一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法 (Eight-color fluorescence spectrum calibration reagent and preparation method thereof ) 是由 姜伯玮 张黎明 王峰 荣海博 赵怡鹤 张涛 金川 陈力 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法,采用人工设计合成的8个模板DNA,每个模板DNA模板分别包含1对引物的结合位点,并根据每个片段的预设长度,可实现片段长度与荧光精确控制。每对引物中的上游引物的5’端分别采用8种不同荧光标记,在一个特定反应体系内进行复合扩增,可同时获得含有八种荧光产物的荧光光谱校准试剂,无需进行单色荧光片段的混合和调配即可直接应用于荧光光谱校准。该方法极大的简化了荧光标准物的制备工艺流程,避免了复杂繁琐的操作。本发明的制备方法可以稳定的获得该标准物质,具有效率高,操作简便的特点。(The invention discloses an eight-color fluorescence spectrum calibration reagent and a preparation method thereof, 8 template DNAs which are artificially designed and synthesized are adopted, each template DNA template respectively comprises binding sites of 1 pair of primers, and the accurate control of the length of a fragment and fluorescence can be realized according to the preset length of each fragment. The 5' end of the upstream primer in each pair of primers respectively adopts 8 different fluorescent labels, composite amplification is carried out in a specific reaction system, the fluorescence spectrum calibration reagent containing eight fluorescent products can be obtained simultaneously, and the fluorescence spectrum calibration reagent can be directly applied to fluorescence spectrum calibration without mixing and blending monochromatic fluorescent fragments. The method greatly simplifies the preparation process flow of the fluorescent standard substance and avoids complex and fussy operation. The preparation method can stably obtain the standard substance and has the characteristics of high efficiency and simple and convenient operation.)
技术领域
本发明涉及DNA检测技术领域，具体涉及一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法。
背景技术
DNA检测技术已成为现代法庭科学领域最为重要的技术手段之一，是处置各类案件、重特大事故及自然灾害等重大事件中最有效的个体识别工具。DNA检验设备及DNA检测试剂是DNA检测工作得以开展的两个核心要素。
在国内DNA检测实验室最常见的检测设备主要是3130、3130xl、3500、3500xl型遗传分析仪。国际法庭科学DNA检测领域的仪器设备经历了四色、五色至六色的发展历程。
最早用于DNA检测的DNA试剂体系是英国法庭科学服务部(FSS)建立的TH01、FES\FPS、vWA和F13A1四位点复合扩增系统，被称为第一代复合扩增体系，匹配概率接近万分之一。1994年，FSS发展了第二代复合扩增系统(SGM)，包括六个多态性STR基因座和一个性别基因，分别是TH01、vWA、FGA、D8S1179、D18S51、D21S11和Amelogenin(牙釉质基因)，匹配概率接近五千万分之一。1998年，在此基础上又增加了四个新STR基因座：D19S433、D2S1338、D16S539和D3S1358，匹配概率可达到百亿分之一。美国FBI为了满足办案需要建立了联合DNA索引系统(Combined DNA Index System，CODIS)，该系统由13个STR基因座组成，分别为TPOX、D3S1358、TH01、vWA、FGA、D7S820、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、CSF1PO、D16S539和D8S1179，无关个体的平均随机匹配概率大于万亿分之一。