一种同时检测多种番茄类病毒的核酸探针、试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 一种同时检测多种番茄类病毒的核酸探针、试剂盒及其应用 (Nucleic acid probe and kit for simultaneously detecting multiple tomato viruses and application of nucleic acid probe and kit ) 是由 张志想 张煜泓 李世访 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种同时检测多种番茄类病毒的核酸探针、试剂盒及其应用,属于生物工程和分子检测技术领域。本发明通过深入分析马铃薯纺锤块茎形类病毒科中的各个类病毒的序列,以发现的一段约为60bp的、在6种类病毒基因组中均存在的共有序列,以PSTVd质粒为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得该序列,插入pGEM-T载体,用限制性酶消化重组质粒,再以体外转录的方法获得一种通用核酸探针。使用上述核酸探针,一次可同时检测6种不同的番茄类病毒。这不仅降低了制备核酸探针的成本,而且大大提高了检测效率。从而可用于田间番茄样品的大规模检测,能快速、准确地进行病害诊断,因此具有良好的实际应用之价值。(The invention provides a nucleic acid probe for simultaneously detecting various tomato viruses, a kit and application thereof, belonging to the technical field of biological engineering and molecular detection. The invention discloses a universal nucleic acid probe which is obtained by deeply analyzing the sequences of various viroids in potato spindle tuber viroid, using a segment of a found 60bp consensus sequence existing in 6 viroid genomes, using a PSTVd plasmid as a template, designing a specific primer, obtaining the sequence through PCR amplification, inserting a pGEM-T vector, digesting a recombinant plasmid by using a restriction enzyme, and then carrying out in vitro transcription. The nucleic acid probe can be used for simultaneously detecting 6 different tomato viruses at one time. This not only reduces the cost of preparing nucleic acid probes, but also greatly improves the detection efficiency. Therefore, the method can be used for large-scale detection of field tomato samples, and can quickly and accurately diagnose diseases, thereby having good practical application value.)
技术领域
本发明属于生物工程和分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种番茄 类病毒的核酸探针、试剂盒及其应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不 必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所 公知的现有技术。类病毒(viroid)是一类环状、非编码、单链、低分子量RNA，为最小的植 物病原物，侵染植物后可造成严重的经济损失(Flores R,Hernández C,Alba AEMD, Daròs JA,DiSerio F.Viroids and viroid-host interactions.[J].Annual Review ofPhytopathology,2005,43(1):117-139.)。多种马铃薯纺锤形块茎类病毒科的类 病毒，如：马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)、番茄褪绿矮缩类病毒(TCDVd)、 番茄顶缩类病毒(TASVd)、辣椒小果类病毒(PCFVd)、番茄雄性株类病毒(TPMVd) 和金鱼花潜隐类病毒(CLVd)可侵染番茄(Lycopersicon esculentum)(Matsushita Y,Tsuda S.Seedtransmission of potato spindle tuber viroid,tomato chlorotic dwarf viroid,tomato apical stunt viroid,and Columnea latent viroid in horticultural plants[J]. European Journal of Plant Pathology,2016,145:1007-1011)。并且有些类病毒随番 茄种子传播(Fiona C,Grant C,Lindsay P,Andrew D,Joanne M,Kevin D,Brendan R,Mark G.Viroid-infected tomato and capsicum seed shipments to Australia[J].Viruses, 2019,11(2):98)。因此，番茄类病毒的早期检测和诊断是病害防控的重要措施。
