具体实施方式

本公开提供了含有RNase的核酸酶融合蛋白，其包括消化循环RNA和与自身抗体和免疫复合物复合的RNA的RNase-Fc融合蛋白，从而治疗患有原发性干燥综合征(pSS)的患者。本公开还提供了治疗以循环RNA和/或含有RNA的自身抗体水平升高为特征的疾病(如干燥综合征)的方法，以及治疗以循环RNA和含有RNA自身抗体水平升高为特征的疾病症状(如在有需要的人类患者中与干燥综合征相关的疲劳)的方法。本公开还提供了有效的治疗和给药方案，用于将含有RNase的核酸酶融合蛋白(包括RNase-Fc融合蛋白)施用于有需要的患有干燥综合征的人类患者，包括患有pSS的患者。

本公开至少部分基于以下令人惊讶的发现，即通过施用含有RNase的核酸酶融合蛋白(如RSLV-132)治疗pSS患者可减少患者与pSS相关的疲劳。不受理论的束缚，据信本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白能够消化循环RNA，以及与自身免疫病患者的自身抗体和免疫复合物复合的RNA，从而减轻自身免疫病的症状(如干燥综合征相关的疲劳)。

还据信，不受理论的束缚，通过施用含有RNase的核酸酶融合蛋白(如RSLV-132)治疗干燥综合征患者，减少循环RNA(无论其与自身抗体相关联还是游离于循环中)，从而减少TLR的激活和几个下游炎症通路的激活。因此，通过施用含有RNase的核酸酶融合蛋白(如RSLV-132)治疗干燥综合征患者，包括pSS患者，可以减轻、减少或抑制促炎症级联反应的激活，从而减轻或减少干燥综合征患者的整体炎症特征，从而减轻或减少与干燥综合征相关的症状，包括疲劳、疼痛、干燥、抑郁和/或认知障碍。

预料不到的是，发现通过施用含有RNase的核酸酶融合蛋白(如RSLV-132)治疗pSS患者，导致患者疲劳的改善通过三个单独的测试一致显示治疗后疲劳有所改善。特别是，用RSLV-132治疗后对pSS患者进行EULAR SS患者报告指数(ESSPRI)时，患者的ESSPRI评分在ESSPRI评分的疲劳项目中出现了1分或更高的临床意义下降。ESSPRI评分的降低与疲劳的改善有关。用RSLV-132治疗后对这些患者进行慢性疾病测试功能评估(FACIT)，导致FACIT疲劳评分增加，这与疲劳减少有关。同样，用RSLV-132治疗后进行疲劳概况(ProF)测试导致ProF评分降低，这与疲劳减少有关。

此外，令人惊讶地发现，用RLSV-132治疗pSS患者后，患者表现出如通过数字符号替换测试(DSST)测量的改善的认知能力。因此，本公开提供了含有融合蛋白RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc，其可用于治疗干燥综合征的方法、减少干燥综合征相关疲劳的方法和改善干燥综合征患者认知能力的方法。本公开还提供了包含RNase-Fc融合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物，其可用于治疗干燥综合征的方法、减少干燥综合征相关疲劳的方法和改善干燥综合征患者认知能力的方法。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是RSLV-132。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以约5-10mg/kg、约2-8mg/kg、约3-6mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg，或约10mg/kg施用于人类患者。

此外，发现用RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)治疗原发性干燥综合征(pSS)患者后，实现临床响应的患者表现出炎症相关基因的表达降低。例如，在接受RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗且出现临床响应的患者中，IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4和STAT5B的表达降低。还发现在用RSLV-132治疗后，实现临床响应的患者表现出炎症相关基因的表达增加。例如，在接受RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)治疗且出现临床响应的患者中，CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和CCR2的表达增加。

进一步发现，施用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)之前，在随后对RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)具有阳性临床响应的自身免疫性疾病(例如原发性干燥综合征(pSS))患者中，存在独特的基因表达谱。例如，当基线基因表达与FACIT、ProF或ESSPRI相关时，在RSLV-132响应者中特定的特征被揭示。STAT1和STAT2表达降低与FACIT测试相关，ZNF606表达增加和TRIM37表达降低与ProF测试相关，ACKR3表达增加和MAPK3K8表达降低与ESSPRI测试相关。

不受理论束缚，据信某些患者的循环中可能存在特定的促进这些患者炎症通路的慢性激活的RNA分子，并通过RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)去除特定循环非编码RNA以及去除促炎症RNA通常有助于治疗自身免疫性疾病患者(例如，pSS)。因此，使用“基因表达指纹”可以鉴定最能从RNA核酸酶试剂(如RSLV-132)治疗中受益的患者。

定义

除非另有说明，权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。

“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢结合的碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可以通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的它们通常已知的三个字母符号或一个字母符号来提及。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来表示。

“氨基酸置换”是指用第二个不同的“置换”氨基酸残基置换预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个额外的氨基酸并入预定的氨基酸序列中。虽然插入通常由插入一个或两个氨基酸残基组成，但可以进行更大的“肽插入”，例如，插入约三个至约五个或甚至最多约十、十五或二十个氨基酸残基。插入的残基可以是如上所公开的天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，所述术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可以通过生成序列实现，所述序列中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换(Batzer et al.,Nucleic AcidRes 1991；19:5081；Ohtsuka et al.,JBC 1985；260:2605-8)；Rossolini et al.,ΜοlCell Probes 1994；8:91-8)。对于精氨酸和亮氨酸，第二个碱基的修饰也可能是保守的。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。

本发明的多核苷酸可以由任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸组成，它们可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA以及单链和双链区域混合的RNA组成，包含DNA和RNA的杂交分子，它们可以是单链的，或者更典型的是双链的，或单链和双链区域的混合物。此外，多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域组成。多核苷酸还可以包含一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。

如本文所用，术语“可操作地连接”或“可操作地偶联”是指并列(juxtaposition)，其中所描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。

如本文所用，术语“糖基化”或“糖基化的”是指向分子添加糖部分的过程或结果。

如本文所用，术语“改变的糖基化”是指无糖基化、去糖基化或糖基化不足的分子。

如本文所用，“糖基化位点”是指可能接受碳水化合物部分的位点，以及碳水化合物部分实际连接在其上的蛋白质内的位点，并且包括可以作为寡糖和/或碳水化合物的受体的任何氨基酸序列。

如本文所用，术语“无糖基化”或“无糖基化的”是指产生未糖基化形式的分子(例如，通过工程化蛋白质或多肽使其缺乏充当糖基化受体的氨基酸残基)。或者，蛋白质或多肽可以在例如大肠杆菌中表达，以产生无糖基化的蛋白质或多肽。

如本文所用，术语“去糖基化”或“去糖基化的”是指分子上糖部分的酶促去除过程或结果。

如本文所用，术语“糖基化不足”或“糖基化不足的”是指其中一种或多种如果在哺乳动物细胞中产生通常会存在的碳水化合物结构已被省略、去除、修饰或掩蔽的分子。

如本文所用，术语“Fc区”和“Fc结构域”是由天然免疫球蛋白的两条重链的相应Fc结构域(或Fc部分)形成的一部分，没有结合抗原的可变区。在一些实施方式中，Fc结构域在木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区开始并在抗体的C末端结束。因此，完整的Fc结构域至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方式中，Fc结构域包含以下至少一种：铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体、部分或片段。在其他实施方式中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一个实施方式中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在另一个实施方式中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在另一个实施方式中，Fc结构域由CH3结构域域或其部分组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在一个实施方式中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。在一个实施方式中，本发明的Fc结构域包含本领域已知的FcRn结合所需的Fc分子的至少一部分。在一个实施方式中，本发明的Fc结构域包含本领域已知的蛋白A结合所需的Fc分子的至少一部分。在一个实施方式中，本发明的Fc结构域包含本领域已知的蛋白G结合所需的Fc分子的至少一部分。本文的Fc结构域通常是指包含免疫球蛋白重链的全部或部分Fc结构域的多肽。这包括但不限于包含整个CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的此类肽的片段。Fc结构域可源自任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域包括天然Fc和Fc变体分子。与Fc变体和天然Fc一样，术语Fc结构域包括单体或多聚体形式的分子，无论是从整个抗体消化还是通过其他方式产生的。