2001年，美国ABI公司推出AmpFlSTR Identifiler试剂盒，首次使用五色荧光检测系统，其中四色标记PCR产物，剩余一种荧光颜色用于检测内标，以校正PCR产物片段的电泳迁移。2013年后，美国ABI公司陆续推出了24个位点的六色荧光DNA检验试剂盒Globalfiler，包含25个位点的试剂盒VeriFiler及VeriFiler Plus。同时，美国Promega公司也推出了包含24位点的六色荧光试剂盒PowerPlex Fusion，上述试剂盒均基于进口遗传分析仪。国内的一些相关单位和试剂公司，也推出了多种不同的五色、六色STR复合扩增检测试剂盒，如公安部物证鉴定中心的Typer21(21位点)、TyperY36(36位点)等试剂盒，中德美联的EX25(25位点)、Y37(37位点)试剂盒，海尔施的PanGlobal(27位点)、PathFinder Plus(37个Y位点)试剂盒等。由此可见，DNA检测技术的发展具有所检测荧光数逐渐增加的特点。
近年来，我国法庭科学DNA检验技术的发展迅速，在DNA检测关键仪器设备及试剂国产化方面取得了多项突破，近日，我所基于五色及六色荧光技术，创新性研制出国际上首个可实现八色荧光检测的遗传分析仪、复合扩增试剂及分析软件，实现了该领域的技术引领。八色荧光光谱校准试剂，是八色荧光STR复合扩增检验试剂盒应用于国产遗传分析仪的必备配套试剂，是国产八色荧光试剂能够与国产法医DNA专用检测平台紧密结合的重要纽带。国内外多家公司所推出的多种不同的DNA检验试剂盒，均配备了专用的荧光光谱校准物，其制备技术方法保密。因此，迫切要求开展自主八色荧光光谱校准试剂研发开发工作。
中国专利申请ZL201110201443.3公开了一种五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物，以9947A标准DNA为模板，采用多对引物进行复合扩增，但在扩增的过程中极易产生影子带(Stutter)，导致荧光光谱校准试剂中含有多个杂峰，极大影响光谱校准试剂的质量，导致质量数降低。另外，传统荧光光谱校准试剂的制备大多采用单荧光片段扩增、纯化、混合、调配方法，制备过程复杂繁琐。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种八色荧光光谱校准试剂的制备方法，具体过程为：
S1、人工合成8条模板DNA，每条模板DNA均包含不同引物的结合位点；8条模板DNA的序列信息分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；
S2、设计和确定8对荧光引物，荧光引物对1、荧光引物对2、荧光引物对3、荧光引物对4、荧光引物对5、荧光引物对6、荧光引物对7、荧光引物对8的序列信息分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，并且其5’端荧光标记分别为FAM、HEX、NED、NH598、NH618、NH650、NH635、NH670；
S3、将步骤S1人工合成的8个模板DNA进行混合得到模板混合物；
S4、将步骤S2中的8对荧光引物对进行混合得到引物混合物；
S5、将PCR缓冲液、步骤S3得到的模板混合物、步骤S4得到的引物混合物混合，然后进行PCR扩增，得到八色荧光光谱校准试剂。
进一步地，步骤S3中，所述模板混合物中按100μL体系计含有8条模板DNA各10μL以及PCR级水20μL。
更进一步地，参与混合的8条模板DNA的浓度均为1ng/μL。
进一步地，步骤S4中，按100μL体系计，所述引物混合物中含有6.5μL荧光引物对1、6.25μL荧光引物对2、6μL荧光引物对3、5μL荧光引物对4、5μL荧光引物对5、4.0μL荧光引物对6、4.5μL荧光引物对7、3.25μL荧光引物对8，以及59.5μL PCR级水或TE-1。
更进一步地，参与混合的8对荧光引物对的浓度均为2μM。
进一步地，步骤S5中，PCR扩增体系按20μL体系计，包括5×PCR反应缓冲液4μL、引物混合物10μL、模板混合物1μL和PCR级水5μL。
进一步地，步骤S5中，PCR循环参数条件为首先95℃下初始孵育激活5分钟，然后以95℃反应20s、59℃反应1min、72℃反应30s为一个循环，循环27-28次，再60℃下终延伸20分钟，最后在4℃下保温。
本发明还提供一种利用上述制备方法制备得到的八色荧光光谱校准试剂。
本发明的有益效果在于：本发明采用人工设计合成的8个模板DNA，每个模板DNA分别包含1对引物的结合位点，并根据每个片段的预设长度，可实现片段长度与荧光精确控制。每对引物中的上游引物的5’端分别采用8种不同荧光标记，在一个特定反应体系内进行复合扩增，可同时获得含有八种荧光产物的荧光光谱校准试剂，无需进行单色荧光片段的混合和调配即可直接应用于荧光光谱校准。该方法极大的简化了荧光标准物的制备工艺流程，避免了复杂繁琐的操作。本发明的制备方法可以稳定的获得该标准物质，具有效率高，操作简便的特点。
附图说明
图1为本发明实施例1中的Template1及FAM标记引物检测结果示意图；
图2为本发明实施例1中的Template2及HEX标记引物检测结果示意图；
图3为本发明实施例1中的Template3及NED标记引物检测结果示意图；
图4为本发明实施例1中的Template4及NH598标记引物检测结果示意图；
图5为本发明实施例1中的Template5及NH618标记引物检测结果示意图；
图6为本发明实施例1中的Template6及NH635标记引物检测结果示意图；
图7为本发明实施例1中的Template7及NH650标记引物检测结果示意图；