核酸分子杂交可靠性高，且适合于大量样品的检测，是类病毒常规检测不可 或缺的技术。通常，使用核酸分子杂交进行检测，一次只能检测一种类病毒。但 在实际生产中，植物通常被多种类病毒同时侵染，这就需要一次可以同时检测出 多种不同的类病毒。经过改进，目前使用核酸分子杂交可以同时检测多种不同的 类病毒(James,D,Varga,A,Pállas,V,and Candresse,T.Strategies for simultaneous detection of multipleplant viruses[J].Canadian Journal of Plant Pathology.2006,28: 16–29)。起初，是将不同的探针混合以同时检测多种类病毒(Saldarelli,P, Barbarossa,L,Grieco,F,andGallitelli,D.Digoxigenin-labelled riboprobes applied to phytosanitarycertification of tomato in Italy[J].Plant Disease.1996,80:1343–1346. Sánchez-Navarro,J.A,M.C,Cano,E.A,and Pallás,V.Simultaneous detection of fivecarnation viruses by non-isotopic molecular hybridization[J].JournalofVirological Methods.1999,82:167–175.)，但由于多种探针的混合易造成杂交背 景过深，影响结果判定(Pallás V,Sánchez N,Jesus A,James D.Recent advances on themultiplex molecular detection of plant viruses and viroids[J].Frontiers inMicrobiology,2018,9:2087-2097.)。而将不同类病毒的探针串联在一起，即构成 多聚探针，可以克服上述缺点。使用多聚探针检测多种不同的类病毒，可以实现 多重、快速、省时的目的(Zhang,Z X.Peng,S.Jiang,D M.Pan,S.Wang,H Q.Li,S F. Development of apolyprobe for the simultaneous detection of four grapevine viroids ingrapevine plants[J].European Journal of Plant Pathology,2012,132:9-16.)。发明人发现，多聚探针的制备，需要通过多次的亚克隆，将不同类病毒的序列依次连 接在一起。这不仅需要精心设计，选择合适的酶切位点，而且制备过程繁琐、费 时。以检测侵染番茄的6种类病毒(PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd和 CLVd)为例，若要制备能够同时检测这6种类病毒的多聚探针，则需要5次亚克 隆，过程十分繁琐。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测多种番茄类病毒的核酸探 针、试剂盒及其应用。本发明通过研究，意外发现6种番茄类病毒(PSTVd、PCFVd、 TCDVd、TPMVd、TASVd和CLVd)之间存在的共同序列，制备出一种可以同时高 灵敏检测侵染番茄的6种不同类病毒的核酸探针，且制备过程更为简便、省时、 成本低，基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种引物对，所述引物对由引物F1和引物R1 组成；
所述引物F1为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列1所示的核苷酸序列；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1 具有相同功能的核苷酸序列；
所述引物R1为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列2所示的核苷酸序列；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2 具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第二个方面，提供所述引物对在制备核酸探针中的应用；所述核酸 探针的用途为如下b1)或b2)：
b1)鉴定或辅助鉴定番茄类病毒；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有番茄类病毒。
其中，所述番茄类病毒包括但不限于PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd中的任意一种或多种。
本发明的第三个方面，提供一种核酸探针，所述核酸探针为如下c1)或c2)：
c1)序列表的序列3所示的核苷酸序列；
