核酸纳米凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 核酸纳米凝胶及其制备方法和应用 (Nucleic acid nanogel and preparation method and application thereof ) 是由 黄晋 王姣丽 王柯敏 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种核酸纳米凝胶及其制备方法和应用。核酸纳米凝胶由三条带有粘性末端的核酸链通过退火杂交形成Y-motif；三条带有粘性末端的核酸链为Y1、Y2和Y3；Y1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；Y2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；Y3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的核酸纳米凝胶内化到细胞中,细胞内microRNA通过立足点(toehold)介导的链置换反应选择性地结合到Y1的非配对toehold区域,随后内源性高丰度能量分子ATP特异性地触发ATP适体的构象转换,形成稳定的发夹结构并从核酸纳米凝胶中解离出来,用于制备活细胞内microRNA的放大成像检测试剂盒。(The invention discloses a nucleic acid nanogel and a preparation method and application thereof. The nucleic acid nanogel is formed by annealing and hybridizing three nucleic acid chains with sticky ends to form Y-motif; the three nucleic acid chains with sticky ends are Y1, Y2 and Y3; the DNA sequence of Y1 is shown in SEQ ID NO. 1; the DNA sequence of Y2 is shown in SEQ ID NO. 2; the DNA sequence of Y3 is shown in SEQ ID NO. 3. The nucleic acid nanogel is internalized into cells, intracellular microRNA is selectively combined to an unpaired toehold region of Y1 through a foothold (toehold) mediated strand displacement reaction, then endogenous high-abundance energy molecule ATP specifically triggers the conformation transformation of an ATP aptamer, a stable hairpin structure is formed and is dissociated from the nucleic acid nanogel, and the nucleic acid nanogel is used for preparing an amplification imaging detection kit of the intracellular microRNA.)
技术领域
本发明涉及核酸纳米凝胶技术领域，尤其涉及核酸纳米凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
DNA作为遗传信息载体和蛋白质编码器，在生命过程中将遗传密码转化为蛋白质并进一步调节多种细胞功能。除了其生物学功能外，基于Watson-Crick碱基互补配对原则，DNA还可以作为构建不同尺寸，不同形状的DNA纳米结构和DNA杂交反应网络的通用材料。在DNA纳米技术中，基于DNA纳米结构的核酸探针在生物传感、生物成像、药物传递、细胞生物学和材料制造等领域显示出巨大的应用潜力。
核酸探针在细胞内核酸检测中具有独特的优势。然而，细胞内化效率低和探针稳定性差仍然是核酸探针应用于活细胞的主要挑战之一。尽管目前报道许多利用有机或无机纳米材料组装核酸探针可以极大地提高核酸探针的细胞内化效率，但是有机或无机纳米材料的引入可能会对活细胞产生不可避免的毒性，甚至影响到细胞内靶RNA的表达。DNA自组装形成的纳米结构具有优异的生物相容性、良好的细胞膜穿透能力和机械稳定性等优异特性，在生物技术和生物医学中应用广泛。但是大多数DNA纳米结构的制备效率低且耗时长，并且价格昂贵(因为需要大量的长链DNA)。此外，核酸探针和纳米结构的组装效率很低。因此，构建一种成本低廉，易于制备，生物安全性高，细胞内吞效率高，生物相容性好，稳定性好的核酸纳米探针仍然是迫切需要的。
