一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用
阅读说明：本技术 一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用 (AIE probe, preparation method thereof and application thereof in fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) method ) 是由 唐本忠 伍盛鋆 郭武秀 刘勇 王志明 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种AIE探针及其制备方法与在荧光定量PCR方法中的应用。所述AIE探针不带荧光淬灭基团,所述AIE探针结构如下：其中,AIE表示取代或未取代的聚集诱导发光骨架,LIN表示连接基团,Oligo表示所需要检测目的条带碱基序列寡核苷酸链；AIE探针的连接基团LIN连接在Oligo的3'端或者5'端的核苷酸和AIE活性位点上。本发明的AIE探针无需额外连接淬灭基团,同时AIE材料的聚集诱导发光特性又降低了背景荧光,为难检疾病核酸物质的检出提供了一个很好的解决方案,真正做到荧光定量PCR的实时监控。(The invention discloses an AIE probe, a preparation method thereof and application thereof in a fluorescent quantitative PCR method. The AIE probe does not have a fluorescence quenching group, and the structure of the AIE probe is as follows: wherein AIE represents a substituted or unsubstituted aggregation-induced emission skeleton, LIN represents a connecting group, and Oligo represents an oligonucleotide chain of a target band base sequence to be detected; the linker LIN of the AIE probe is linked to the nucleotide at the 3 'or 5' end of the Oligo and the AIE active site. The AIE probe of the invention does not need to be additionally connected with a quenching group, and simultaneously the aggregation-induced emission characteristic of the AIE material reduces background fluorescence, thereby providing a good solution for detecting nucleic acid substances of diseases difficult to detect and really realizing real-time monitoring of fluorescence quantitative PCR.)
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种AIE探针及其制备方法与在荧光定量PCR方法中的应用。
背景技术
qPCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知基因模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。qPCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且有效解决PCR污染问题，具有特异性强、自动化程度高等特点，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。然而，随着人们对基因检测的时效性、灵敏度、稳定性等方面的要求不断提高，传统的qPCR已经难以满足时代发展的需要，亟待创新与突破。
荧光基团是qPCR有望取得突破性进展的关键环节，其发光特性和发光效率决定了qPCR技术的灵敏度和稳定性。目前常见的荧光基团包括嵌入型荧光染料(SYBR GREEN I)和特异性结合的荧光探针(TaqMan探针、分子信标和蝎型探针等)两种，现已广泛应用于临床疾病诊断、病原微生物鉴定、食品安全、科学研究等领域。SYBR GREEN I是结合于小沟中的双链DNA结合染料，能够特异性地与双链DNA结合并发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBRGREEN I染料不发射任何荧光信号，从而保证与PCR产物的增加完全同步。Taqman探针是两端标记荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸探针，当荧光基团与淬灭基团距离邻近时，会发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，淬灭基团吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，使其发不出荧光；当PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使两种基团分离，从而接收荧光信号。分子信标和蝎型探针等均离不开在荧光信标分子的淬灭上下功夫，面临设计繁琐难实现，背景荧光除不尽等技术问题。