如本文所述，本领域普通技术人员将理解，可以修饰任何Fc结构域，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。

本公开的RNase-Fc融合蛋白的Fc结构域可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，RNase-Fc融合蛋白的Fc结构域可以包含源自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，Fc结构域可以包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG3分子的嵌合铰链区。在另一个例子中，Fc结构域可包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。野生型人IgGl Fc结构域具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“血清半衰期”是指体内血清RNase-Fc融合蛋白浓度下降50％所需的时间。RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期越短，发挥治疗作用的时间就越短。

如本文所用，术语“RNA核酸酶试剂”是指包含RNase结构域的试剂。在一些实施方式中，RNA核酸酶试剂是含有RNase的核酸酶融合蛋白。在一些实施方式中，RNA核酸酶试剂是RNase-Fc融合蛋白。在一些实施方式中，RNA核酸酶试剂的RNase结构域是人胰腺RNase1。在一些实施方式中，RNA核酸酶试剂是多肽。在一些实施方式中，RNA核酸酶试剂是RSLV-132。

如本文所用，术语“含有RNase的核酸酶融合蛋白”是指包含至少一个核酸酶结构域的多肽通过或不通过接头可操作地连接至PK部分(药代动力学部分)，如Fc结构域或其变体或片段，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，含有RNase的核酸酶融合蛋白是“RNase-Fc融合蛋白”，其指包含至少一个核酸酶结构域的多肽通过或不通过接头可操作地连接至Fc结构域，或其变体或片段，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是包含至少两个核酸酶结构域的多肽，所述核酸酶结构域通过或不通过接头可操作地连接至Fc结构域，或其变体或片段，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，核酸酶结构域是人RNase 1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含一个或多个RNase结构域和一个或多个Fc结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含一个或多个RNase结构域、一个或多个Fc结构域和一个或多个DNase结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含与Fc结构域的N-或C-末端可操作连接的RNase 1结构域和与Fc结构域的N-或C-末端可操作连接的DNase结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是串联的RNase-Fc融合蛋白，例如一个或多个RNase 1结构域和/或一个或多个DNase域串联连接到一个或多个Fc结构域的N或C末端。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是同源二聚体RNase-Fc融合蛋白(两个相同的多肽)。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是异源二聚体RNase-Fc融合蛋白(两种不同的多肽)。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的结构域可操作地连接至接头结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的结构域在没有接头结构域的情况下可操作地连接。

如本文所用，术语“串联的RNase-Fc融合蛋白”是指包含至少两个串联连接的核酸酶结构域(从N末端到C末端)和Fc结构域或其变体或片段的多肽，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，串联的RNase-Fc融合蛋白是包含至少两个可操作地串联连接至至少一个Fc结构域的RNase 1结构域的多肽。在一些实施方式中，串联的RNase-Fc融合蛋白是包含至少一个DNase1结构域和与至少一个Fc结构域可操作地串联连接的至少一个RNase1结构域的多肽。在一些实施方式中，串联的RNase-Fc融合蛋白从N-末端到C-末端包括DNase1结构域、第一接头、RNase1结构域、第二接头和Fc结构域，或其变体或片段。

如本文所用，术语“异源二聚体RNase-Fc融合蛋白”是指包含第一和第二多肽的异源二聚体，它们一起包含至少两个核酸酶结构域和两个Fc结构域、其变体或片段，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，所述异源二聚体包含第一RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第一Fc结构域的N-或C-末端连接，以及第二RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第二Fc结构域的N-或C-末端连接，使得第一RNase1和第二RNase1结构域位于异源二聚体的相同末端(N-或C-末端)。在一些实施方式中，所述异源二聚体包含第一RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第一Fc结构域的N-末端连接，以及第二RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第二Fc结构域的C-末端连接。在一些实施方式中，所述第一RNase1结构域通过或不通过接头可操作地与第一Fc结构域的C-末端连接，并且所述第一RNase1结构域通过或不通过接头可操作地与第二Fc结构域的N-末端连接。在一些实施方式中，异源二聚体的第一和第二RNase1结构域不同。在一些实施方式中，异源二聚体RNase-Fc融合蛋白是包含至少一个DNase1结构域和至少一个RNase1结构域的异源二聚体，所述DNase1结构域和RNase1结构域可操作地与至少一个Fc结构域连接，其中DNase1结构域通过或不通过接头可操作地与第一Fc结构域的N-或C-末端连接，并且RNase1结构域通过或不通过接头可操作地与相同(第一Fc结构域)或不同的Fc结构域(第二个Fc结构域)的N-或C-末端连接，使得DNase 1结构域和RNase 1结构域位于相同(第一Fc结构域)或不同Fc结构域(第二Fc结构域)的相对末端(N-或C-末端)。在一些实施方式中，异源二聚体包含DNase。

如本文所用，术语“同源二聚体RNase-Fc融合蛋白”是指包含第一和第二多肽的同源二聚体，它们一起包含至少两个核酸酶结构域和两个Fc结构域、其变体或片段，以及编码此类多肽的核酸。在一些实施方式中，所述同源二聚体包含第一RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第一Fc结构域的N-或C-末端连接，以及第二RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与第二Fc结构域的N-或C-末端连接，使得第一RNase1和第二RNase1结构域位于同源二聚体的相同末端(N-或C-末端)。在一些实施方式中，所述同源二聚体的第一和第二RNase1结构域是相同的。在一些实施方式中，所述同源二聚体包含一个RNase1结构域，其通过或不通过接头可操作地与一个Fc结构域的N-或C-末端连接，和一个DNase结构域，其通过或不通过接头可操作地与第二Fc结构域的N-或C-末端连接。在一些实施方式中，RNase1和DNase结构域位于Fc结构域的相同末端(N-或C-末端)。在一些实施方式中，RNase1和DNase结构域位于Fc结构域的相对末端。

如本文所用，术语“二聚体”是指由两个大分子(例如，多肽)形成的大分子复合物。“同源二聚体”是指由两个相同的大分子(例如，多肽)形成的二聚体。“异源二聚体”是指由两种不同的大分子(例如，多肽)形成的二聚体。

如本文所用，术语“变体”是指源自野生型核酸酶(例如，RNase)或Fc结构域的多肽，并且与野生型的不同之处在于一个或多个改变，即在一个或多个位置置换、插入和/或确实。置换是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸。缺失是指去除占据一个位置的氨基酸。插入是指紧邻占据位置的氨基酸处添加1个或多个(如1-3个氨基酸)。变体多肽必须与野生型多肽具有小于100％的序列同一性或相似性。在一些实施方式中，变体多肽将具有与野生型多肽的氨基酸序列约75％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，或约85％至小于100％，或约90％至小于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)或约95％至小于100％，例如在变体多肽的长度上。

在某些方面，RNase-Fc融合蛋白采用一个或多个“接头结构域”，如多肽接头。如本文所用，术语“接头结构域”指连接线性多肽序列中的两个或多个肽结构域的一个或多个氨基酸。如本文所用，术语“多肽接头”是指连接蛋白质的线性氨基酸序列中的两个或更多个多肽结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可用于将核酸酶结构域(例如，RNase)可操作地连接至Fc结构域。在一些实施方式中，此类多肽接头为多肽分子提供灵活性。在一些实施方式中，多肽接头用于将RNase结构域连接(例如，遗传融合)到Fc结构域。RNase-Fc融合蛋白可以包括一个以上的接头结构域或肽接头。各种肽接头是本领域已知的。