RNA作为一种重要的核酸物质，具有转移遗传信息、调节生物代谢并反映细胞状态的作用，可以作为基因表达的关键控制因子，在多种生命过程中发挥重要作用。其中microRNA是一类小的单链非编码RNA，与其他类型的RNA相比，microRNA的序列较短，易降解，丰度低，同家族之间序列相似度高。研究表明，microRNAs的异常表达与多种人类疾病密切相关，如肿瘤的发生、发展、转移以及抗药性等，能够作为癌症等疾病诊断和预后的生物标志物。因此，灵敏并准确的microRNA检测为疾病早期诊断、疾病结果预测、治疗风险评估、治疗反应预测提供重要信息。因此，检测肿瘤相关microRNA在生物学和疾病研究中具有重要意义。microRNA的传统检测方法有：实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、微阵列芯片、Northern印迹法、荧光原位杂交技术等。这些传统的检测方法只能用于死细胞体系或者体外实验，并且只能反映大量细胞的平均值，无法体现细胞间差异，不能用于活细胞内对microRNA进行原位检测。因此，发展一些用于活细胞内microRNA原位检测技术是十分有必要的。而常见的“一个靶标对应一个信号输出”模式灵敏度低，不适用于活细胞内低丰度microRNA的检测。因此，开发有效的“一对多信号”放大策略，用于活细胞中低丰度microRNA的高灵敏原位成像是非常必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中核酸探针进入细胞效率低的不足，提供的一种简单的核酸纳米凝胶，该核酸纳米凝胶具有优异的生物相容性，良好的抗酶切稳定性和细胞内吞效率高等优点。该核酸纳米凝胶制备过程简单、操作方便。
为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸纳米凝胶，所述核酸纳米凝胶由三条带有粘性末端的核酸链通过退火杂交形成Y-motif；所述三条带有粘性末端的核酸链为Y1、Y2和Y3；
所述Y1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述Y2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述Y3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
上述的核酸纳米凝胶，进一步的，所述Y1的5’端用Cy3荧光基团标记；所述Y1的3’端用Cy5荧光基团标记。
上述的核酸纳米凝胶，进一步的，两个或两个以上的核酸纳米凝胶通过Y-motif核酸链的粘性末端连接，形成-(Y-Y)n-。
基于一个总的技术构思，本发明提供了一种上述的核酸纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将Y1、Y2和Y3等浓度共混得到混合溶液；
S2、将混合液置于95℃加热5min，然后冷却至室温，得到Y-motif。
上述的制备方法，进一步的，所述制备方法还包括：
S3、将N个Y-motif共混，置于95℃加热5min，然后冷却至室温，得到核酸纳米凝胶-(Y-Y)n-。
上述的制备方法，进一步的，所述S1具体为：
将Y1、Y2和Y3等浓度共混于缓冲液和氯化镁溶液中得到混合溶液。
上述的制备方法，进一步的，所述Y1、Y2和Y3的浓度均为5μM。
上述的制备方法，进一步的，所述缓冲液为10mM磷酸缓冲液。
上述的制备方法，进一步的，所述氯化镁溶液的浓度为5mM。
基于一个总的技术构思，本发明提供了一种上述在制备用于活细胞内microRNA的放大成像检测试剂盒中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：将核酸纳米凝胶与活细胞共混，通过活细胞的内吞作用，将核酸纳米凝胶内化到细胞中，通过检测核酸纳米凝胶的荧光信号变化来检测活细胞内microRNA。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种核酸纳米凝胶，由三条带有粘性末端的Y-motif核酸链通过退火杂交形成，与传统方法相比，该核酸纳米凝胶通过简单的三条Y-motif(Y1、Y2和Y3)的核酸链杂交形成，避免了复杂的序列设计和需要大量长链DNA的缺点。自组装形成的核酸纳米凝胶具有较高的细胞内化效率、良好的生物相容性和稳定性。核酸纳米凝胶利用细胞内源性的ATP驱动链置换放大反应用于细胞内microRNA的放大检测，无需外加任何催化燃料。基于FRET的比率型信号的产生可以避免假阳性信号，减小系统波动的影响，能广泛应用于基础生物医学研究、疾病诊断和治疗。
(2)本发明提供了一种核酸纳米凝胶的制备方法，其制备过程简单、操作方便。