随着现行RT-qPCR的广泛使用，其对于微量、甚至痕量样品检测存在假阴或假阳的弊端逐步显露，其主要原因来自两个方面：第一，诊断标志物相关性或者探针分子设计的准确性，通常由于基因控制本身存在沉默机制或者延迟效应等，导致检测结果可能要借助临床病例和更多实验获得更准确的关系，因此在这方面的工作在近些年成为了该领域的攻关的重点；第二，荧光信号输出过程受到其发光机制的影响而导致强度失真，而此过程多数与负责发光的基元相关，因此，该问题的攻关更具有平台效应，一旦获得攻克，其搭载能力和潜在的商业价值是不言而喻的。
Taqman法是目前qPCR应用的主流方法，也是特异性检出目的基因条带最好的方法(Heid,C AStevens,JLivak,K JWilliams,P M,Real time quantitative PCR.Genomeresearch.1996；986-94.DOI10.1101/gr.6.10.986)。但是，这种策略的繁琐性也是显而易见的，就是荧光基团/淬灭基团的配对性和二者间的链接结构(用于识别的DNA片段等)必须都要经过严格的验证实验和差异性的开发方案，增加了探针的设计难度、合成条件及实验成本；而且通过荧光基团和淬灭基团的FRET作用并不能完全避免背景荧光的干扰，大多数仪器为了降噪都植入了不同的算法使得检测更加准确和稳定，但同时也会带来一定的风险和弊端，从而造成错判的结果(姜文灿,岳素文,江洪,王成彬.TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展[J].临床检验杂志(电子版),2015,4(01):797-805)。因此，发展一种荧光材料能够利用识别过程同时实现荧光开关，则会从本质上解决上述问题，并实现现有平台的技术创新而形成新的分析检测平台。
聚集诱导发光(Aggregation Induced Emission,AIE)概念的提出，从本质上解决了聚集导致荧光淬灭的难题，引起了科学界的广泛关注。大部分具有AIE性质的发光材料都是基于分子内旋转受限(Restriction of intra-molecular rotation，RIR)机制：即溶液态下分子内旋转剧烈，激发态能量多以非辐射形式衰减，导致弱的荧光强度；而在聚集态下，分子内的振转运动受阻，非辐射跃迁形式受到抑制，激发态能量以辐射形式耗散，从而聚集体展现出高强度荧光。
经过全球科学家的热情努力，目前某些固态AIE材料的发光量子效率已提高到100％，发射波长已从紫外光扩展到近红外光，并且开发了多种基于不同开启原理的AIE感应器。由于AIE分子在聚集体下具有较高的灵敏性，而且通过简单的结构调控和修饰，可以实现对某些特定细胞的高选择性识别，因此AIE材料在早期肿瘤特异性检测、动力学观察及诊疗一体化方面的研究逐步受到重视。尽管以上成果都为AIE-dots在特异性体外检测和活体体内示踪的研究奠定了基础，但是大部分仅仅停留在基础科学研究层面，对于临床转化应用相结合的系统性研究工作仍然不足，特别是针对qPCR这一类成熟的临床分子诊断技术的优化与更新。本发明恰好弥补了这些不足，利用了极具特色的AIE特色原理，实现qPCR技术的创新。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种AIE探针及其制备方法与在荧光定量PCR方法中的应用。AIE方法是在PCR的基本扩增原理下，基于聚集诱导发光的原理实现对PCR反应的实时监控。由于寡核苷酸链的强亲水性，AIE探针因体现出极易融于水的特性而没有荧光产生。当PCR反应进行时，AIE探针被酶切降解，游离出来的AIE表现出极强的疏水性，溶解度大大降低并发生聚集，从而产生从无到有的荧光信号(如图1)。荧光信号的累积与DNA扩增产物量呈同步线性关系，可实现对PCR反应的实时监控。配合AIE材料的光稳定性，多次循环结尾的光致激发荧光检测过后对其荧光强度的影响微乎其微，真正意义上做到了qPCR产物的量的实时监控。这是继荧光素替代放射性核素用于分子诊断领域的又一次信号分子的技术革新。
首先本发明解决了AIE材料与核苷酸链(Oligo)的连接问题，因其有3'和5'端的方向性的区别，连接方法和利用到的AIE官能团有所不同。本发明已经实现了AIE材料与寡核苷酸链(Oligo)的偶联，总结出适用于Oligo合成的活性条件以及AIE探针的合成方案。使用AIE分子通过合适的化学的反应连接到Oligo(需检测的目的条带碱基序列)上作为AIE-qPCR探针，其AIE-qPCR探针的最大特点是不限定于连接在Oligo的3'端羟基、5'端磷酸，抑或是碱基和五碳糖，均能AIE-qPCR探针有着良好的qPCR效果。其AIE与Oligo的偶连所用到的化学反应包括但不限于常见的缩合反应、偶联反应、重排反应和Click反应等。