如本文所用，术语“gly-ser多肽接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n。在一些实施方式中，n是1或更多，如2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、或10或更多(例如,(Gly₄Ser)10)。另一个示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly₄Ser)n。在一些实施方式中，n是1或更多，例如2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、或10或更多(例如,Ser(Gly₄Ser)10)。

如本文所用，术语“偶联”、“缀合”、“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方式在内的任何方式将两个以上的元件(elements)或组件或结构域连接在一起。化学缀合的方法(例如，使用异源双功能交联剂)是本领域已知的。

多肽或氨基酸序列“来源于”指定的多肽或蛋白质是指该多肽的来源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与该序列或其部分基本相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，优选至少20-30个氨基酸，更优选至少30-50个氨基酸组成，或者本领域普通技术人员可以以其他方式识别其起源的序列。来源于另一多肽的多肽相对于起始多肽可以具有一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基已被另一氨基酸残基置换或具有一个或多个氨基酸残基的插入或缺失。

在一个实施方式中，起始多肽序列和由其来源的序列之间存在一个氨基酸差异。关于该序列的同一性或相似性在本文中定义为候选序列中与起始氨基酸残基相同(即相同残基)的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入缺口(gap)之后，如果需要，达到最大的序列同一性百分比。

在一个实施方式中，本公开的多肽由、基本上由本文公开的序列表或序列表中所示的氨基酸序列及其功能活性变体组成，或包含本文公开的序列表或序列表中所示的氨基酸序列及其功能活性变体。在一个实施方式中，多肽包括至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与本文公开的序列表或序列表中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包括至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与本文公开的序列表或序列表中所示的连续氨基酸序列相同的连续氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包括具有至少10个，例如至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个或至少500个(或这些数字内的任何整数)本文公开的序列表或序列表中所示的氨基酸序列的连续氨基酸。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白由核苷酸序列编码。本公开的核苷酸序列可用于多种应用，包括：克隆、基因治疗、蛋白质表达和纯化、突变引入、有需要的宿主的DNA疫苗接种、用于例如被动免疫的抗体产生、PCR、引物和探针生成、siRNA设计和生成(参见例如DharmaconsiDesign网站)等。在一些实施方式中，本公开的核苷酸序列包含编码选自序列表(Table)或序列表(Listing)的RNase-Fc融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方式中，核苷酸序列包括至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与编码本文公开的序列表或序列表的氨基酸序列的核苷酸序列相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，核苷酸序列包括至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与编码本文公开的序列表或序列表中列出的氨基酸序列的连续核苷酸序列相同的连续核苷酸序列。在一些实施方式中，核苷酸序列包括具有至少10个，如至少15个，例如至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个或至少500个(或这些数字内的任何整数)编码本文公开的序列表或序列表中列出的氨基酸序列的核苷酸序列的连续核苷酸。

本领域普通技术人员还理解，RNase-Fc融合蛋白可以被改变，使得它们在序列上与其组分(例如，核酸酶结构域、接头结构域和Fc结构域)衍生自的天然存在的或天然序列不同，但同时保留天然序列的所期望的活性。例如，导致保守替换的核苷酸或氨基酸替换或“非必需”氨基酸残基的改变可以进行。编码非天然变体的分离的核酸分子可以通过在RNase-Fc融合蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失来产生，从而引入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失进入编码的蛋白质。可以通过标准技术引入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。

RNase-Fc融合蛋白可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸置换。“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，RNase-Fc融合蛋白中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方式中，氨基酸串可以用结构相似的串替换，该串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。或者，在另一个实施方式中，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以将所得突变体并入RNase-Fc融合蛋白中并筛选它们结合所期望的目标的能力。

如本文所用，术语“先天免疫系统的调节剂”是指与先天免疫应答的表达或调节相关的任何基因、蛋白质、核酸或微RNA，包括细胞因子和趋化因子的表达和分泌；树突细胞活化；和补体级联(complement cascade)。在一些实施方式中，先天免疫系统的调节剂包括炎症相关分子。在一些实施方式中，先天免疫系统的调节剂包括炎症相关基因。在一些实施方式中，先天免疫系统的调节剂包括炎症相关蛋白。

在一些实施方式中，先天免疫系统的调节剂包括与信号转导、干扰素家族成员、补体、抗原加工、信号转导、泛素化、趋化性、细胞粘附和聚合酶活性调节相关的基因或蛋白质。

术语“先天免疫系统”是指对抗原的非特异性防御机制。先天免疫应答不是由对特定抗原的特异性驱动的，而是由抗原的存在驱动的。先天免疫系统的功能包括充当感染因子的物理和化学屏障、通过白细胞、树突状细胞激活、细胞因子和趋化因子分泌、补体级联激活和适应性免疫系统激活识别和去除外来物质。

如本文所用，术语“炎症相关分子”是指在炎症或炎症反应中起作用的分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是促炎分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是抗炎分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关基因。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关蛋白。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关细胞因子。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症介质。

如本文所用，术语“炎症相关基因”是指在炎症或炎症反应中起作用的基因。在一些实施方式中，炎症相关基因是促炎基因。在一些实施方式中，炎症相关基因是抗炎基因。在一些实施方式中，炎症相关基因编码炎症相关蛋白。在一些实施方式中，炎症相关基因编码细胞因子。

如本文所用，术语“炎症相关蛋白”是指在炎症或炎症反应中起作用的蛋白质。在一些实施方式中，炎症相关蛋白是促炎蛋白。在一些实施方式中，炎症相关蛋白是抗炎蛋白。在一些实施方式中，炎症相关蛋白是细胞因子。

如本文所用，术语“促炎分子”是指增强或刺激炎症反应的分子。在一些实施方式中，促炎分子是“促炎基因”。在一些实施方式中，促炎分子是“促炎蛋白”。在一些实施方式中，促炎基因编码促炎蛋白。在一些实施方式中，促炎分子是“炎性细胞因子”。

在一些实施方式中，术语“刺激炎症反应”是指刺激炎症细胞因子的产生。

如本文所用，术语“炎性细胞因子”是指从免疫细胞(例如辅助性T细胞和巨噬细胞)分泌并在炎症反应中起作用的信号分子(细胞因子)。

如本文所用，术语“基因表达谱”是指鉴定在样品中表达的基因和/或确定它们在特定时间的表达程度的技术。术语“炎症相关基因表达谱”是指识别炎症相关基因在特定时间表达和/或确定它们的表达程度的基因表达谱。

术语“改善(ameliorating)”是指在治疗疾病状态，例如自身免疫疾病状态(例如，SLE、干燥综合征)中的任何治疗上有益的结果，包括预防、减轻严重性或有进展、缓解或治愈。

如本文所用，术语“原发性干燥综合征(pSS)”、“干燥综合征”、“干燥症(Sjogren’sdisease)”和“干燥症(Sjogren’s)”可以互换使用。

术语“原位”是指在与活生物体分开生长的活细胞中发生的过程，例如，在组织培养物中生长。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

本文使用的术语“哺乳动物”或“受试者”或“患者”包括人类和非人类，包括但不限于人类、非人灵长类、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

术语“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，指当如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查，进行比较和比对以获得最大对应时，具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或多个序列或子序列。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith&Waterman的局部同源算法(Adv Appl Math 1981；2:482)，通过Needleman&Wunsch的同源比对算法(J Mol Biol1970；48:443)，通过Pearson&Lipman的相似性搜索方法(PNAS 1988；85:2444)，通过这些算法的计算机化(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)实现或通过目视检查(一般参见Ausubel et al,infra)。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，其在Altschul et al.,J Mol Biol 1990；215:403-10被描述。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开获得。

术语“足量”是指足以产生所需效果的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

术语“约”将被普通技术人员理解并且将根据其使用的上下文在一定程度上变化。如果考虑到使用该术语的上下文，普通技术人员不清楚该术语的使用，则“约”将表示特定值的正负10％以下。