c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3 具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸探针为cRNA探针，其用途为如下b1)或b2)：
b1)鉴定或辅助鉴定番茄类病毒；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有番茄类病毒。
其中，所述番茄类病毒包括但不限于PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd中的任意一种或多种。
本发明的又一
具体实施方式
中，为方便后续进行原位杂交检测，可以对核酸 探针进行标记。目前，常用的标记方法包括放射性同位素标记和非放射性同位素 标记；其中，非放射性同位素标记包括使用生物素、地高辛或者荧光标记。基于 成本和安全性等综合因素考虑，在本发明的一个具体实施方式中，选用地高辛对 所述核酸探针进行标记。
本发明的第四个方面，提供上述第三方面核酸探针的制备方法，所述制备方 法包括：通过上述第一方面的引物对类病毒基因组序列进行扩增，克隆至表达载 体中，使用限制性内切酶消化并纯化，经体外转录法合成。
其中，所述病毒基因组中使用的病毒为待测番茄类病毒，包括但不限于 PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd和CLVd中的任意一种或多种；优选为PSTVd (GenBank:U23058.1)。
所述表达载体可以为表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、 F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、 逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、 噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体 (MAC)；进一步优选为质粒；在本发明的一个具体实施方式中，选用的表达载 体为pGEM-T质粒。
所述限制性内切酶不作具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，选用的 限制性内切酶Spe I。
本发明的第五个方面，提供上述第一方面引物对和/或第三方面核酸探针在 制备试剂盒中的应用。所述试剂盒其用途为如下b1)或b2)：
b1)鉴定或辅助鉴定番茄类病毒；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有番茄类病毒。
本发明的第六个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述第三方面核酸 探针。
本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒还可以包含其他用于检测上述番 茄类病毒的核酸探针，所述核酸探针包括如下d1)或d2)：
d1)序列表的序列4-9任一项所示的核苷酸序列；
d2)将序列4-9任一项经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且 与序列4-9具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第七个方面，提供上述第三方面核酸探针和/或第六方面试剂盒在 如下b1)或b2)中的应用：
b1)鉴定或辅助鉴定番茄类病毒；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有番茄类病毒。
其中，所述番茄类病毒包括但不限于PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd中的任意一种或多种。
本发明的第八个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定番茄类病毒的方法，包括： 使用第三方面核酸探针和/或第六方面试剂盒对待测类病毒的核酸进行特异性杂 交。
本发明的第九个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有番茄类 病毒的方法，包括：提取和纯化样品中的核酸，使用探针进行特异性杂交。
其中，所述番茄类病毒包括但不限于PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd中的任意一种或多种。
样品可来源于植物样品，特别是易感上述类病毒的植物样品，如马铃薯、番 茄、辣椒、鳄梨、菊花、柑橘、金鱼花、血苋和心叶茄等。
以上任一所述方法中，为进一步提高检测灵敏度，对杂交温度进行了优化， 在本发明的一个具体实施方式中，使用通用核酸探针(序列3)时，所述杂交温 度为50～65℃，如50℃、55℃、60℃或65℃，杂交结果表明，55℃时，检测上 述六种类病毒的杂交信号强于其余杂交温度，因此，通用探针检测灵敏度最适的 杂交温度为55℃，通用核酸探针的检测灵敏度最高。通用核酸探针能同时检测 到6种类病毒，且杂交信号强。
在本发明的一个具体实施方式中，使用特异性核酸探针(序列4-9中的任意 一种或多种)时，杂交温度为60～70℃，如60℃、65℃、68℃或70℃，优选为 68℃，各特异性探针虽然除自身外，也能检测到其他一种或几种类病毒，但检测 其他类病毒的杂交信号较弱。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过深入分析马铃薯纺锤块茎形类病毒科中的各个类病毒的 序列，以发现的一段约为60bp的、在6种类病毒基因组中均存在的共有序列， 以PSTVd质粒为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增获得该序列，插入pGEM-T 载体，用限制性酶消化重组质粒，再以体外转录的方法获得一种通用核酸探针。
