一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法
阅读说明：本技术 一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法 (Method for evaluating application effect of polyphenol substance in cigarettes ) 是由 唐丽 王猛 张翼鹏 廖头根 者为 王坚 刘娟 朱保昆 唐军 周冰 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法,本发明以滋味能力和多酚得率为依据,充分考虑烟草应用需求,对天然植物中的多酚物质的提取工艺条件进行优化,确定滋味能力及多酚得率最优的提取工艺条件,并以滋味能力和抗氧化性为各分级纯化效果的评价指标,富集纯化得到的多酚精制物,根据实际应用情况,利用联合指数(CI)考察几种多酚精制物的协调效果,选取协调效果最佳的多酚精制物组合,将其应用于卷烟中,通过感官评价对其在感官质量中的影响进行评价。本发明评价方法准确可靠,弥补了现有评价方法的不足,科学客观,系统全面。(The invention discloses an evaluation method of application effect of polyphenol substances in cigarettes, which takes the taste capacity and polyphenol yield as the basis, fully considers the application requirements of tobaccos, optimizes the extraction process conditions of the polyphenol substances in natural plants, determines the extraction process conditions with the optimal taste capacity and polyphenol yield, takes the taste capacity and oxidation resistance as evaluation indexes of each grading purification effect, enriches and purifies the obtained polyphenol refined substances, utilizes a joint index (CI) to investigate the coordination effect of several polyphenol refined substances according to the actual application condition, selects a polyphenol refined substance combination with the optimal coordination effect, applies the polyphenol refined substance combination to the cigarettes, and evaluates the influence of the polyphenol refined substances in the sensory quality through sensory evaluation. The evaluation method is accurate and reliable, overcomes the defects of the existing evaluation method, and is scientific, objective and comprehensive in system.)
技术领域
本发明属于烟草工业应用领域，具体涉及一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法。
背景技术
卷烟由于叶组配方限制，或多或少存在香味不足，杂气影响抽吸感受等缺陷，通过选取适当的香料，采用加香加料技术能够有效的克服叶组配方限制带来的抽吸感官缺陷。其中，天然植物的提取物作为香料具有舒适自然的抽吸感受，是一类具有良好发展价值的烟用香料。
天然植物中的酚类化合物是一类重要的致香成分，已经被广泛的研究并得到了较多的应用，在烟草领域，围绕着天然植物中多酚物质的提取方法、不同工艺对多酚物质的特性影响、多酚物质在卷烟中的应用途径等方面，有较多的报道，然而对于多酚物质在卷烟中的应用效果缺乏一种科学、系统的评价方法。在提取工艺上，有的研究将多酚得率作为多酚物质提取工艺的评价指标，却忽略了多酚物质作为天然植物香料，在卷烟中应用时应该考虑到其本身的滋味能力和抗氧化活性对卷烟抽吸感受的影响。除此之外，有的研究将感官评吸结果作为衡量多酚物质在卷烟中应用效果好坏的指标，这无疑存在主观性和片面性，缺乏科学性和客观性。