必须注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。

含有RNase的核酸酶融合蛋白

本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白，包括至少一个具有酶活性的RNase结构域或其片段或变体(如人RNase1，或其片段或变体)，可操作地连接至PK部分，与没有这种PK部分的核酸酶结构域相比，其提供支架和/或在体内延长RNase结构域半衰期。在一些方面，含有RNase的核酸酶融合蛋白是RNase-Fc融合蛋白，其包括至少一个酶促活性的RNase结构域或其片段或变体(如人RNase1，或其片段或变体)，可操作地连接至Fc结构域(如人IgGl Fc结构域，或其变体或片段)，与未与Fc结构域或其变体或片段融合的核酸酶分子相比，其改变与其融合的核酸酶分子的血清半衰期。

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白，经由接头结构域可操作地偶联至Fc结构域或其变体或片段。在一些实施方式中，接头域是接头肽。在一些实施方式中，接头域是接头核苷酸。

在一些实施方式中，本公开的包括RNase-Fc融合蛋白的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括前导序列，例如前导肽。在一些实施方式中，前导分子是位于核酸酶结构域N末端的前导肽。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白在分子的N末端包含前导肽，其中该前导肽随后从RNase-Fc融合蛋白切割下来。产生编码与重组蛋白融合的前导肽的核酸序列的方法是本领域公知的。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白在有或没有与它们的N末端融合的前导物的情况下表达。本领域技术人员可以预测和/或推断融合前导肽切割后本公开的RNase-Fc融合蛋白的蛋白质序列。

在一些实施方式中，前导肽是VK3前导肽(VK3LP)，其中前导肽融合到RNase-Fc融合蛋白的N-末端。这种前导序列可以提高哺乳动物细胞中RNase-Fc融合蛋白的合成和分泌水平。在一些实施方式中，前导序列被切割，产生RNase-Fc融合蛋白。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白在没有融合到其N-末端的前导肽的情况下被表达，并且所得RNase-Fc融合蛋白具有N-末端甲硫氨酸。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白包括融合到RNase-Fc融合蛋白的N末端的VK3前导肽，例如，SEQ ID NO:49(RSLV-132)。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白不包括前导序列，例如，SEQ ID NO:50(RSLV-132)。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括与Fc结构域的N-或C-末端可操作地偶联的RNase结构域，或其变体或片段。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含RNase结构域和DNase结构域两者。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括彼此可操作地串联并进一步可操作地偶联至相同或不同Fc结构域或其变体或片段的N-或C-末端的两个核酸酶结构域(例如，两个RNase结构域)。

序列表提供了示例性的各种构型的RNase-Fc融合蛋白的序列。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是与相同或不同的特异性结合细胞外免疫复合物的Fc结构域或其变体或片段融合的多核酸酶蛋白(例如，两种RNA核酸酶，或一种RNase和一种DNase)。

在一个实施方式中，核酸酶结构域与Fc结构域或其变体或片段的N末端可操作地偶联(例如，化学偶联或遗传融合(例如，直接或通过多肽接头))。在另一个实施方式中，核酸酶结构域与Fc结构域或其变体或片段的C末端可操作地偶联(例如，化学偶联或遗传融合(例如，直接或通过多肽接头))。在其他实施方式中，核酸酶结构域通过Fc结构域或其变体或片段的氨基酸侧链可操作地偶联(例如，化学偶联或遗传融合(例如，直接或通过多肽接头))。

在某些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白包含两个或更多个核酸酶结构域和至少一个Fc结构域，或其变体或片段。例如，核酸酶结构域可以通过在核酸酶结构域和一个或多个Fc结构域，变体或其片段之间的任选的接头，与相同或不同的Fc结构域或其变体或片段的N-末端和C-末端可操作地偶联。在一些实施方式中，核酸酶结构域是相同的，例如RNase和RNase。在其他实施方式中，核酸酶结构域是不同的，例如，两种不同的RNA核酸酶或RNase和DNase。

在一些实施方式中，两个或更多个核酸酶结构域彼此可操作地串联连接(例如，通过多肽接头)，并且核酸酶结构域的串联阵列可操作地偶联(例如，化学缀合或基因融合(例如，直接或通过多肽接头))连接到相同或不同Fc结构域或其变体或片段的C-末端或N-末端。在其他实施方式中，核酸酶结构域的串联阵列与同一Fc结构域或其变体或片段的N-末端和C-末端可操作地偶联。在一些实施方式中，核酸酶结构域可操作地串联连接通过或不通过接头与相同或不同Fc结构域的N-或C-末端可操作地串联连接(例如，N-RNase-RNase-C、N-RNase-DNase-C或N-DNase-RNase-C)。在一些实施方式中，串联RNase-Fc融合蛋白形成同源二聚体或异源二聚体。

在其他实施方式中，一个或多个核酸酶结构域插入在两个Fc结构域或其变体或片段之间。例如，一个或多个核酸酶结构域可以形成本公开的RNase-Fc融合蛋白的多肽接头的全部或部分。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含至少两个核酸酶结构域(例如，RNase和RNase或RNase和DNase)、至少一个接头结构域和至少一个Fc结构域，或其变体或片段。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白包含Fc结构域，或其变体或片段，如本文所述，从而增加RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期和生物利用度。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含一个或多个多肽，如包含如SEQ ID NO:44-58中任一个所示的氨基酸序列的多肽。

本领域技术人员将理解，核酸酶结构域和Fc结构域的其他构型是可能的，在核酸酶结构域之间和/或在核酸酶结构域和Fc结构域之间包括任选的接头。还应当理解，可以改变结构域方向，只要核酸酶结构域在测试的特定构型中是有活性的。

在某些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白具有至少一个对介导生物效应的靶分子特异的核酸酶结构域。在另一个实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白与靶分子(例如RNA或DNA)的结合导致靶分子例如从细胞、组织或循环中的减少或消除。

在其他实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白可以组装在一起或与其他多肽组装以形成具有两个或更多个多肽(“多聚体”)的结合蛋白，其中多聚体的至少一种多肽是本公开的RNase-Fc融合蛋白。示例性的多聚体形式包括二聚体、三聚体、四聚体和六聚体改变的结合蛋白等。在一个实施方式中，多聚体的多肽是相同的(即同聚改变的结合蛋白，例如同源二聚体、同源四聚体)。在另一个实施方式中，多聚体的多肽是不同的(例如，异聚的)。在一个实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白组装在一起形成二聚体。在一个实施方式中，二聚体是同源二聚体。在一个实施方式中，二聚体是异源二聚体。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白相对于未融合至Fc结构域或其变体或片段的相应核酸酶分子，具有增加至少约1.5倍，如至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1000倍或1000倍或更多的血清半衰期。在其他实施方式中，RNase-Fc融合蛋白相对于未融合至Fc结构域或其变体或片段的相应核酸酶分子，具有减少至少约1.5倍，如至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍或500倍或更低的血清半衰期。可以使用本领域公认的常规方法来确定本公开的RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白中RNase的活性不低于对照RNase分子活性的约10倍，如9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白中RNase的活性约等于对照RNase分子的活性。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白可以对含有DNA和/或RNA的细胞外免疫复合物(例如，以可溶形式或沉积的不溶性复合物)有活性。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的活性在体外和/或体内是可检测的。

在另一方面，提供了一种多功能RNase分子，其附着于另一种具有结合特异性的酶或抗体，例如靶向RNA或DNA的scFv或与第一结构域具有相同或不同特异性的第二核酸酶结构域。

在一些实施方式中，接头结构域包括(gly4ser)3、4或5变体，其通过5个氨基酸级数改变接头的长度。在另一个实施方式中，接头结构域的长度约为18个氨基酸并包括N-连接糖基化位点，其对体内蛋白酶切割是敏感的。在一些实施方式中，N-连接糖基化位点可以保护RNase-Fc融合蛋白免于在接头结构域中被切割。在一些实施方式中，N-连接糖基化位点可以帮助分离由接头结构域分开的独立功能结构域的折叠。