随着国际和地区间番茄繁殖材料或种质资源的交流更为频繁，番茄类病毒的 检疫提出了更高的要求。这需要更加简便、快速的检测技术作为支撑。上述技术 方案在一定程度上满足了这一需求。使用上述技术方案提供的核酸探针，一次可 同时检测6种不同的番茄类病毒。这不仅降低了制备核酸探针的成本，而且大大 提高了检测效率。
综上，上述技术方案提供的核酸探针及相应的检测技术可用于田间番茄样品 的大规模检测，能快速、准确地进行病害诊断，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明 的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中cDNA的克隆和探针的制备流程图。
图2为本发明实施例1中PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd和CLVd序列 比对结果以及通用探针序列在PSTVd序列中的位置。
图3为本发明实施例1中PCR产物电泳检测结果。
图4为本发明实施例1中通用核酸探针质粒载体酶切产物检测结果。其中，1： 未线性化质粒；2：线性化质粒。
图5为本发明实施例1中PSTVd、PCFVd、TASVd、TCDVd、TPMVd和CLVd酶切产 物检测结果。其中，A图中，1：PSTVd未线性化质粒；2：PSTVd线性化质粒， 用于体外转录制备特异性探针；3：TASVd未线性化质粒；4：TASVd线性化质粒， 用于体外转录制备其正链RNA；5：TPMVd未线性化质粒；6：TPMVd线性化质 粒，用于体外转录制备其正链RNA；7：PCFVd未线性化质粒；8：PCFVd线性化 质粒，用于体外转录制备其正链RNA；9：CLVd未线性化质粒；10：CLVd线性化 质粒，用于体外转录制备其正链RNA；B图中，1：TCDVd未线性化质粒；2：TCDVd 线性化质粒，用于体外转录制备其正链RNA；3：TCDVd线性化质粒，用于体外 转录制备特异性探针；4：TASVd未线性化质粒；5：TASVd线性化质粒，用于体 外转录制备特异性探针；6：PCFVd未线性化质粒；7：PCFVd线性化质粒，用于 用于体外转录制备特异性探针。C图中，1:TPMVd未线性化质粒；2：TPMVd线 性化质粒，用于体外转录制备特异性探针；3：CLVd未线性化质粒；4：CLVd线 性化质粒，用于体外转录制备特异性探针；5：PSTVd未线性化质粒；6：PSTVd 线性化质粒，用于体外转录制备其正链RNA。
图6为本发明实施例1中通用核酸探针在不同杂交温度下杂交灵敏度和特异性比较的结果。
图7为本发明实施例1中在一定浓度条件下(RNA稀释浓度梯度为5-3)，不同类 病毒特异性探针与通用核酸探针检测灵敏度和特异性的比较结果。通用核酸探针 杂交温度为55℃，特异性核酸探针杂交温度为68℃。A：PSTVd；B：PCFVd；C：TCDVd；D：TPMVd；E：TASVd；F：CLVd。。
图8为本发明实施例1中通用核酸探针和单个类病毒特异性探针对番茄样品的斑点杂交结果。通用核酸探针杂交温度为55℃，特异性核酸探针杂交温度为68℃。 A：PSTVd+健康番茄的RNA；B：PCFVd+健康番茄的RNA；C：TCDVd+健康番茄的 RNA；D：TPMVd+健康番茄的RNA；E：TASVd+健康番茄的RNA；F：CLVd+健康 番茄的RNA。
图9为6种类病毒体外转录正、负义链RNA使用的限制性内切酶和RNA聚合酶。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否 则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用 术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/ 或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案； 还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不 是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，多聚探针的制备，该制备过程比较繁琐、费时，同时实验耗费也 相对较高。以检测侵染番茄的6种类病毒(PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd)为例，若要制备能够同时检测这6种类病毒的多聚探针，则需要5次 亚克隆，过程十分繁琐。
有鉴于此，发明人经序列比对，找出上述6种番茄类病毒之间的共同序列， 进而设计了一种通用核酸探针，其长度为63个核苷酸(序列表中序列3)，该核 酸探针易于制备，而且该核酸探针可以同时检测侵染番茄的6种不同类病毒 (PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd和CLVd)，从而解决了多聚探针制备 繁琐的技术问题。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述通用核酸探针的制备方法，包括如 下步骤：
(1)经序列比对，找出上述6种番茄类病毒之间的共同序列，设计特异性 引物Pospi6-probe-F1和Pospi6-probe-R1，如序列表序列1，2所示，以含有PSTVd 基因组序列(GenBank:U23058.1)的重组质粒为模板，通过PCR扩增，纯化回 收后克隆至载体pGEM-T，获得用于探针制备的质粒；