因此，开发一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法，并将其应用于烟草加香领域就显得非常必要。
为了解决以上问题，提出本发明。
发明内容
本发明提供一种一种多酚物质在卷烟中应用效果的评价方法，其包括以下步骤：
(1)以滋味能力和多酚得率作为指标确定最佳提取工艺条件，利用最佳提取工艺条件提取得到多酚粗提物；一般情况下是同步的，如果出现两个相违背的情况，则以滋味能力为准。
(2)将多酚粗提物进行多级富集纯化，以滋味能力及抗氧化活性作为指标确定最佳富集纯化等级，得到多酚精制物；一般情况下是同步的，如果出现两个相违背的情况，则以滋味能力为准。
(3)将多种多酚精制物联合应用于烟草中，以联合指数(CI)值判定几种多酚的协同效果；
(4)采用感官评价方法对多酚物质应用在卷烟中的感官质量效果进行评价。
其中步骤(1)包括以下步骤：
(11)采用适宜的方法对富含多酚的天然植物进行提取，并对提取的工艺条件进行优化。
(12)步骤(11)中的提取工艺，其条件优化的依据指标包括滋味能力和多酚得率。
(13)根据(12)中给出的评价指标，得到最佳提取工艺条件。
(14)按照(13)的工艺条件，提取得到多酚粗提物。
优选地，步骤(2)中，采用有机溶剂分级，将多酚粗提物进行富集纯化，测定各分级物的滋味能力、抗氧化活性，选取滋味能力及抗氧化活性最强的级分经梯度洗脱，每个梯度洗脱3倍柱体积，洗脱物浓缩并冷冻干燥并测定其抗氧化活性。得到抗氧化活性最强的多酚精制物。溶剂分级是多酚分离纯化的一种重要手段，是利用目标物质在互不相溶的两个溶剂相中溶解性不同实现分离。通过溶剂分级，不同极性的物质分别溶于不同的溶剂相。
优选地，所述抗氧化活性指标包括清除羟基自由基能力、清除ABTS+·自由基能力、清除DPPH·自由基能力。
其中步骤(4)包括以下步骤：
(41)选取步骤(3)中协同效果最佳的多酚精制物组合，并将其应用于卷烟中。
(42)采用感官评价方法对多酚物质应用在卷烟中的感官质量效果进行评价。
本发明采用以下方法测定滋味能力：
采用Dot值进行评价，Dot值＝不同处理下植物提取物中多酚类物质的浓度 /各自的浓度阈值，Dot值大于1(即浓度达到阈值)，表明该物质可能对滋味有直接贡献，反之则可能无贡献。为方便对比，将“不同处理下多酚类物质的浓度”换算为不同处理下样品(干物质)中多酚类物质的含量(mg/g)。每个样品重复 3次。多酚类均根据相应的标准品定量。
本发明采用以下方法测定多酚得率：
采用Folin-Ciocalteu法测定，以没食子酸为标准品绘制曲线。
总多酚含量用mg没食子酸/g原料表示，多酚提取物得率以每100g原料中提取出的多酚含量表示。
本发明采用以下方法测定抗氧化性：
(1)清除羟基自由基能力：
以Trolox作为阳性对照，在试管中加入1.0mL不同浓度的样液，依次加入 2mmol/LFeSO4溶液2mL，6mmol/LH2O2溶液2ml，充分震荡摇匀，静置10min，再依次加入2mmol/L水杨酸钠2mL，混合均匀后置于37℃水浴中静置30min，于510nm波长下测定混合物的吸光值A1；同法操作，用等体积蒸馏水代替样液，测定吸光度A0；不加水杨酸用等体积蒸馏水代替，加入不同浓度样液，同法操作，测定吸光度A2。以样品溶液浓度为横坐标，羟基自由基清除率为纵坐标，建立样品溶液浓度与羟自由基清除率关系的曲线。
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]
(2)清除ABTS+·自由基能力
ABTS+·工作液的配置：精确称量0.0384gABTS试剂并用蒸馏水溶解定容至10mL；精确称取0.0134g过硫酸钾蒸馏水溶解并定容至10mL。将上述两种试剂以1:1的比例混合，避光12h得到工作液。取适量ABTS+·工作液，以磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)将其稀释，使工作液的吸光值在734nm下时获得0.70±0.02。样品的测定：在96孔板的孔中依次加入样液50μL，以及稀释好的ABTS+·工作液250μL，充分混匀于734nm波长下测定吸光值Ai，在另一组加入样液的50μL的孔中加入磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)250μL，充分混匀于734nm波长下测定吸光值Aj，同时在第三组孔中加入蒸馏水50μL以及 ABTS+·工作液250μL作为空白组，避光反应6min，于734nm波长下测吸光值A0。按公式计算对ABTS+·的清除能力。