在一些实施方式中，接头域是NLG接头(VDGASSPVNVSSPSVQDI)(SEQ ID NO:37)。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括基本上全部或至少DNase的酶活性片段。在一些实施方式中，DNase是I型分泌型DNase，优选人DNase，如成熟人胰腺DNase1(UniProtKB条目P24855，SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，显示出对肌动蛋白的敏感性降低的天然存在的变体等位基因A114F(SEQ ID NO:8)包含在RNase-Fc融合蛋白的DNase1中(参见Pan et al.,JBC1998；273:18374-81；Zhen et al.,BBRC 1997；231:499-504；Rodriguez et al.,Genomics 1997；42:507-13)。在其他实施方式中，显示出相对于野生型DNase1的高DNase活性的天然存在的变异等位基因G105R(SEQ ID NO:9)包括在RNase-Fc融合蛋白的DNase1中(参见Yasuda et al.,Int J Biochem Cell Biol 2010；42:1216-25)。在一些实施方式中，将该突变引入RNase-FC融合蛋白以产生更稳定的人DNase1衍生物。在一些实施方式中，DNase是人的野生型DNase1或人的去除所有潜在N-连接糖基化位点的突变DNase1 A114F，所述位点即SEQ ID NO:6(即人DNase1 N18S/N106S/A114F，SEQ ID NO:11)所示的DNase1结构域的第18和106位的天冬酰胺残基，分别对应于具有天然前导序列的全长胰腺DNase1的第40和128位天冬酰胺残基(SEQ ID NO:5)。

在一些实施方式中，DNase是包含一个或多个碱性(即带正电荷)氨基酸置换以增加DNase功能和染色质切割的人DNase1。在一些实施方式中，将碱性氨基酸在DNA结合界面处引入人DNase1以增强与DNA底物上带负电荷的磷酸盐的结合(参见US 7407785；US6391607)。这种活性过高的DNase1可以被称为“染色质切割器”。

在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个碱性氨基酸置换被引入DNase1。例如，突变一个或多个以下残基以增强DNA结合：Gln9、Glu13、Thr14、His44、Asn74、Asn110、Thr205。在一些实施方式中，前述氨基酸中的一个或多个被碱性氨基酸例如精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸替换。例如，人DNase可以包括一个或多个以下替换：Q9R、E13R、T14K、H44K、N74K、N110R、T205K。在一些实施方式中，人DNase1还包括A114F置换，这降低了对肌动蛋白的敏感性(参见US 6348343)。在一个实施方式中，人DNase1包括以下置换：E13R、N74K、A114F和T205K。

在一些实施方式中，人DNase1还包括去除潜在糖基化位点的突变，例如，SEQ IDNO:6所示的DNase1结构域的第18和106位的天冬酰胺残基，其分别对应于具有天然前导序列的全长胰腺DNase1的第40和128位的天冬酰胺残基。在一个实施方式中，人DNase1包括以下置换：E13R/N74K/A114F/T205K/N18S/N106S。

在一些实施方式中，DNase是DNase 1样(DNaseL)酶，1-3(UniProtKB条目Q13609；SEQ ID NO:15)。在一些实施方式中，DNase是三引物修复外切核酸酶1(TREX1；UniProtKB条目Q9NSU2；SEQ ID NO:16)。在一些实施方式中，DNase是DNase2。在一些实施方式中，DNase2是DNAse2α(即，DNase2；UnitProtKB条目O00115SEQ ID NO:18)或DNase2β(即，DNase2样酸性DNase；UnitProtKB条目Q8WZ79；SEQ ID NO:19)。在一些实施方式中，DNase 1L3、TREX1、DNase2α或DNase2β的N-连接糖基化位点被突变以去除潜在的N-连接糖基化位点。在一些实施方式中，制备含有20或25个氨基酸的接头结构域的DNase-接头-Fc结构域。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白中DNase的活性不低于对照DNase分子活性的约10倍，如9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白中DNase的活性约等于对照DNase分子的活性。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白包括人RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括野生型人RNase 1结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括RNase A家族的人胰腺RNase1(UniProtKB条目P07998；SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的成熟形式的人胰腺RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc结构域包括具有一个或多个突变的人RNase1结构域。在一些实施方式中，人RNase1被突变以去除所有潜在的N-联糖基化位点，即，SEQ ID NO:2(人RNase1 N34S/N76S/N88S,SEQ ID NO:4)中所示的RNase1结构域的第34、76和88位的天冬酰胺残基，分别对应于具有天然前导序列的全长胰腺RNase1的第62、104和116位天冬酰胺残基(SEQ IDNO:1)。在一些实施方式中，制备含有20或25个氨基酸的接头结构域的RNase1-接头-Fc。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括哺乳动物RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括灵长类RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括啮齿动物RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括小鼠RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括大鼠RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括猴RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括山羊RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括兔RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括马RNase1。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括犬RNase1。在一些实施方式中，RNase1结构域是突变的RNase1结构域。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括与与细胞外免疫复合物特异性结合的Fc结构域连接的RNase分子。在一些实施方式中，Fc结构域不能有效地结合Fcγ受体。在一方面，RNase-Fc融合蛋白不能有效结合Clq。在其他方面，RNase-Fc融合蛋白包含IgG1的框内(in frame)Fc结构域。在其他方面，RNase-Fc融合蛋白进一步包含铰链、CH2和/或CH3结构域中的突变。在其他方面，突变是P238S、P331S或N297S，并且可以包括三个铰链半胱氨酸中的一个或多个中的突变。在一些此类方面，根据EU索引编号,突变位于三个铰链半胱氨酸中的一个或多个中的残基220、226和229，如用丝氨酸置换一个或多个半胱氨酸残基，例如C220S、C226S和/或C229S。在一些实施方式中，三个铰链区半胱氨酸之一被丝氨酸置换，例如，C220S在本文中也称为“SCC铰链”。在一些实施方式中，所有三个铰链区半胱氨酸都被丝氨酸、C220S、C226S和C229S置换，在本文中也称为“SSS铰链”。在其他方面，RNase-Fc融合蛋白包含SCC铰链，但其人的IgG1 FcCH2和CH3结构域是野生型，并有效结合Fc受体，促进RNase-Fc融合蛋白摄入它们所结合的细胞内吞室。在其他方面，RNase-Fc融合蛋白具有针对单链和/或双链RNA底物的活性。

在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包括突变的Fc结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包括突变的IgGl Fc结构域。在一些方面，突变的Fc结构域在铰链、CH2和/或CH3结构域中包含一个或多个突变。在一些方面，突变Fc结构域包括P238S突变。在一些方面，突变Fc结构域包括P331S突变。在一些方面，突变Fc结构域包括P238S突变和P331S突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，并且可以包括三个铰链半胱氨酸中的一个或多个中的突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，和/或三个铰链半胱氨酸中的一个或多个突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，和/或三个铰链半胱氨酸突变为SSS或一个铰链半胱氨酸突变为SCC。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S以及三个铰链半胱氨酸中的突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S以及SCC或SSS。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S以及SCC。在一些方面，突变Fc结构域包括P238S SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括P331S和SCC或SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在一些方面，突变Fc结构域包括三个铰链半胱氨酸中的突变。在一些方面，突变Fc结构域包括三个铰链半胱氨酸突变为SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括三个铰链半胱氨酸之一的SCC突变。在一些方面，突变Fc结构域包括SCC或SSS。在一些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:21-28中的任一个所示。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白如SEQ ID NO44-58中的任一个所示。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包含与包含SCC、P238S和P331S的突变型人IgGlFc结构域或包含SSS、P238S和P331S的突变型人IgGlFc结构域连接的野生型人RNasel结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白显示在SEQ ID NO:45-46中。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白显示在SEQ ID NO:50中。