(2)用限制性内切酶Spe I消化对所述步骤(1)得到的质粒，使用PCR产 物纯化试剂盒纯化酶切产物；
(3)对所述步骤(2)得到的纯化的线性化质粒，通过体外转录的方法合成 通用核酸探针。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述通用 核酸探针。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种同时检测上述6种番茄类病毒的斑 点杂交方法，包括如下步骤：
(1)转录并获得各个类病毒正链RNA；以及提取待测样品的总RNA，获得 RNA提取物；
(2)将所述RNA加至杂交膜上；
(3)使用上述通用核酸探针和/或试剂盒进行杂交检测。
所述步骤(1)中所述转录获得各个类病毒正链RNA的方法为体外转录法， 提取待测样品的总RNA的方法为Trizol法；
所述步骤(2)中所述杂交温度为50℃～65℃(如50℃、55℃、60℃和65℃， 进一步优选为55℃)，杂交时间为16h。
本发明的又一具体实施方式中，提供PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd 和CLVd的cRNA类病毒特异性探针，所述cRNA类病毒特异性探针的序列如序列 表中序列4-9所示。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述cRNA类病毒特异性探针的制备方 法，包括如下步骤：
使用实验室保存的质粒进行酶切，纯化后的酶切产物按照地高辛标记试剂盒 说明书通过体外转录的方法制备得到PSTVd-cRNA、PCFVd-cRNA、TCDVd-cRNA、 TPMVd-cRNA、TASVd-cRNA和CLVd-cRNA探针。
本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述6种番茄类病毒(PSTVd、PCFVd、TCDVd、TPMVd、TASVd和CLVd)的斑点杂交方法，包括如下步骤：
(1)转录并获得各类病毒正链RNA；以及提取待测样品的总RNA，获得RNA 提取物；
(2)将所述RNA加至杂交膜上；
(3)使用上述cRNA类病毒特异性探针(如PSTVd-cRNA、PCFVd-cRNA、 TCDVd-cRNA、TPMVd-cRNA、TASVd-cRNA和CLVd-cRNA探针中的任意一种或多种) 进行杂交检测；
所述步骤(1)中所述转录获得各个类病毒正链RNA的方法为体外转录法， 提取待测样品的总RNA的方法为Trizol法；
所述步骤(2)中所述杂交温度60～70℃，如60℃、65℃、68℃或70℃，优 选为68℃，杂交时间为16h。
引物及探针
本发明的引物包括上述引物对。本发明的探针包括上述通用核酸探针。
本发明的引物和探针的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增 效果或者探针的杂交效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸 序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷 酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如 将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形成的引物或 探针也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。
核酸探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)可通过进行标记，如采用放射 性同位素标记或非放射性同位素标记；其中，非放射性同位素标记包括生物素、 地高辛或者荧光。基于成本和安全性等综合因素考虑，在本发明的一个具体实施 方式中，选用地高辛对所述核酸探针进行标记。
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)， 经化学方法合成本发明引物组和探针中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知 的任何其它方法来合成寡核苷酸，例如引物和探针。
优选使用PCR法对类病毒基因进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。 术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR、实时PCR、 嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。
在引物、模板DNA(即类病毒基因)和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有 义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使退火、 延伸和变性步骤的循环重复大约30次～50次(例如45次)来进行PCR。
可将能够检测类病毒的本发明核酸探针与样品中的核酸例如类病毒核酸进 行特异性杂交反应，从而实现对扩增产物的定量或定性检测。本发明的探针可通 过标记物进行标记以方便仪器检测，标记物例如包括荧光物质、生物素和地高辛 中的任一种。其中，荧光标记物的实例包括FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、 Dabcyl、ROX、TET、罗丹明、德克萨斯红、HEX、Cyber Green、FAM、MGB和BHQ1 等。优选的荧光标记物可包括但不限于FAM、MGB和BHQ1等。通过采用光学 检测手段，观察源于这类荧光物质的荧光强度，能够以高灵敏度检测被用于荧光 标记的各种荧光物质。标记物还可包括报告荧光基团和淬灭荧光基团。报告荧光 基团可为例如FAM、HEX或TET；猝灭荧光基团可为例如TAMRA、MGB或BHQ1。
