚糖。

根据本发明的另一个方面，提供一种具有小于100EU/g内毒素浓度的碱性壳聚糖。

碱性壳聚糖优选具有小于50EU/g的内毒素浓度，更优选小于20EU/g，甚至更优选小于15EU/g，最优选小于10EU/g。

可用低内毒素碱性壳聚糖制备其它壳聚糖产物，例如衍生物或共聚物，或制备低分子量壳聚糖或壳聚糖低聚糖。低内毒素碱性壳聚糖也可作为原料用于制备其它形式的壳聚糖或衍生物或共聚物，例如基于壳聚糖的纤维、织物、涂料、薄膜、凝胶、溶液、片或泡沫。

具体地讲，低内毒素碱性壳聚糖可用于制备具有低内毒素浓度的其它有用的壳聚糖产物，包括中性壳聚糖和壳聚糖盐和其它壳聚糖衍生物，例如羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、酰基壳聚糖、烷基壳聚糖、磺酰基壳聚糖、磷酸化壳聚糖、烷叉基壳聚糖、金属螯合物、氯化壳聚糖、乳酸壳聚糖、乙酸壳聚糖、苹果酸壳聚糖、葡糖酸壳聚糖。

因此，根据本发明的另一个方面，提供一种制备低内毒素中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物的方法，所述方法包括使通过本文所述方法制备的碱性壳聚糖与酸接触的步骤。

这种方法可提供具有低浓度内毒素的医用中性壳聚糖、壳聚糖盐或其它壳聚糖衍生物。

在本发明第一方面的方法中，使碱性壳聚糖与酸接触的步骤可在干燥步骤之前进行。

可通过在本领域已知的任何适合方法使酸与碱性壳聚糖接触。例如，可使酸喷到碱性壳聚糖上，或者可使碱性壳聚糖与酸混合。

优选使碱性壳聚糖与酸混合。

在本文中，中性壳聚糖是指具有约6.5和约7.5之间pH值的壳聚糖，优选约7。

因此，为了制备中性壳聚糖，可使碱性壳聚糖与适合体积和浓度的酸混合，以生成具有6.5和7.5之间pH的中性溶液。中和碱性壳聚糖所需酸的体积和/或浓度将取决于碱性壳聚糖的pH。

或者，为了制备壳聚糖盐或壳聚糖衍生物，可使碱性壳聚糖与超过提供中性壳聚糖所需的体积和浓度的酸混合。

用于本发明的适合的酸可选自单独或组合的以下酸：有机酸、羧酸、脂肪酸、氨基酸、路易斯酸、单质子酸、双质子酸、多质子酸、核酸和无机酸。

适合的有机酸可选自单独或组合的以下有机酸：乙酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、乙酰基水杨酸、葡糖酸和乳酸。

适合的脂肪酸可选自单独或组合的以下脂肪酸：肉豆蔻脑酸、棕榈油酸(palmitoleic acid)、顺-6-十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、亚油酸、反亚油酸(linoelaidic acid)、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山酸、木蜡酸、蜡酸。

适合的氨基酸可选自单独或组合的以下氨基酸：组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、牛磺酸。

适合的无机酸可选自单独或组合的以下无机酸：盐酸、硫酸和硝酸。优选选择用于中和的酸为盐酸。

酸可具有约0.001M酸至最高可能酸浓度的浓度。例如，用于硫酸的一般最高浓度为约98%硫酸。酸可具有约0.01M至5M、0.01M至3M或0.1M至2M的浓度。优选酸具有约1M浓度。酸的浓度可以为约0.01M、0.05M、0.10M、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.55M、0.60M、0.65M、0.70M、0.75M、0.80M、0.85M、0.90M、0.95M或1.0M。

酸可作为包含酸和非溶剂的酸液存在。非溶剂可以为任何其中壳聚糖不溶的溶剂。一般非溶剂包括乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙醇、丙酮或其混合物。优选非溶剂包括乙酸乙酯或乙醇。更优选非溶剂包括80:20乙醇/水。已有利地观察到，使用包含80:20乙醇与水的混合物的非溶剂，反应以较快的速率进行。

壳聚糖与酸液之比可以为约5:1至约1:5。壳聚糖与酸液之比优选为约2:1。

在一些实施方案中，可使低内毒素碱性壳聚糖与酸混合约5分钟。然后使反应在混合物干燥时发生。

从碱性壳聚糖与酸的混合物得到的溶液可包含酸式盐。优选选择碱性溶液和酸，以保证生成的酸式盐为生物相容性的。例如，碱性溶液可包含氢氧化钠，酸可包括盐酸。在此实例中，酸式盐为生物相容的盐氯化钠。