(3)本发明提供了一种核酸纳米凝胶的制备用于活细胞内microRNA的放大成像检测试剂盒中的应用，核酸纳米凝胶内化到细胞中，细胞内特异性microRNA通过立足点(toehold)介导的链置换反应选择性地结合到Y1的非配对toehold区域。随后，内源性高丰度的能量分子ATP可以特异性地触发ATP适体的构象转换，形成稳定的发夹结构并从纳米球中解离出来。同时，microRNA可以被释放并在接下来的反应中重复使用。最终，发夹结构使供体和受体非常接近，产生了高的FRET荧光效率，避免了由于细胞内复杂环境降解核酸探针产生的“假阳性”信号。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中核酸纳米凝胶的制备示意图。
图2为本发明实验一中为核酸纳米凝胶的制备凝胶电泳图。
图3为本发明实验二中核酸纳米凝胶的Zeta-size粒径图。
图4为本发明实验三中核酸纳米凝胶的原子力表征图。
图5为本发明实验四中核酸纳米凝胶的透射电镜图。
图6为本发明实验五中核酸纳米凝胶特异性响应的凝胶电泳分析及Zeta-size粒径表征。
图7为本发明实验六中核酸纳米凝胶特异性响应的荧光共振能量变化情况。
图8为本发明实验七中核酸纳米凝胶与“Y”字型探针的抗酶切稳定性比较。
图9为本发明实验八中核酸纳米凝胶的MCF-7细胞MTT毒性图。
图10为本发明实验九中核酸纳米凝胶与“Y”字型探针细胞内吞对比图。
图11为本发明实验十中核酸纳米凝胶的缓冲溶液体系的优化结果。
图12为本发明实验十一中核酸纳米凝胶的镁离子浓度的优化结果。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的核酸纳米凝胶，由三条带有粘性末端的Y-motif核酸链通过退火杂交形成；三条带有粘性末端的Y-motif核酸链为Y1、Y2和Y3；
Y1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；具体为： 其中，加粗字体部分为回文序列，单下划线部分为三磷酸腺苷的核酸适配体，双下划线部分为非配对toehold区域。
所述Y2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；具体为：AGCTCGCGCTCACGGCGAATGACTCGTACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC。
所述Y3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：AGCTCGAGCTTCGACTATCAGACTGATCATTCGCCGTG。
一种本实施例的核酸纳米凝胶的制备方法，参见图1，包括以下步骤：
(1)Y1、Y2和Y3等浓度(终浓度为5μM)共混得到混合溶液。
(2)将混合液置于95℃加热5分钟，然后缓慢地冷却至室温，即得到Y-motif。
实施例2：
一种本发明的核酸纳米凝胶，由两个实施例1的核酸纳米凝胶Y-motif通过Y型结构的粘性末端(回文序列)两两杂交形成核酸纳米探针Y-Y。
一种本实施例的核酸纳米凝胶的制备方法，参见图1，包括以下步骤：
(1)将两个实施例1的核酸纳米凝胶Y-motif等浓度(终浓度为5μM)共混得到混合溶液。
(2)将混合液置于95℃加热5分钟，然后缓慢地冷却至室温，即得到核酸纳米凝胶Y-Y。
实施例3：
一种本发明的核酸纳米凝胶，由三个实施例1的Y-motif通过Y型结构的粘性末端(回文序列)两两杂交形成核酸纳米探针Y-Y-Y。
一种本实施例的核酸纳米凝胶的制备方法，参见图1，包括以下步骤：
(1)将三个实施例1的Y-motif等浓度(终浓度为5μM)共混得到混合溶液。
(2)将混合液置于95℃加热5分钟，然后自然缓慢地冷却至室温，即得到核酸纳米凝胶Y-Y-Y。
按照本发明的方法，可以有无限个实施例1的Y-motif两两杂交，形成核酸纳米探针-(Y-Y)n-。
实验一：核酸纳米凝胶的凝胶电泳图表征
配制质量浓度比为2％的琼脂糖溶液，在微波炉中加热溶解。取60mL溶液倒入模具中，插上梳子，放置冷却1h后，凝胶凝固。然后将制好的琼脂糖胶放入电泳槽中，倒入1×TBE等待上样，取10μL反应样品液，2μL 6×Loading buffer，2μL SYBR Gold混合均匀，然后取10μL混合液加入到凝胶孔中，加上90V电压，约1h，待蓝色的溴酚蓝快要移到胶的底端时，用凝胶成像仪进行拍照。
凝胶成像结果如图2所示，泳道1，2，3为Y1，Y2和Y3，泳道4为Y1，Y2和Y3退火形成的核酸纳米凝胶，泳道4形成了更大分子量的条带，表明了纳米凝胶的成功制备。
实验二：考察实施例1的核酸纳米凝胶的Zeta-size水合粒径。
室温条件下，用Zeta-Size测定核酸纳米凝胶的水合粒径，折射介质设为水，测定三次，取平均值作图。
核酸纳米凝胶的粒径测定结果如图3所示，所制备的核酸纳米凝胶的粒径约为180nm(水合粒径偏大)。
实验三：用原子力显微镜观察实施例1的核酸纳米凝胶的尺寸形貌。
首先制备20nM(50μL)DNA样本。将透明胶带从云母上轻轻撕下，除去一层云母，得到一个新鲜的云母表面。然后滴加40μL 100mM NiCl2缓冲液在云母表面孵育10min，然后取1mL超纯水冲洗云母表面，并立即吹掉水，以清洁云母表面，用洗耳球吹掉溶液。接着取20μLDNA样品滴加在云母表面孵育10min。孵育完成后，用洗耳球吹掉溶液。然后，立即在云母表面中间滴加3mL超纯水，并立即吹净水，以清洁云母表面。然后用原子力显微镜的空气扫描模式对样品进行成像。