样品
本发明所用的样品可以是生物来源、环境来源的一定量的材料。一方面，它 可包括标本或培养物。另一方面，它也可包括但不限于生物学样品和非生物样品 (例如环境样品和工业样品等)。生物学样品可包括采自植物材料，特别是易感 上述类病毒的植物样品，如马铃薯、番茄、辣椒、鳄梨、菊花、柑橘、金鱼花、 血苋和心叶茄等。当然，这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。
从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行 RNA提取，或者使用市售RNA提取试剂进行提取。例如，可使用柱试剂盒进行 提取。
核酸可通过本领域中常规的纯化方法来纯化。如可采用上述酚氯仿抽提法进 一步纯化实现病毒核酸纯化。经过纯化的病毒RNA不含蛋白质、核酸酶和其他 杂质，而且回收率高。
当然也可采用自动化仪器平台等已知其他方式进行核酸提取并纯化。
试剂盒
本发明涉及一种用于检测番茄类病毒的试剂盒，其含有本发明探针的组合。 本发明还涉及引物对或者引物对与探针的组合在制备用于检测样品中类病毒的 试剂盒中的用途。
试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括引物组和/或探针)。 试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、探针、酶等)和/或 支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或 多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一 起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器可含有用于测定的酶，第二个 容器含有引物组、而第三个容器含有探针。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试 剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有探针、反应缓冲液、使用说明书。 试剂盒还可含有用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样 品制备上述番茄类病毒的试剂。
需要说明的是，本发明试剂盒还可包含除了本发明的引物和探针之外的其它 任何引物和/或探针，例如能够有效检测上述类病毒的探针：PSTVd-cRNA、 PCFVd-cRNA、TCDVd-cRNA、TPMVd-cRNA、TASVd-cRNA和CLVd-cRNA。上述cRNA 核酸探针的序列如序列表中序列4、5、6、7、8、9所示。以上实例不能理解为 限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应 理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中出现的 六种番茄类病毒：马铃薯纺锤形块茎类病毒(potato spindle tuberviroid,PSTVd)、 辣椒小果类病毒(pepper chat fruit viroid,PCFVd)、番茄顶缩类病毒(tomato apical stuntviroid,TASVd)、番茄褪绿矮缩类病毒(tomato chlorotic dwarfviroid,TCDVd)、 番茄雄性株类病毒(Tomato planta macho viroid,TPMVd)和金鱼花潜隐类病毒 (Columnealatentviroid,CLVd)。
实施例1
1材料
1.1供试质粒：
含有PSTVd、PCFVd、TASVd、TCDVd、TPMVd和CLVd基因组序列的重组质粒。
1.2主要试剂和仪器：
主要试剂：限制性内切核酸酶和T7/T3/SP6 RNA聚合酶购自宝日医生物公司(TaKaRa)，PCR扩增所需的试剂以及PCR产物纯化试剂盒购自北京全式金生物 技术有限公司(TransGen Biotech)，生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA 凝胶回收试剂盒和质粒DNA小提试剂盒(产自康宁生命科学有限公司)，pGEM-T 载体产自北京普洛麦格生物技术有限公司(Promega)、探针制备相关试剂 (ROCHE)购自北京中源合聚生物科技有限公司。
主要仪器：Bio-Rad PCR仪、KCBIO-2800凝胶成像系统、DYY-6B型稳压电泳 仪、恒温水浴锅、恒温培养箱、AIRTECH SW-CJ-1FD超净工作台、紫外分光光度 计、微量紫外分光光度计ND-1000UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop，America)、核酸分子杂交炉、紫外交联仪。
引物合成及DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2方法
2.1通用核酸探针的制备
其制备流程见图1。
2.1.1用于探针合成的PCR反应引物设计(如序列表序列1，2所示)
Pospi6-probe-F1：GACAGGAGTAATCCCMGCCG
Pospi6-probe-R1：GAGGAAGGAAACCMGAAGA