在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包含通过(Gly4Ser)4接头结构域连接至包含SCC、P238S和P331S的突变型人IgGlFc结构域或包含SSS、P238S和P331S的突变型人IgGlFc的野生型人RNasel结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白显示在SEQ ID NO:47-48中。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含人DNase1 G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域连接到包含SCC、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到野生型人RNase1结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含人DNase1 G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域连接到包含SSS、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到野生型人RNase1结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白示显示在SEQ ID NO:51-52中。

在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包含野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域连接到包含SCC、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到人DNase1 G105R A114F结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包含野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域连接到包含SSS、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到人DNase1 G105R A114F结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白显示在SEQ ID NO:53-54中。

在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包含野生型人RNase1结构域，其连接至包含SCC、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到人DNase1 G105R A114F结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白包含野生型人RNase1结构域，其连接至包含SSS、P238S和P331S的通过NLG接头域连接到人DNase1 G105R A114F结构域的突变型人IgG1 Fc结构域。在一些方面，RNase-Fc融合蛋白显示在SEQ ID NO:55-58中。

在一些方面，RNase-Fc融合蛋白的活性在体外和/或体内是可检测的。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括RNase结构域和Fc结构域，其中RNase1结构域位于Fc的COOH侧。在其他实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括RNase结构域和Fc结构域，其中RNase1结构域位于Fc的NH₂侧。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括：RNase-Fc；Fc-RNase；Fc-接头-RNase；RNase-接头-Fc、RNase-Fc-DNase；DNase-Fc-RNase；RNase-接头-Fc-接头-DNase；DNase-接头-Fc-接头-RNase；RNase-Fc-接头-DNase；DNase-Fc-接头-RNase；RNase-接头-Fc-DNase；DNase-接头-Fc-RNase。

在一些实施方式中，酶结构域和RNase-Fc融合蛋白的其他结构域之间的融合连接被优化。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的RNase酶活性的靶标主要是细胞外的，由例如包含在具有抗RNP自身抗体的免疫复合物中的RNA和在经历细胞凋亡的细胞表面上表达的RNA组成。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白在内吞囊泡的酸性环境中具有活性。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括野生型(wt)Fc结构域以例如允许分子结合FcR并通过免疫复合物使用的进入途径进入内吞区室。在一些实施方式中，包括Fc结构域或其变体或片段的RNase-Fc融合蛋白在细胞外和内吞环境(其中可表达TLR7)中均适应为有活性。在一些方面，这允许包括野生型Fc结构域或其变体或片段的RNase-Fc融合蛋白通过先前吞噬的免疫复合物或通过在病毒感染后激活TLR7的RNA来停止TLR7信号传导。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的野生型RNase对RNase细胞质抑制剂的抑制没有抗性。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的野生型RNase在细胞的细胞质中没有活性。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括RNase。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括DNase和RNase。在一些实施方式中，这些RNase-Fc融合蛋白改善了干燥症的治疗，因为它们消化或降解含有RNA、DNA或RNA和DNA组合的免疫复合物，并且在细胞外具有活性。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白减轻干燥症患者的疲劳。

在一些实施方式中，本公开提供编码一种或多种RNase-Fc融合蛋白的核酸，用于治疗或预防病症、疾病和症状的基因治疗方法。基因治疗方法涉及将RNase-Fc融合蛋白核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列导入有需要的动物以实现本公开的一种或多种多肽的表达。该方法可以包括引入一种或多种编码本公开的RNase-Fc融合蛋白的多核苷酸，其与启动子和靶组织表达RNase-Fc融合蛋白所必需的任何其他遗传元件可操作地偶联。

在基因治疗应用中，RNase-Fc融合蛋白基因被引入细胞，以实现治疗有效基因产物的体内合成。“基因疗法”包括通过单次治疗实现持久效果的常规基因疗法和基因治疗剂的施用，其涉及一次性或重复施用治疗有效的DNA或mRNA。可以修饰寡核苷酸以增强它们的吸收，例如，通过用不带电荷的基团取代其带负电荷的磷酸二酯基团。

Fc结构域

在一些实施方式中，包含一个或多个核酸酶结构域或其变体或片段的多肽通过或不通过接头结构域与Fc结构域可操作地偶联，该Fc结构域用作支架以及增加多肽的血清半衰期的手段。在一些实施方式中，一个或多个核酸酶结构域和/或Fc结构域是无糖基化的、去糖基化的或糖基化不足的。在一些实施方式中，Fc结构域是突变型或变体Fc结构域，或Fc结构域的片段。

合适的Fc结构域是本领域众所周知的，包括但不限于Fc和Fc变体，例如在WO2011/053982、WO02/060955、WO02/096948、WO05/047327、WO05/018572和US 2007/0111281(上述内容通过引用并入本文)中公开的那些。使用常规方法(例如，克隆、缀合)将Fc结构域引入本文公开的RNase-Fc融合蛋白(有或没有改变的糖基化)在技术人员的能力范围内。

在一些实施方式中，Fc结构域是野生型人IgGl Fc，例如SEQ ID NO:20所示。在一些实施方式中，Fc结构域是具有一个或多个突变的人IgG1 Fc结构域。

在一些实施方式中，Fc结构域是野生型人IgG4 Fc，如SEQ ID NO:30-31所示。在一些实施方式中，Fc结构域是具有一个或多个突变的人IgG4 Fc结构域。

在一些实施方式中，Fc结构域被改变或修饰，例如通过导致氨基酸添加、缺失或置换的突变。如本文所用，术语“Fc结构域变体”是指与衍生Fc结构域的野生型Fc相比具有至少一个氨基酸修饰(如一个氨基酸置换)的Fc结构域。例如，当Fc结构域源自人IgGl抗体时，与人IgGl Fc区相应位置处的野生型氨基酸相比，变体包含至少一个氨基酸突变(例如，置换)。Fc变体的氨基酸置换可以位于Fc结构域内的一个位置，该位置是指对应于该残基在抗体的Fc区中给出的位置编号(根据EU索引编号)。

在一个实施方式中，Fc变体在位于铰链区或其部分中的一个或多个氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸置换。在另一个实施方式中，Fc变体在位于CH2结构域或其部分中的一个或多个氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸置换。在另一个实施方式中，Fc变体在位于CH3结构域或其部分中的一个或多个氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸置换。在另一个实施方式中，Fc变体在位于CH4结构域或其部分中的一个或多个氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸置换。

在一些实施方式中，Fc结构域包含一个或多个以下氨基酸置换：T350V、L351Y、F405A和Y407V。在一些实施方式中，Fc结构域包含一个或多个以下氨基酸置换：T350V、T366L、K392L和T394W。

在一些实施方式中，人IgGl Fc结构域在N83(即，Kabat编号的N297)处具有突变，产生无糖基化的Fc结构域(例如Fc N83S；SEQ ID NO:21)。在一些实施方式中，人IgG1 Fc结构域包括三个铰链区半胱氨酸(残基220、226和229，根据EU索引编号)中的一个或多个中的突变。在一些实施方式中，Fc结构域中的三个铰链半胱氨酸中的一个或多个可以突变为SCC(SEQ ID NO:24)或SSS(SEQ ID NO:25)，其中“S”代表半胱氨酸被丝氨酸氨基酸置换的氨基酸(其中CCC是指存在于野生型铰链域中的三个半胱氨酸)。因此，“SCC”表示三个铰链区半胱氨酸(残基220、226和229，根据EU索引编号)中仅第一个半胱氨酸被丝氨酸置换，而“SSS”表示铰链区中的所有三个半胱氨酸都被丝氨酸置换(残基220、226和229，根据EU索引编号)。