所得实验结果如图4所示，实施例1的核酸纳米凝胶大小约为150nm。
实验四：电子透射显微镜观察实施例1的核酸纳米凝胶的尺寸形貌
将实施例1中制备好的核酸纳米凝胶样品滴到铜网上沉积15min，戳破液滴，然后滴加1％乙酸铀溶液染色1min，用滤纸吸干铜网上的溶液，风干，最后进行透射电镜拍摄。
所得实验结果如图5所示，实施例1的核酸纳米凝胶呈圆球状，尺寸大小约为150nm左右。
实验五：考察实施例1的核酸纳米凝胶对microRNA-21和ATP的响应情况。
在制备好的纳米凝胶中分别加入microRNA-21、ATP以及microRNA-21和ATP的混合物，用2％琼脂糖对反应结果进行分析，电泳结果如图6a所示，泳道1为核酸纳米凝胶；泳道2为核酸纳米凝胶中加入microRNA-21；泳道3为核酸纳米凝胶中加入ATP，对比于泳道1无明显变化；而泳道4中同时加入了microRNA-21和ATP后，条带明显下移，同时测定了该反应条件下的水合粒径，结果如图6b所示，当microRNA-21和ATP同时存在的条件下，核酸纳米凝胶的水合粒径变小，这些结果均表明了该核酸纳米凝胶的解组装。
实施例4：
一种本发明的核酸纳米凝胶，由三条带有粘性末端的核酸链通过退火杂交形成；三条带有粘性末端的核酸链为Y1、Y2和Y3；
Y1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；具体为：Cy3-AGTACGCGTACTATCAGGCAAGCTACTTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTCAACATCAGTCTGATAGTACG-Cy5。
所述Y2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；具体为：AGCTCGCGCTCACGGCGAATGACTCGTACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC。
所述Y3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：AGCTCGAGCTTCGACTATCAGACTGATCATTCGCCGTG。
其制备方法与实施例1一致。
实验六：考察实施例4的核酸纳米凝胶的特异性响应情况。
在实施例4的核酸纳米凝胶中，分别加入microRNA-429和ATP的混合物、let-7a和ATP的混合物、microRNA-200b和ATP的混合物、microRNA-21和ATP的混合物，考察荧光共振能量转移信号(FRET)的变化。
图7为核酸纳米凝胶特异性响应的荧光共振能量变化情况。当加入其它核酸标志物或ATP类似物时，FRET无明显变化，当同时加入microRNA-21和ATP时，FRET信号明显增强。表明了该核酸纳米凝胶具有很好的特异性，并能特异性地响应microRNA-21和ATP。
实验七：考察实施例4的核酸纳米凝胶的抗酶切稳定性情况。
将实施例4的核酸纳米凝胶和“Y”字型探针分别加入10％的胎牛血清移至比色皿中，保持温度稳定在37℃，连续反应6h，在此期间每隔1h记录一次荧光强度。激发波长设为530nm，收集530-800nm范围内的荧光光谱，取样品在570nm和680nm处的荧光强度F570和F580，并取F680比上F570的比值作图，所有实验均重复3次。
图8为核酸纳米凝胶与“Y”字型探针的抗酶切稳定性比较。从图中可以看出：随着时间的延长，核酸纳米凝胶的荧光共振能量信号无明显变化，然而“Y”字型探针的荧光共振能量转移信号明显下降，由于“Y”字型探针受到核酸酶的降解，供体荧光基团和受体荧光远离。表明该核酸纳米凝胶具有较好的抗酶切稳定性。
实验八：考察实施例4的核酸纳米凝胶对MCF-7细胞毒性实验。
将MCF-7细胞接种到96孔板上，每个孔约1×105个细胞。在细胞培养箱中培养24h后，加入100μL含不同浓度的实施例4的核酸纳米凝胶(10，50，100，200，400nM)的培基孵育6h，之后弃去培基，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液孵育4h。孵育结束后，弃去孔中液体，加入150μL DMSO后在室温下震荡15min。利用酶标仪测量490nm处的吸收值。
图9为核酸纳米凝胶的MCF-7细胞MTT毒性图。从图中可以看出MCF-7细胞与400nM的核酸纳米凝胶孵育6h，细胞的存活率达到95％以上，表明该核酸凝胶对细胞几乎无毒，证实了核酸纳米凝胶优异的生物相容性。
实施例5
一种实施例4的核酸纳米凝胶在活细胞内microRNA的放大成像中的应用。
具体的反应过程为：核酸纳米凝胶内化到细胞中，细胞内特异性microRNA通过立足点(toehold)介导的链置换(TMSD)选择性地结合到Y1的非配对toehold区域。随后，内源性高丰度的ATP作为能量，可以特异性地触发ATP适体的构象转换，形成稳定的发夹结构并从纳米球中解离出来。同时，microRNA可以被释放并在接下来的反应中重复使用。最终，发夹结构使供体和受体非常接近，产生了高的FRET效率，避免了由于细胞内复杂环境降解核酸探针产生的“假阳性”信号。