图8为本发明实施例1中的Template8及NH670标记引物检测结果示意图；
图9为本发明实施例2中的检测结果示意图；
图10为本发明实施例3中八色荧光光谱试剂进行光谱校准的通过情况示意图；
图11为本发明实施例3中GA118-24B型遗传分析仪八色光谱校正结果(片段)示意图；
图12为本发明实施例3中GA118-24B型遗传分析仪八色光谱校正结果(光谱分布)示意图；
图13为本发明实施例4中八色荧光校准后的八色荧光检测图谱。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
本实施例提供一种八色荧光光谱校准试剂的制备方法，具体过程为：
S1、人工合成8条模板DNA，每条模板DNA均包含不同引物的结合位点，8条模板DNA将通过T/A与PMD-18T载体连接；8条模板DNA的序列信息分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。
S2、设计和确定8对荧光引物，8对荧光引物的序列信息分别为SEQ ID NO：9和SEQID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，如表1所示。
表1
按照上述引物序列分别进行荧光标记和合成，经HPLC纯化，并将上述单引物稀释成100μM，再将引物对稀释成2μM工作浓度，PCR体系如下表2所示。
表2
扩增程序如表3所示：
表3
取1μL扩增产物与10μL Hi-Di Formamide混合，采用GA118-24B遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经GA-Marker软件分析获得检测图谱，各引物扩增及检测结果分别如图1-8所示。
S3、将步骤S1人工合成的8个模板DNA按照如表4所示浓度配比进行混合以制备模板混合物；
表4
组成
体积(100μL体系)
SEQ ID NO：1(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：2(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：3(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：4(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：5(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：6(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：7(1ng/μL)
10μL
SEQ ID NO：8(1ng/μL)
10μL
PCR级水
20μL
S4、将步骤S2中的8对荧光引物对按表5所示的配置方法进行配置得到引物混合物。
表5
组成
体积(100μL体系)
PCR体系中的终浓度
引物对1(2μM)
6.5μL
0.065μM
引物对2(2μM)
6.25μL
0.0625μM
引物对3(2μM)
6μL
0.06μM
引物对4(2μM)
5μL
0.05μM
引物对5(2μM)
5μL
0.05μM
引物对6(2μM)
4.0μL
0.04μM
引物对7(2μM)
4.5μL
0.045μM
引物对8(2μM)
3.25μL
0.0325μM
PCR级水或TE<sup>-1</sup>
补齐至100μL
S5、将PCR缓冲液、步骤S3得到的模板混合物、步骤S2得到的引物混合物混合，在如表7所示的PCR循环参数条件下扩增；PCR扩增体系如表6所示。
表6
表7
取步骤S6所得的扩增产物1μL与10μL甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，采用GA118-24B遗传分析仪(公安部第一研究所)进行毛细管电泳检测，经GA-Marker软件(公安部第一研究所)分析获得检测图谱，检测结果如图9所示。
结果表明，采用本实施例方法经一步扩增即可同时获得高质量荧光校准混合物，所形成8种不同荧光峰，峰型尖锐，荧光片段完整，峰高完全满足荧光校准试剂要求，无任何非特异性杂峰产生。
实施例2
本实施例提供一种八色荧光校准文件的生成的方法。
实施例1制备的八色荧光校准试剂需经过国产遗传分析仪GA118-24B检测生成相应的光谱校准文件，以用于对应八色荧光标记荧光PCR产物的检测。
取25μL八色荧光校准试剂，与225μL甲酰胺混合并充分混匀，95℃5min，-20℃5min变性后，在96孔板的三排(A1～H3)24个孔中各分装10μL，应用GA118-24B型遗传分析仪按照操作说明进行检测，具体参数如下：
选择T8荧光通道模式
毛细管长度为36cm；
电泳条件：温度为60℃，灌胶时间为15s，电泳电压15000V；
进样电压：1.2kv；
进样时间：10s；
电泳时间1500s
启动“Genetic Analyzer Data Collection Software V1.0”，选择“新建表单”，弹出“新建表单第一步”窗口，在“样品表单名称”中，命名“8dye-matrix”；“应用类型”选择“SpectralCal”；点击“下一步”。在“新建表单第二步”窗口中，点击“A1样品名”单元格，按住鼠标向下拖动至“H3样品名”单元格，此时已选中“A1样品名”与“H3样品名”之间所有单元格。单击鼠标右键，选择“自动填充【序号】(A)”，“样品名”与“优先级设置”的所选单元格会自动填充。点击“A1染料集”单元格，选择“T8”，同一列单元格将自动填充。点击“A1运行模型”单元格，选择“SpectralCal_POP7_Default”(根据使用的凝胶进行选择)，同一列所选单元格将自动填充。点击“A1光谱校正标准”单元格，选择“MtxStd{GeneScan-SetT8}”，同一列所选单元格将自动填充。点击“确定”。提示框点击“是”。完成样品表编辑。