本发明采取的详细技术方案如下：
一种AIE探针，所述AIE探针不带荧光淬灭基团，所述AIE探针结构如下：
其中，AIE表示取代或未取代的聚集诱导发光骨架，LIN表示连接基团，Oligo表示所需要检测目的条带碱基序列寡核苷酸链；AIE探针的连接基团LIN连接在Oligo的3'端或者5'端的核苷酸和AIE活性位点上。
优选的，所述Oligo的3'端或者5'端的核苷酸上的连接位点包括羧基、氨基、巯基和叠氮基活性修饰基团。
优选的，所述连接基团为单键或二价的连接基团。
优选的，所述AIE分子包含如下结构中的至少一种：
上述结构式中，R1，R2，R3，R4，R5，R6各自独立地选自氢、卤素、羰基、酰胺基、磷氧基、羧基、取代或未取代的C3-C30氮杂芳基、取代或未取代的C6-C30含氰基芳基、取代或未取代的C3-C30含氰基杂芳基、取代或未取代的C6-C30含卤素芳基、取代或未取代的C3-C30含卤素杂芳基、取代或未取代的C1-C20烷基、取代或未取代的C1-C20烷氧基、取代或未取代的C2-C20烯基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C3-C30杂芳基中的任意一种；
n取值为1、2、3、4。
进一步优选的，所述AIE分子选自TPE或TPE衍生物中的至少一种。更优选的，AIE化合物的结构如下：
优选的，所述LIN是亚烷基链，取代基取代的亚烷基链，多个亚烷基链或取代基取代的亚烷基链通过-O-、-S-、-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OOC-、-NH-、亚炔基、亚烯基、亚芳基、亚杂芳基、亚环烷基中的一个或多个连接的基团。
进一步优选的，所述取代基取代的亚烷基链被一个或多个取代基取代，所述亚烷基链为直链或支链。
上述AIE探针的制备方法，包括以下步骤：
先按照所需探针的碱基序列合成好Oligo；
然后在Oligo的3'端或者5'端的核苷酸上引入修饰基团，包括羧基、氨基、巯基和叠氮基；
最后，AIE通过与修饰基团进行缩合反应、偶联反应、重排反应和Click反应得到探针。
优选的，所述AIE具有羧基、叠氮基官能团。
进一步优选的，所述AIE分子结构式为：
上述AIE探针在荧光定量PCR方法中的应用。
优选的，所述荧光定量PCR方法用于核酸检测。
本发明AIE分子通过羧基活化与氨基缩合等方式与Oligo偶连。所述Oligo为所需要检测目的条带碱基序列寡核苷酸链，其根据不同的检测对象基因序列而定，其设计原理与qPCR一致，但限制条件比Taqman法更少，只需要考虑其特异性即可。因不需额外在Oligo上连接淬灭基团，没有了基于FRET原理的碱基长度限制。
与现有技术相比，本发明的优点和效果在于：
本发明的探针设计更简易、合成更简单成本更低。
本发明公开了一种基于AIE分子的新型AIE-qPCR技术平台、AIE探针及其制备方法与应用，恰好弥补了传统qPCR法的背景信号高、探针设计困难、荧光基团与猝灭基团的选择困难等问题；利用了极具特色的AIE特色原理，实现qPCR技术的创新，降低了探针序列设计难度，为难检疾病核酸物质的检出提供了一个很好的解决方案，实现更优的结果展现，丰富了分子检测手段，推动了生物技术领域的发展。
附图说明
图1为本发明AIE-qPCR技术反应原理图。
图2为实施例1中优选的AIE母核分子。
图3为实施例1中AIE探针的结构示意图。
图4为实施例1的AIE探针的质谱数据图。
图5为实施例2中AIE探针的荧光释放前后荧光强度对比图。
图6为实施例4中AIE-qPCR的原始荧光曲线。
图7为实施例5中的AIE-qPCR产物的荧光光谱图。
图8为实施例6中的AIE-qPCR方法的重复性实验的扩增曲线。
图9为实施例7中的AIE-qPCR方法的标准曲线。
图10为实施例8中HBV阳性临床样本的扩增曲线。
图11为实施例9中AIE探针2的结构示意图。
图12为实施例10中AIE探针3的AIE母核分子。
图13为实施例10中AIE探针3的结构示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明的AIE探针在荧光性能上优于现在的传统荧光染料，背景更低、信号更强，这些特质应用在qPCR上无异于如虎添翼，使得AIE-qPCR技术更上一层楼。多年以来AIE的发展积累了大量的材料分子，其荧光性能均很优越，同时具备各种反应活性基团改造的能力。
本发明实施例新型的AIE-qPCR方法，其qPCR体系组成包括AIE探针、引物、dNTP、底物模板和水。
其中，AIE探针作为AIE-qPCR技术的主要成分，主要作用是通过AIE分子从溶解态的无荧光到聚集态的荧光点亮来示踪qPCR反应目的基因的扩增过程，从而实现与传统qPCR一样的功能，但本质又不一样的创新性技术。
在一优选实施方式中，AIE分子选自TPE及其衍生物中的至少一种。
实施例1
一种基于AIE分子的AIE探针的制备方法如下，AIE分子选自TPE及其衍生物中的TPE-COOH(如图2)。先根据所需序列合成Oligo，然后通过适用于Oligo的固相亚磷酰三脂法的Amino-C6 Linker来修饰Oligo的5'端，最后将已经用NHS活化后的TPE-COOH与氨基的缩合反应偶连到Oligo上。(如图3)根据乙型肝炎病毒(HBV)的S基因设计了qPCR的引物和探针的碱基序列，并且合成AIE探针1，引物和探针序列如下(5'→3')：