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]
(3)清除DPPH·自由基能力
精确称取6.00mg DPPH干粉，并用95％的乙醇准确定容至100mL容量瓶中，充分混匀，即配置成1×10-4mol/L的DPPH溶液。样品的测定：在96孔板的孔中依次加入不同浓度梯度的样液100μL，以及稀释好的DPPH溶液200μL，充分混匀于517nm波长下测定吸光值Ai，在另一组加入样液的100μL的孔中加入95％的乙醇溶液200μL，充分混匀于517nm波长下测定吸光值Aj，同时在第三组孔中加入95％的乙醇溶液100μL以及DPPH溶液200μL作为空白组，避光反应30min，于517nm波长下测吸光值A0。按公式计算对DPPH·的清除能力。
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]
本发明采用以下方法测定联合指数(CI)：
CI＝D1/DX1+D2/DX2，D1和D2是成分1和成分2联合作用滋味能力； DX1和DX2是成分1和成分2单独作用时的滋味能力，如果CI＝1，表明成分1 和成分2是联合作用效果是具有叠加作用的；若CI＜1时，表明成分1和成分 2联合作用效果是具有拮抗作用的；若CI＞1，表明成分1和成分2联合作用是具有协同作用的。
本发明采用以下方法进行感官评价：
主要考察香气、烟气和口感特性三个方面，包含香气质、香气量、杂气、浓度、劲头、细腻程度、刺激性、干燥感、干净程度和回甜10个指标；所述10 个质量检测指标的打分值分别为：香气质0-10分、香气量0-10分、杂气0-10 分、浓度0-10分、劲头0-10分、细腻程度0-10分、刺激性0-10分、干燥感0-10 分、干净程度0-10分、回甜0-10分。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
1、本发明以滋味能力和多酚得率为依据，充分考虑烟草应用需求，对天然植物中的多酚物质的提取工艺条件进行优化，确定滋味能力及多酚得率最优的提取工艺条件，并非是如现有技术一样，仅仅考虑多酚得率。同时本发明以滋味能力和抗氧化活性为各分级纯化效果的评价指标，富集纯化得到的多酚精制物。根据实际应用情况，利用联合指数(CI)考察几种多酚精制物的协调效果，选取协调效果最佳的多酚精制物组合，将其应用于卷烟中，通过感官评价对其在感官质量中的影响进行评价。
2、本发明的评价方法完整贯穿了多酚物质的提取工艺条件优化、富集纯化过程、多酚物质协调作用的评价筛选、多酚物质在卷烟中的感官评价情况的全过程，充分考虑了卷烟调香的实际需求和多酚物质自身的特点，本发明评价方法准确可靠，弥补了现有评价方法的不足，科学客观，系统全面。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
(1)称取5g(干基)云产橄榄粉，分别加入100mL水、60％(v/v)乙醇溶液、60％(v/v)甲醇溶液和60％(v/v)丙酮溶液，在50℃水浴振荡3h，过滤，滤液35℃真空浓缩至干。溶剂浓度，分别为30％、50％、70％、90％和100％(v/v) 的乙醇溶液；浸提时间，40mL 60％(v/v)乙醇溶液，在50℃水浴分别振荡1h、 2h、3h、4h和5h；浸提温度，30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴振荡 3h，其他条件不变；pH值，调节体系pH分别达到2、3、4、5、6和7左右，标记为A液、B液、C液、D液、E液和F液；料液比，分别按照液料比5mL/g、 10mL/g、15mL/g和20mL/g加入10mL、20mL、30mL和40mL溶剂；浸提次数，称取5g(干基)云产橄榄粉，加入40mL溶剂溶液，在50℃水浴振荡3h，过滤，滤渣重复用上述条件提取1次、2次、3次、4次和5次，所得滤液合并，滤液35℃真空浓缩至干。
(2)条件优化：水作为溶剂提取多酚的提取率最低，仅为141.8±5.2mg/g，提取物的滋味能力也最低，仅为1.03±0.02。60％乙醇的提取效果最好，总多酚提取率达203.7±6.3mg/g，提取物滋味能力达到1.43±0.04。选取乙醇溶液作为提取溶剂。一般情况下是同步的，如果出现两个相违背的情况，则以滋味能力为准。
浸提时间为3h的提取物的滋味能力显著高于1h和2h(P<0.05)，浸提时间超过3h的提取物的滋味能力无显著变化。选择浸提时间为3h左右。
在50℃时，总多酚提取率达到一个峰值，为203.7±6.3mg/g，50℃下得到的多酚提取物的滋味能力最高。选择50℃左右为浸提温度。
pH值在3时提取率达到203.7±6.3mg/g，滋味能力也最高，选择pH值3左右做进一步实验。