在一些方面，Fc结构域是具有一个或多个突变的人IgGl Fc结构域。

在一些方面，突变Fc结构域在铰链、CH2和/或CH3结构域中包含一个或多个突变。

在一些方面，Fc结构域是具有一个或多个突变的人IgG4 Fc结构域。在一些实施方式中，IgG4 Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：F296Y、E356K、R409K和H345R。在一些实施方式中，IgG4 Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：F296Y、R409K和K439E。在一些实施方式中，本文公开的RNase-Fc融合蛋白包括包含突变IgG4 Fc结构域的第一多肽，其中Fc结构域包括突变F296Y、E356K、R409K和H345R，以及包含突变IgG4 Fc域的第二多肽，其中CH3结构域包括突变F296Y、R409K和K439E。在一些实施方式中，突变的IgG4 Fc结构域在铰链、CH2和/或CH3结构域中包含一个或多个突变。

CH2置换

在一些方面，突变Fc结构域包括P238S突变。在一些方面，突变Fc结构域包括P331S突变。在一些方面，突变Fc结构域包括P238S突变和P331S突变。在一些方面，根据EU索引编号，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，并且可以包括三个铰链半胱氨酸(残基220、226和229)中的一个或多个中的突变。在一些方面，根据EU索引编号，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，和/或三个铰链半胱氨酸(残基220、226和229)中的一个或多个突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和/或P331S，和/或铰链半胱氨酸突变为SCC或三个铰链半胱氨酸突变为SSS。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S以及三个铰链半胱氨酸中的至少一个中的突变。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S以及SCC。在一些方面，突变Fc结构域包含P238S和P331S和SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括P238S和SCC或SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括P331S和SCC或SSS。(所有编号均根据EU索引)。

在一些方面，突变Fc结构域包括在N-连接糖基化位点处的突变，例如，天冬酰胺替代另一个氨基酸，例如N297S。在一些方面，突变Fc结构域包括在N-连接糖基化位点处(如N297)的突变，例如，天冬酰胺替代另一氨基酸(如丝氨酸)，例如N297S和三个铰链半胱氨酸中一个或多个的突变。在一些方面，突变Fc结构域包括在N-连接糖基化位点处(如N297)的突变，例如，天冬酰胺替代另一氨基酸(如丝氨酸)，例如N297S和三个铰链半胱氨酸之一突变为SCC或所有三个半胱氨酸突变为SSS。在一些方面，突变Fc结构域包括在N-连接糖基化位点处(如N297)的突变，例如，天冬酰胺替代另一种氨基酸(如丝氨酸)，例如N297和在CH2结构域的一个或多个突变，其降低FcγR结合和/或补体活化，例如在P238或P331或两者，例如，P238S或P331S，或P238S和P331S两者的突变。在一些方面，此类突变Fc结构域还可包括铰链区中的突变，例如SCC或SSS。(所有编号均根据EU索引。)在一些方面，突变Fc结构域如本文的序列表或序列表所示。

CH3置换

在一些实施方式中，异源二聚体通过本文公开的异源二聚RNase-Fc融合蛋白上的Fc结构域的CH3结构域中的突变形成。重链首先被工程化为使用“杵臼(knobs-into-holes)”策略进行异源二聚化(Rigway B,et al.,Protein Eng.,9(1996)pp.617-621,incorporated herein by reference)。术语“杵臼”是指通过在他们交互的界面上，在一个多肽中引入一个突起(杵)并在另一个多肽中引入一个空腔(臼)将两个多肽在体外或体内配对的技术。参见例如，WO 96/027011,WO98/050431,US 5,731,168,US2007/0178552,WO2009089004,US20090182127。特别地，CH3结构域中的突变组合可用于形成异源二聚体，例如“杵”重链中的S354C、T366W和“臼”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V。在另一个例子中，“杵”重链中的T366Y和“臼”重链中的Y407T。在一些实施方式中，本文公开的异源二聚体RNase-Fc融合蛋白包括具有杵突变T366W的第一CH3结构域和具有臼突变T366S、L368A和Y407V的第二CH3结构域。(根据EU索引编号。)在一些实施方式中，本文公开的RNase-Fc融合蛋白包括具有杵突变T366Y的第一CH3结构域和具有臼突变Y407T的第二CH3结构域。在一些实施方式中，CH3突变是在US2012/0149876A1、US2017/0158779、US9574010和US9562109中描述的那些，其各自以引用方式并入本文；和Von Kreudenstein,T.S.et al.mABs,5(2013),pp.646-654,通过引用并入本文)并包括以下突变：T350V、L351Y、F405A和Y407V(第一CH3结构域)；和T350V、T366L、K392L、T394W(第二CH3结构域)。在一些实施方式中，本文公开的异源二聚体RNase-Fc融合蛋白包括具有T350V、L351Y、F405A和Y407V突变的第一CH3结构域和具有T350V、T366L、K392L、T394W突变的第二CH3结构域。(根据EU索引编号。)

在一些实施方式中，异源二聚体通过本文公开的RNase-Fc融合蛋白上的Fc结构域的CH3结构域中的突变形成。特别是，CH3结构域中的突变组合可用于形成具有高异源二聚体稳定性和纯度的异源二聚体；例如，参见例如，Von Kreudenstein et al.,mAbs 5:5,646-654；2013年9月至10月，和US2012/0149876A1、US2017/0158779、US9574010和US9562109，其全部内容各自通过引用并入本文。在一些实施方式中，Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：T350V、L351Y、F405A和Y407V。在一些实施方式中，Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：T350V、T366L、K392L和T394W。在一些实施方式中，本文公开的RNase-Fc融合蛋白包括具有突变T350V、L351Y、F405A和Y407V的CH3结构域。在一些实施方式中，本文公开的RNase-Fc融合蛋白包括具有突变T350V、T366L、K392L和T394W的CH3结构域。在一些实施方式中，本文公开的RNase-Fc融合蛋白包括包含突变Fc结构域的第一多肽，其中CH3结构域包括突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，以及包含突变Fc结构域的第二多肽，其中CH3结构域包括突变T350V、T366L、K392L和T394W。

Fc结构域的CH3结构域中的其他突变被考虑优先形成异源二聚体。例如，参见例如，Von Kreudenstein et al.,mAbs 5:5,646-654；2013年9月至10月，通过引用并入本文)。在一些实施方式中，第一多肽的Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：T350V、L351Y、F405A和Y407V，以及第二多肽的Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：T350V、T366L、K392M和T394W。在一些实施方式中，第一多肽的Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：L351Y、F405A和Y407V，第二多肽的Fc结构域中的突变包括一个或多个选自以下突变组的突变：T366L、K392M和T394W。

在一些实施方式中，CH3突变是Moore,G.L.et al.(mABs,3(2011),pp.546-557)描述的那些并包括以下突变：S364H和F405A(第一CH3结构域)；以及Y349T和T394F(第二CH3结构域)。在一些实施方式中，本文公开的异源二聚体RNase-Fc融合蛋白包括具有S364H和F405A突变的第一CH3结构域和具有Y349T和T394F突变的第二CH3结构域。(根据EU索引编号。)

在一些实施方式中，CH3突变是Gunasekaran,K.et al.(J.Biol.Chem.,285(2010),pp.19637-19646)描述的那些并包括以下突变：K409D和K392D(第一CH3结构域)；以及D399K和E365K(第二CH3结构域)。在一些实施方式中，本文公开的异源二聚体RNase-Fc融合蛋白包括具有K409D和K392D突变的第一CH3结构域和具有D399K和E365K突变的第二CH3结构域。(根据EU索引编号。)

本公开的RNase-Fc融合蛋白可以采用本领域公认的Fc变体，其已知赋予效应子功能和/或FcR结合的改变。例如，一个或多个氨基酸位置的变化(例如，置换)被公开在国际PCT公开文本WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、和WO06/085967A2；美国专利公开文本号US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056；或者美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；和7,317,091，其中每一个都通过引用并入本文。在一个实施方式中，可以在一个或多个公开的氨基酸位置进行特定的改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸的特定置换)。在另一个实施方式中，可以在一个或多个公开的氨基酸位置进行不同的改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸位置的不同置换)。