在“未运行表单中”，单击选择样品表单名称为“8dye-matrix”的表单，在界面右侧网格下点击“链接到A托盘”(根据实际需要选择A托盘或B托盘)，此时有待测样品的网格变为浅绿色，代表链接样品表单成功。点击运行，光谱矫正结果如图10所示。
结果表明，实施例1获得了高质量八色荧光光谱校准试剂，八色荧光光谱可实现有效分离，基于国产GA118-24B，24道全部通过八色光谱校正，质量数均不低于0.94，通过率达到100％，如图11-12所示。
八色荧光光谱矫正结果及其光谱分布完全满足八色荧光检测要求。
实施例3
本实施例提供一种八色荧光光谱校准结果的STR检测应用。
在实施例2建立Matrix文件后，应用该荧光校准试剂所得到的文件进行待测DNA样本荧光信号采集与处理，所得到的STR分型结果分别如图13所示。
结果表明：经八色荧光校准试剂校准后，GA118-24B可正确识别对应八色荧光复合扩增产物，各荧光通道间无荧光渗透现象产生。
检测结果表明，对于标准参照样本来说，采用八色荧光扩增试剂及其检测平台获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失现象出现，分型结果正确，完全满足个体识别和鉴定的需要。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 公安部第一研究所
北京中盾安民分析技术有限公司
<120> 一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法
<130> 123
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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atgaacagac gctgctgcgt gtggctgagg ccatcaataa aacctatacc cgccggaatg 120
gtgcagaaat gtcgatatcc cgtatctgct gggatactgg cgggattgac ccgaccattg 180
tgtatgaacg ctcgaaaaaa catggatcta gtagcatggc ctagtccaag cggcatccgt 240
ctaggcgata atccgctggc gc 262
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgaaggaaca gtatctagtc caagcggcat ccgtctacgg aaagcaggtg gccagcatgc 60
cacgtaagcg aaacaaaaac ggggtttacc ttaccgaaat cggtacggat accgcgaaag 120
agcagattta taaccgcttc acactgacgc cggaagggga tgaaccgctt ccatttccgt 180
tcacttcttg aagaacccgg atatttttga tctgac 216
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<213> 人工序列
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gccacggaac agcgcctata attgatctga ccgaagtgca ggtaatgaga gctgaagagc 60
aggtcgaaga tggcaggaaa aaaatactgt gggacagcaa aaagcgacgc aatgaggcac 120
tcgactgctt cgtttatgcg ctggcggcgc tgcgcacaac atgtccacct ggcatttcga 180
tctcagtgcg ctgctggcga gcctgcagga agagg 215
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<213> 人工序列
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gcaggcagaa cgggaaatgc caacaagaaa agtgaaagcc ctagtggatg ataagcactg 60
gcagattacg cccgtgccgc tgaagagcag gtcgaagatg gcaggaaaga aatactgtgg 120
gacagcaaaa agcgacgcaa tgaggcactc gacgctatgt ttatgcgctg tcgacgctgc 180
gcatcagtat ttcccgctgg cagctggatc tcagtgcgct gctggcgagc ctg 233
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caacagtaca gaaagacgga cgaagtttac ggccacttcc gtgtctgacc tgaattcag 239
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