酸式盐作为碱性壳聚糖和酸之间反应的副产物生成。

产物中存在酸式盐可影响所得壳聚糖产物的有效性。例如，壳聚糖在盐水溶液中比在水中更小程度的胶凝，在双倍浓度盐水溶液中胶凝的程度甚至更小。本文提到的双倍浓度的盐水溶液考虑为具有1.8%氯化钠量。因此，合乎需要在所得壳聚糖产物中具有尽可能低的酸式盐量，理想的是，对壳聚糖产物的有效性产生很小或基本上不产生差异的酸式盐的水平。

已意外地发现，使用约0.01M至约0.1M浓度的碱性溶液产生所需低内毒素浓度，同时也在随后过程产生较少酸式盐副产物，以得到中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物。有利的是，较少酸式盐副产物意味着相对于包含较高量酸式盐的产物，所得壳聚糖产物在使用中将具有改善的胶凝。本发明的方法可提供具有适合低量酸式盐的壳聚糖产物，而不需要洗涤或冲洗壳聚糖产物。这也有不需要在洗涤或冲洗步骤中使用无内毒素水的额外优势。

也已发现，在制备中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物时，使用本文所述低浓度碱性溶液使壳聚糖粘度减小很少。低浓度碱是指约0.01M至约1M，优选小于1M，更优选约0.02M至约0.2M。在一些实施方案中，碱浓度可以为0.05M。在一些实施方案中，碱浓度可如上所述。因此，有利的是，在所述方法中使用低浓度碱性溶液很少破坏壳聚糖。因此，可从壳聚糖去除内毒素，同时只产生最小粘度变化。合乎需要在过程中壳聚糖粘度减小小于约25%，优选小于约15%，更优选小于约10%。

在所述方法提供低内毒素中性壳聚糖时，产物适合作为原料制备其它基于壳聚糖的产物。一种具体用途是制备壳聚糖盐，其吸收性质使它们理想的用于控制出血使用的止血制剂。优选壳聚糖盐为水溶性的。

因此，在本发明的另一个实施方案中，通过使由本文所述方法制备的低内毒素中性壳聚糖与酸接触，可制备低内毒素壳聚糖盐。

酸可以为适用于提供所需壳聚糖盐的任何酸。例如，如果需要乙酸壳聚糖，可使用乙酸，如果需要琥珀酸壳聚糖，可使用琥珀酸等。可在本发明方法中用本文所述的任何酸制备低内毒素壳聚糖盐。

用于制备低内毒素壳聚糖盐或壳聚糖衍生物的方法可还包括干燥低内毒素中性壳聚糖和酸的混合物的步骤。可通过在本领域已知的任何常规干燥方法进行干燥步骤。优选在烘箱中或使产物通过空气干燥器过滤进行干燥步骤。

因此，本发明提供具有小于100EU/g内毒素浓度的低内毒素中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物。

低内毒素中性壳聚糖可以为水不溶性的。

低内毒素壳聚糖盐可以为水溶性的。

根据本发明的另一个方面，提供可由本文所述任何方法得到的低内毒素中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物。

根据本发明的另一个方面，提供具有小于100EU/g内毒素浓度的中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物。

中性壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖衍生物优选具有小于50EU/g的内毒素浓度，更优选小于20EU/g，甚至更优选小于15EU/g，最优选小于10EU/g。

本发明的低内毒素壳聚糖盐适合用作止血剂，用于阻止血流。

因此，根据本发明的另一个方面，提供用作止血剂阻止血流的本文所述低内毒素壳聚糖盐。

本发明的低内毒素壳聚糖盐可加入到创伤敷料中，用于表面无危急生命的出血或危急生命的出血。

因此，根据本发明的另一个方面，提供用于表面无危急生命的出血或危急生命的出血所用创伤敷料的本文所述低内毒素壳聚糖盐。

本发明的低内毒素壳聚糖盐适用于制备阻止血流所用的止血创伤敷料。根据本发明的另一个方面，提供包含本文所述低内毒素壳聚糖盐的止血创伤敷料。

根据本发明的另一个方面，提供包含本文所述低内毒素壳聚糖盐的止血材料。

止血材料和/或壳聚糖盐可以为任何适合形式，例如微粒、粉末、粒状、薄片、纤维、凝胶、泡沫、片、薄膜或液体形式。

根据本发明的另一个方面，提供一种阻止血流的方法，所述方法包括以下步骤：任选在可能的情况下，清洁创伤区域；向所述创伤区域施用包含本文所述低内毒素壳聚糖盐的止血创伤敷料；并对创伤区域施加恒压，直至形成凝胶块凝物。

优选对创伤区域施加恒压约3分钟或更长。