2.1.2 PCR
利用实验室保存的PSTVd质粒，进行PCR扩增(图3)。
PCR反应体系
PCR反应循环参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃ 延伸15s，循环25次；72℃再延伸5min，4℃保存。PCR产物取2μL，用1.5％ 琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，150V下电泳30min左右， 电泳胶于KCBIO-2800凝胶成像分析仪中照相，待显示扩增目的条带，则使用氯 仿抽提法纯化回收扩增产物。
1)往PCR产物(～50μL)中加DEPC水，至200μL。
2)再加入200μL氯仿，充分混匀，12000rpm，离心15min。
3)吸取上清液，移至新离心管，加入等体积氯仿(～200μL)，充分混匀，12000 rpm，离心15min。
4)离心后，取上清液于新离心管，加入20μL NaAC(3mol/L)。
5)加入2倍体积无水乙醇(400μL)，-20℃静置存放30～60min。
6)12000rpm，离心10min，用70％无水乙醇洗涤沉淀，7500rpm，离心5min。
7)待沉淀干燥后，加DEPC水溶解。
2.1.3克隆和测序
将PCR纯化产物连接至pGEM-T载体，反应体系如下：
连接反应体系
混匀后，4℃过夜连接。将连接产物转入50μL大肠杆菌DH5а感受态细胞， 向离心管中加入700μL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)用移液器轻轻混匀， 37℃、180rpm条件下振荡培养60min，培养后的菌液，5000rpm离心2min， 进行菌落聚集，之后在超净工作台中，去掉部分上层菌液，将剩余菌液混匀，取 100μL涂在LB固体培养基上(含氨苄青霉素)，将培养皿封口后，倒置37℃过 夜培养。挑取单菌落于600μL LB(含氨苄青霉素)培养基中培养。取1μL培养 后的进行菌落PCR，菌液PCR产物用1.5％琼脂凝胶电泳检测，根据电泳结果， 挑选3个阳性克隆，将其菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列 测定，验证连接序列的正确性以及方向性。然后，挑选验证后的菌液进行扩繁培 养，使用质粒DNA小提试剂盒提取质粒，-20℃保存备用。
2.1.4负义通用核酸探针的制备
过程包括酶切、酶切产物纯化、转录和转录产物纯化等步骤。用限制性内切 酶SpeI(TaKaRa)消化重组质粒，把环状质粒切成线状并进行纯化(图4)；以 纯化的线性质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录出地高辛标记的负链RNA。 反应体系如下：
酶切反应体系
轻弹混匀后，37℃温育3h，取2μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析， 在DYY-6B型稳压电泳仪，150V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶 成像分析仪中采集图片，检测是否消化充分。确定酶切充分后(图4)，使用PCR 产物纯化试剂盒纯化酶切产物。以纯化的线性质粒为模板，按照如下体系进行体 外转录：
探针制备体系
混匀后，37℃温育2h，加入2μL不含RNA酶的DNA酶I(ROCHE)，37℃ 温育15min。-80℃保存备用。
2.2类病毒特异性探针的制备
使用含有类病毒全基因组的重组质粒4～5μg进行制备(图5)。具体方法和 步骤同上。使用限制性内切酶Spe I(Takara)消化PSTVd和TCDVd重组质粒，使 用限制性内切酶EcoR I(Takara)消化TASVd、PCFVd、TPMVd和CLVd重组质粒。 TASVd、PCFVd、TPMVd和CLVd重组质粒使用T3 RNA聚合酶体外转录出地高辛 标记的负链RNA，PSTVd和TCDVd重组质粒使用T7 RNA聚合酶体外转录出地高 辛标记的负链RNA。
TASVd、TPMVd、PCFVd、CLVd、PSTVd和TCDVd重组质粒酶切体系如下：
酶切反应体系
轻弹混匀后，37℃温育3h，取2μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析， 在DYY-6B型稳压电泳仪，150V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶 成像分析仪中采集图片，检测是否消化充分。确定酶切充分后(图5)，使用PCR 产物纯化试剂盒纯化酶切产物。以纯化的线性质粒为模板，按照如下体系进行体 外转录：
探针制备体系
混匀后，37℃温育2h，加入2μL不含RNA酶的DNA酶I(ROCHE)，37℃ 温育15min。-80℃保存备用。
2.3制备类病毒线状正链RNA
使用含有类病毒全基因组的重组质粒4～5μg质粒进行制备(图5)。酶切以 及纯化方法方法步骤同上。用限制性内切酶Spe I(Takara)消化PSTVd、PCFVd、 TPMVd、TASVd和CLVd重组质粒，使用限制性内切酶Nco I(Takara)消化TCDVd 重组质粒。PSTVd重组质粒使用T3 RNA聚合酶体外转录出正链RNA，TCDVd重 组质粒使用SP6 RNA聚合酶进行体外转录出正链RNA，PCFVd、TPMVd、TASVd 和CLVd重组质粒使用T7 RNA聚合酶进行体外转录出正链RNA。
TASVd、TPMVd、PCFVd、CLVd、PSTVd和TCDVd重组质粒酶切体系如下：
酶切反应体系
线状正链RNA体外转录体系如下：
体外转录反应体系
混匀后，37℃温育2h，加入2μL不含RNA酶的DNA酶I，37℃温育15min。 -80℃保存备用。