上游引物：CAACATCAGGATTCCTAGGACC
下游引物：GGTGAGTGATTGGAGGTTG
探针1：AIE-LIN-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC
本发明还对该AIE探针1进行了质谱表征(如图4)。由于采用的是自动一体化的固相合成仪，判断碱基序列以及修饰的AIE是否连接成功，只需用产物与上一步产物的质谱数据对照，根据分子量的增加与否即可判断。探针的整体分子量与结构相符合，在Oligo序列与AIE探针1的分子量比对中刚好增加了AIE与LIN的部分，反应前后的对照结果可判断该AIE探针1合成成功。
实施例2
在qPCR反应的浓度条件下，用DNA水解酶(37℃，1h)验证了AIE探针1的荧光释放效果，在最适激发波长的条件下(Ex＝460nm)用酶标仪检测荧光发射光谱(如图5)。实施例2中的AIE探针1(探针浓度为1μM)在游离聚集态(AIE探针1与DNA酶作用降解)和溶解态(AIE探针1)，每孔体积为100μL，DNA酶作用后荧光增强了20倍(FI1＝10000/FI0＝500)，其溶解态具有较低的背景荧光强度。
实施例3
优化了AIE-qPCR反应体系，反应总体积为20μL，其中上游引物和下游引物各0.4μL(引物的工作浓度为2μM)、AIE探针0.2μL(探针的工作浓度为1μM)、待测样品/核酸模板4μL，剩余体积用双蒸水补齐。最优选择体积为20μL，包括但不限于10μL、50μL、100μL等体积。
实施例4
设计了含有HBV基因的质粒，并且用该质粒作为qPCR实验的阳性DNA模板，qPCR实验中的阴性对照为无DNA模板的双蒸水。使用实施例1所设计的引物和探针可以扩增出120bp的DNA产物条带。(如图6)使用美国ABI的QuantStudio 5荧光定量PCR仪来进行qPCR实验。qPCR程序为两步法，参数设置为：第一步：95℃10min。第二步：95℃15s；60℃20s；40个循环。荧光信号在每个循环结束时检测，检测的信号通路为：x1/m4。
实施例5
按照实施例1-4的方法，设置多组实验对照，使得总反应体积大于100μL，待qPCR实验结束后收集反应产物，取100μL的产物用酶标仪检测其460nm激发波长下的荧光发射光谱，用于qPCR酶的5'→3'酶切活性与DNA酶切的对比检验(如图7)。qPCR高温循环反应体系对AIE探针的背景荧光影响不大，在峰值强度上阳性扩增比阴性扩增的荧光强了2-3倍。
实施例6
按照实施例1-4的方法，进行了96个复孔的qPCR实验，结果显示qPCR的成功率百分之百，并且扩增曲线表现出良好的均一性和稳定性(如图8)。同时还做了阴性和阳性对照实验，AIE-qPCR方法是可行的且AIE探针的表现稳定，在qPCR过程中酶对其作用与传统荧光材料没有任何区别，对qPCR反应的本身没有任何影响。同时在阴性对照实验中，qPCR扩增程序的温度变化对AIE探针影响不大，一直都保持着很低的背景荧光。
实施例7
按照实施例1-4的方法，用质粒模板倍比稀释(1:10)成5个浓度梯度分别作为AIE-qPCR方法中的样品模板，每个浓度梯度做三组重复对照，进行AIE-qPCR实验制作标准曲线(如图9)。结果显示，标准曲线有很高的回归曲线拟合度，扩增效率也达到了qPCR技术的要求，在qPCR扩增的过程中对数增长期是具有良好的线性相关性的，AIE材料在荧光定量PCR的应用上开辟了一个新的方法。
实施例8
按照实施例1-4的方法，选取3个HBV阳性的血清，进行AIE-qPCR实验(如图10)，扩增曲线结果显示3个临床样本均为阳性，循环数在6-12次就可以被检出。基于AIE探针的荧光定量PCR方法可以运用到乙肝病毒的核酸检测上。
实施例9
一种基于AIE分子的AIE探针的制备方法如下，该方法采用不带荧光淬灭基团的AIE探针，AIE分子选自TPE衍生物中的TPE-COOH(如图2)，连接在Oligo的3'端。按照实施例1的合成方法在Oligo的3'端进行氨基修饰，最后将已经用NHS活化后的TPE-COOH与氨基的缩合反应偶连到Oligo的3'端上(如图11)。探针2序列为：CAACATCAGGATTCCTAGGACG。
实施例10
一种基于AIE分子的AIE探针的制备方法如下，该方法采用不带荧光淬灭基团的AIE探针，AIE分子选自TPE衍生物中的叠氮基甲基TPE(如图12)，连接在Oligo的5'端。按照实施例1的合成方法在Oligo的5'端进行氨基修饰，与活化羧基的连接链羧基端缩合，最后连接链的另一端通过点击反应将叠氮基甲基TPE偶连到Oligo的5'端上(如图13)。探针3序列为：GGTGAGTGATTGGAGGTTC。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限定。凡本领域的技术人员利用本发明的技术方案对上述实施例作出的任何等同的变动、修饰或演变等，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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