实验九：核酸纳米凝胶与“Y”字型探针(是不包含回文序列粘性末端部分)细胞内吞效率。
将MCF-7细胞接种到激光共聚焦皿中培养24h，将制备好的核酸纳米凝胶和”Y”字型探针分别加入到共聚焦皿中与MCF-7细胞孵育4h，用PBS缓冲液洗涤三遍弃去多余探针。最后将细胞置于配备561nm Ar+激光器的激光共聚焦显微镜下观察成像。在Olympus IX-70倒置显微镜下用Olympus FluoView 500共聚焦扫描系统观察细胞，在561nm激发下，收集570nm-620nm和663nm-738nm的发射波长。
图10为核酸纳米凝胶与“Y”字型探针细胞内吞对比图。如图10所示，与核酸纳米凝胶孵育的细胞可以观察到明显的绿光和红光，而与“Y”字型探针孵育的细胞只有极微弱的绿光，这些结果表明该核酸纳米凝胶能够很好地被细胞内吞，提高了探针进入细胞的效率。
实施例6：
一种本发明的核酸纳米凝胶，由三条带有粘性末端的核酸链通过退火杂交形成；三条带有粘性末端的核酸链为Y1、Y2和Y3；
Y1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；具体为：Cy3-AGTACGCGTACTATCAGGCAAGCTACTTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTCAACATCAGTCTGATAGTACG-Cy5。
所述Y2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；具体为：AGCTCGCGCTCACGGCGAATGACTCGTACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC。
所述Y3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：AGCTCGAGCTTCGACTATCAGACTGATCATTCGCCGTG。
一种本实施例的核酸纳米凝胶的制备方法，参见图1，包括以下步骤：
(1)Y1、Y2和Y3等浓度(终浓度为5μM)共混于10mM磷酸缓冲液和5mM氯化镁溶液中得到混合溶液。
(2)将混合液置于95℃加热5分钟，然后缓慢地冷却至室温，即得到核酸纳米凝胶Y-motif。
实验十：考察核酸纳米凝胶探针检测缓冲体系的影响
为了提高核酸纳米凝胶探针检测microRNA的信背比，分别将Y1、Y2和Y3等浓度(终浓度为5μM)共混于10mM的Tris-HCl、PBS、SPSC和HEPES四种缓冲体系，其余步骤与实施例5一致。将各种实验条件下的溶液分为两组，一组加入靶标microRNA-21(信号)，一组不加靶标microRNA-21作为对照(背景)，考察不同缓冲体系的荧光结果。检测时激发波长设为530nm，收集530-800nm范围内的荧光光谱，
结果参见图11。从图中可以看出，不同的缓冲体系对检测的信背比有一定影响，其中PBS缓冲液有利于提高核酸纳米凝胶探针检测microRNA的信背比。
实验十一：考察核酸纳米凝胶探针检测反应体系中镁离子浓度的影响
为了进一步提高核酸纳米凝胶探针检测microRNA的检测性能，将Y1、Y2和Y3等浓度(终浓度为5μM)共混于10mM磷酸缓冲液和浓度分别为2mM，5mM，10mM，12mM的氯化镁溶液中，其余步骤与实施例5一致。将各种实验条件下的溶液分为两组，一组加入靶标microRNA-21(信号)，一组不加靶标microRNA-21作为对照(背景)。检测时激发波长设为530nm，收集530-800nm范围内的荧光光谱，
结果参见图12。从图中可以看出，不同浓度的氯化镁溶液对检测性能有一定影响，其中5mM的氯化镁溶液有利于提高核酸纳米凝胶探针的检测性能。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 核酸纳米凝胶及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 1
agtacgcgta ctatcaggca agctacttac ctgggggagt attgcggagg aaggttcaac 60
atcagtctga tagtacg 77
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 2
agctcgcgct cacggcgaat gactcgtacc ttcctccgca atactccccc 50
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 3
agctcgagct tcgactatca gactgatcat tcgccgtg 38
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