用氯仿抽提法纯化体外转录出的类病毒正链RNA。
1)往体外转录物(～100μL)中加DEPC水，至200μL。
2)再加入200μL氯仿，充分混匀，12000rpm，离心15min。
3)吸取上清液，移至新离心管，加入等体积氯仿(～200μL)，充分混匀，12000 rpm，离心15min。
4)离心后，取上清液于新离心管，加入20μL NaAC(3mol/L)。
5)加入2.5倍体积无水乙醇(500μL)，-20℃静置存放30～60min。
6)12000rpm，离心10min，用70％无水乙醇洗涤沉淀，7500rpm，离心5min。
7)待沉淀干燥后，加无RNA酶的水溶解。
纯化后的体外转录物用变性琼脂凝胶检测。便于定量各个不同类病毒的RNA。 2.4核酸探针的检测灵敏性测定和检测特异性验证
合成的类病毒线状正链RNA的溶液，按照5倍的浓度梯度(浓度梯度依次 为50，5-1，5-2，5-3，5-4，5-5，5-6，5-7)，配制成一系列的溶液，加至杂交膜上。 摸索理想的杂交温度，比较通用核酸探针和特异性探针的检测灵敏度。
2.4.1样品准备及点样：对各个类病毒体外转录出的正链RNA分别以5倍浓度梯 度依次稀释，起始浓度为75ng/μL，稀释终点为5-7，0.96pg/μL；Tirzol法提取植 物样品总RNA(用叶片样品约0.1g，提取RNA后定容至50μL)，进行通用核酸 探针实用性测定。
2.4.2斑点杂交：待尼龙膜干燥后，紫外交联(1200×100uJ/cm2)。将紫外交联后的尼龙膜放入杂交瓶，加入杂交液(每100cm2膜需要12.5mL)，预杂交>1h。 然后加入1μL探针，杂交过夜。弃杂交液，加入足量2×SSC、0.1％SDS溶液，常 温下洗膜2次，每次5min。加入0.1x SSC、0.1％SDS溶液(1～5mL/cm2)，杂交 温度条件下，洗膜2次，每次15min。弃洗涤液，加入15mL封闭剂(1％封闭剂、 0.1mol/L马来酸溶液)常温封闭30min。弃封闭剂，加入15mL抗体液(使用封 闭液稀释1000倍)，常温下反应30min。弃抗体液，加入25mL洗涤液(0.3％吐温20，1mol/L马来酸溶液)，常温，洗膜两次，每次15min。加入25mL检 测缓冲液平衡5min。取出尼龙膜，点样正面朝上，放入杂交袋中。加入适量且 稀释好的CSPD(CSPD用检测液按1:1～3的比例进行稀释后使用)，之后将尼龙膜 密封，反复轻推数次使CSPD在膜上扩散均匀。挤出多余液体，密封杂交膜。最 后Chemidoc化学发光成像，采集图片。
3结果
3.1在不同杂交温度下，对通用核酸探针灵敏性和特异性的鉴定
以6种番茄类病毒共同序列制备一种通用核酸探针进行斑点杂交，在适合的 杂交温度条件下，理论上可以检测以上6种类病毒。
为摸索最适杂交温度，使用4个温度进行杂交，分别为50℃、55℃、60℃ 和65℃。结果表明(图6)，55℃时，检测6种类病毒的杂交信号强于其余杂交 温度。因此，通用探针检测灵敏度最适的杂交温度为55℃。
实验表明，通用核酸探针的检测灵敏度高。该通用核酸探针检测TCDVd和 CLVd终浓度为5-4，PSTVd、PCFVd和TASVd终浓度为5-5，检测TPMVd终浓度为 5-6。结果表明，在55℃最适杂交温度下，检测以上6种类病毒杂交信号较强的 共同RNA浓度为5-3。
3.2通用核酸探针与类病毒特异性探针的检测灵敏度和特异性比较
基于上述结果，在通用探针和各个类病毒特异性探针最适杂交温度的条件 下，使用浓度为5-3(0.6ng/μL)的RNA，比较通用探针和特异性探针的检测灵 敏度和特异性。
55℃时，通用探针对6种类病毒检测结果表明，在同一RNA浓度条件下，6 种类病毒均能检测到(图7)。68℃时，分别用6种类病毒的特异性探针 (PSTVd-probe，PCFVd-probe,TCDVd-probe，TPMVd-probe，TASVd-probe和 CLVd-probe)杂交，结果显示(图7)，每种类病毒特异性探针均不能够检测这6 种类病毒。虽然，每种类病毒的特异性探针能检测除自身外的其他类病毒，但检 测其他类病毒的灵敏度明显低于通用探针。PSTVd的特异性探针仅能同时检测 PSTVd、TCDVd和TPMVd。PCFVd的特异性探针仅能同时检测PCFVd和TPMVd。TCDVd的特异性探针仅能同时检测到TCDVd和TPMVd。TPMVd特异性探针仅能 同时检测到PSTVd、TCDVd、TPMVd和TASVd。TASVd和CLVd的特异性探针仅能 同时检测TASVd、TPMVd和CLVd。
3.3使用通用探针检测番茄样品
上述探针检测灵敏度和特异性的验证实验使用的是体外转录的RNA。而实际 检测中使用的是番茄样品的RNA。考虑到番茄RNA比体外转录的RNA更复杂， 因为番茄RNA含有各种蛋白质和代谢产物。因此，需要验证通用核酸探针检测 番茄样品的可靠性。
提取健康番茄的RNA，与各类病毒体外转录正链RNA混合，测定浓度后， 将各个RNA浓度统一(100ng/μL)，取4μL，依次点在尼龙膜上(图8)，分别 在55℃和68℃杂交温度条件下，依次用通用核酸探针和各类病毒特异性探针进 行杂交。结果表明(图8)，通用核酸探针能同时检测到6种类病毒，且杂交信 号强。各特异性探针虽然除自身外，也能检测到其他一种或几种类病毒，但检测 其他类病毒的杂交信号较弱。综上所述，通用核酸探针能够用于田间样品的检测。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽 管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根 据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的 精神和范围。