当液料比为15时的多酚提取率为203.7±6.3mg/g，与液料比为20时的提取率没有显著差异。液料比的变化对云产橄榄多酚提取物的滋味能力没有显著影响。
三次浸提多酚提取率为203.7±6.3mg/g，显著高于二次浸提得率 182.3±7.6mg/g(P<0.05)。四次浸提的提取率为207.6±4.5mg/g，与三次浸提的提取率没有显著差异。经三次提取后，得到的多酚提取物滋味能力显著降低 (P<0.05)。综合考虑多酚提取率和滋味能力，选用三次浸提作为最终提取方案较为合适。
(3)根据(2)中给出的评价指标，得到最佳提取工艺条件，分别是：提取溶剂乙醇溶液，浸提时间3h左右，浸提温度50℃左右，pH值为3，浸提次数三次。
(4)按照(3)的工艺条件，提取得到多酚粗提物。
(5)采用有机溶剂分级，将多酚粗提物进行富集纯化，测定各分级物的滋味能力、抗氧化活性，选取滋味能力及抗氧化活性最强的级分经梯度洗脱，每个梯度洗脱3倍柱体积，洗脱物浓缩并冷冻干燥并测定其抗氧化活性。得到抗氧化活性最强的多酚精制物。
所述抗氧化性，其中抗氧化性包括但不局限于清除羟基自由基能力、清除 ABTS+·自由基能力、清除DPPH·自由基能力。
结果见表1和表2。
橄榄多酚粗提物的得率较高，达到235.2mg GAE/100g原料。但由于多酚粗提物中含有氨基酸和多糖等非酚类物质，其中的多酚含量仅为41.7g/100g提取物。溶剂分级后，各相的多酚含量存在显著差异，其中乙酸乙酯相的多酚含量为70.2g/100g提取物，显著高于乙醚相和正丁醇相(P<0.05)。水相中的多酚含量最低，仅为12.3g/100g提取物。
橄榄多酚不同溶剂相组分的滋味能力及抗氧化活性如表2所示。橄榄多酚提取物各分级物都具有较强的滋味能力和抗氧化性。橄榄多酚粗提物经溶剂分级后，超氧阴离子自由基清除力和滋味能力有所下降，而DPPH和羟基自由基清除力显著增强(P<0.05)。各分级物自由基清除力与滋味能力有显著差异，乙酸乙酯相的抗氧化活性最强，其清除DPPH、超氧阴离子、羟基自由基的EC50值分别为1.3、43.2、7.3μg/mL，滋味能力为1.59，抗氧化活性显著高于对照Vc和芦丁 (P<0.05)；水相的抗氧化活性最弱。
综合以上结果，橄榄多酚粗提物乙酸乙酯相的总多酚含量最高，抗氧化活性最强，因此，选择乙酸乙酯相进一步分离，制得橄榄多酚精制物。
(6)为了增强效果，几种多酚精制物经常联合应用于烟草中，以联合指数 (CI)值判定几种多酚的协同效果，本实施例将橄榄多酚(GL)和滇橄榄多酚 (DGL)分别单独应用、按一定比例混合联合应用，并考察其协调效果。
CI＞1，表明GL和DGL联合作用是具有协同作用的。研究的计算结果如表 3所示，可以看出GL-DGL复合产品(1:1)、GL-DGL复合产品(2:1)及GL-DGL 复合产品(1:2)的CI值均大于1，这表明GL和DGL在3种比例条件下(1:1、 2:1、1:2)联合作用是具有协同作用的，提高滋味能力协同效应排序如下：GL-DGL 复合产品(2:1)＞GL-DGL复合产品(1:1)＞GL-DGL复合产品(1:2)。
(7)选取(6)中协同效果最佳的多酚精制物组合，并将其应用于卷烟中。
(8)采用感官评价方法对多酚物质应用在卷烟中的感官质量效果进行评价，评价结果见表4。
从表中可以看出，本实施例的卷烟样品相比较对照样品，其在卷烟香气特性和口感特性上有明显的改善，同时细腻程度也有所提升，说明根据本发明的评价方法所获得的多酚物质，在卷烟中应用具有较好的效果。
表1不同溶剂组分得率和总多酚含量比较
样品
得率(mg GAE/100g原料)
总多酚含量(g/100g提取物*)
乙醚相
7.25±0.32
51.6±1.25
乙酸乙酯相
49.72±1.12
70.2±1.37
正丁醇相
92.56±2.32
38.7±1.02
水相
61.02±1.45
12.3±1.17
多酚粗提物
235.2±1.87
41.7±1.16
注1：表中数据为平均值±SD；*提取物：乙醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相为多酚提取物的各溶剂萃取物，多酚粗提物为总多酚提取物。
表2橄榄多酚不同溶剂组分滋味能力及抗氧化活性比较
注：表中数据为平均值±SD，EC50为自由基清除率达到50％；滋味能力以Dot值即不同处理下植物提取物中多酚类物质的浓度/各自的浓度阈值。
表3橄榄和滇橄榄功效成分协同作用联合指数(CI值)
样品
滋味能力CI
GL
—
DGL
—
GF3-DF3复合产品(1:1)
1.30
GF3-DF3复合产品(2:1)
1.43
GF3-DF3复合产品(1:2)
1.18
表4卷烟感官评价结果
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