Fc结构域中的其他氨基酸突变被考虑以减少与Fcγ受体和Fcγ受体亚型的结合。依据Kabat的定义将氨基酸残基编号分配给Fc结构域。参见，例如，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(Table of Contents,Introduction and Constant RegionSequences sections),5th edition,Bethesda,MD:NIH vol.1:647-723(1991)；Kabat etal.,"Introduction"Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept ofHealth and Human Services,NIH,5th edition,Bethesda,MD vol.1:xiii-xcvi(1991)；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989),出于所有目的，其中的每一个都以引用方式并入本文。”

例如，Fc区第238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、322、324、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、356、360、373、376、378、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439位的突变可以改变结合，如美国专利2004年5月18日颁布的第6,737,056号美国专利所描述的，其全部内容以引用方式并入本文。该专利报告称，与未突变的IgG3相比，将IgG3中的Pro331改变为Ser导致亲和力降低六倍，表明Pro331参与FcγRI结合。此外，1997年4月29日公布的美国专利5,624,821中公开了位置234、235、236和237、297、318、320和322处的氨基酸修饰可能改变受体结合亲和力，其全部内容以引用方式并入本文。(根据EU索引编号。)

预期使用的其他突变包括，例如，美国专利申请公开号2006/0235208中描述的那些，其公开于2006年10月19日，全部内容以引用方式并入本文。该公开描述了与Fcγ受体结合降低、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性降低或补体依赖性细胞毒性降低的Fc变体，其在Fc区包含至少一个氨基酸修饰，包括232G、234G、234H、235D、235G、235H、236I、236N、236P、236R、237K、237L、237N、237P、238K、239R、265G、267R、269R、270H、297S、299A、299I、299V、325A、325L、327R、328R、329K、330I、330L、330N、330P、330R、和331L(根据EU索引编号)，以及双突变体236R/237K、236R/325L、236R/328R、237K/325L、237K/328R、325L/328R、235G/236R、267R/269R、234G/235G、236R/237K/325L、236R/325L/328R、235G/236R/237K、和237K/325L/328R。该公开中描述的预期使用的其他突变包括227G、234D、234E、234G、234I、234Y、235D、235I、235S、236S、239D、246H、255Y、258H、260H、2641、267D、267E、268D、268E、272H、272I、272R、281D、282G、283H、284E、293R、295E、304T、324G、324I、327D、327A、328A、328D、328E、328F、328I、328M、328N、328Q、328T、328V、328Y、330I、330L、330Y、332D、332E、335D、在位置235和236之间插入G、在位置235和236之间插入A、在位置235和236之间插入S、在位置235和236之间插入T、在位置235和236之间插入N、在位置235和236之间插入D、在位置235和236之间插入V、在位置235和236之间插入L、在位置235和236之间插入G、在位置235和236之间插入A、在位置235和236之间插入S、在位置235和236之间插入T、在位置235和236之间插入N、在位置235和236之间插入D、在位置235和236之间插入V、在位置235和236之间插入L、在位置297和298之间插入G、在位置297和298之间插入A、在位置297和298之间插入S、在位置297和298之间插入D、在位置326和327之间插入G、在位置326和327之间插入A、在位置326和327之间插入T、在位置326和327之间插入D、以及在位置326和327之间插入E(根据EU索引编号)。此外，美国专利申请公开号2006/0235208描述的突变包含227G/332E、234D/332E、234E/332E、234Y/332E、234I/332E、234G/332E、235I/332E、235S/332E、235D/332E、235E/332E、236S/332E、236A/332E、236S/332D、236A/332D、239D/268E、246H/332E、255Y/332E、258H/332E、260H/332E、264I/332E、267E/332E、267D/332E、268D/332D、268E/332D、268E/332E、268D/332E、268E/330Y、268D/330Y、272R/332E、272H/332E、283H/332E、284E/332E、293R/332E、295E/332E、304T/332E、324I/332E、324G/332E、324I/332D、324G/332D、327D/332E、328A/332E、328T/332E、328V/332E、328I/332E、328F/332E、328Y/332E、328M/332E、328D/332E、328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328A/332D、328T/332D、328V/332D、328I/332D、328F/332D、328Y/332D、328M/332D、328D/332D、328E/332D、328N/332D、328Q/332D、330L/332E、330Y/332E、330I/332E、332D/330Y、335D/332E、239D/332E、239D/332E/330Y、239D/332E/330L、239D/332E/330I、239D/332E/268E、239D/332E/268D、239D/332E/327D、239D/332E/284E、239D/268E/330Y、239D/332E/268E/330Y、239D/332E/327A、239D/332E/268E/327A、239D/332E/330Y/327A、332E/330Y/268E/327A、239D/332E/268E/330Y/327A、插入G>297-298/332E、插入A>297-298/332E、插入S>297-298/332E、插入D>297-298/332E、插入G>326-327/332E、插入A>326-327/332E、插入T>326-327/332E、插入D>326-327/332E、插入E>326-327/332E、插入G>235-236/332E、插入A>235-236/332E、插入S>235-236/332E、插入T>235-236/332E、插入N>235-236/332E、插入D>235-236/332E、插入V>235-236/332E、插入L>235-236/332E、插入G>235-236/332D、插入A>235-236/332D、插入S>235-236/332D、插入T>235-236/332D、插入N>235-236/332D、插入D>235-236/332D、插入V>235-236/332D、和插入L>235-236/332D(根据EU索引编号)被考虑使用。突变体L234A/L235A在例如，美国专利申请公开号2003/0108548中被描述，其在2003年6月12日被公开，并通过引用整体并入本文。在实施方式中，所描述的修饰被单独地或组合地包括。(根据EU索引编号。)

PK部分

在一些实施方式中，RNase与PK部分可操作地偶联，其充当支架以及增加RNase的血清半衰期的手段。

合适的PK部分是本领域众所周知的，包括但不限于白蛋白、转铁蛋白、Fc及其变体，以及聚乙二醇(PEG)及其衍生物。合适的PK部分包括但不限于HSA或其变体或片段，如在US5,876,969、WO2011/124718和WO2011/0514789中公开的那些；Fc和Fc变体，如在WO2011/053982、WO02/060955、WO02/096948、WO05/047327、WO05/018572和US2007/0111281中公开的那些；转铁蛋白或其变体或片段，如US7,176,278和US8,158,579中公开的；和PEG或衍生物，如Zalipsky et al.("Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)forModification of Polypeptides"in Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnicaland Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992))，以及Zalipsky et al.Advanced Drug Reviews 1995:16:157-182)，以及美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192、4,179,337和5,932,462(上述内容以引用方式并入本文)中公开的那些。使用常规方法将PK部分(例如，克隆、缀合)可操作地偶联至本发明的RNase在技术人员的能力范围内。

在一些实施方式中，PK部分是天然无糖基化的HSA。

在一些实施方式中，PK部分是野生型Fc(SEQ ID NO:20)。

在某些实施方式中，Fc结构域被改变或修饰，例如通过氨基酸突变(例如，添加、缺失或置换)。如本文所用，术语“Fc结构域变体”是指与衍生Fc结构域的野生型Fc相比具有至少一个氨基酸修饰(如氨基酸置换)的Fc结构域。例如，其中Fc结构域源自人IgGl抗体，与人IgGl Fc区相应位置处的野生型氨基酸相比，变体包含至少一个氨基酸突变(例如，置换)。例如，其中Fc结构域源自人IgG4抗体，与人IgG4 Fc区相应位置处的野生型氨基酸相比，变体包含至少一个氨基酸突变(例如，置换)。

在一些实施方式中，PK部分是本文所述的任何Fc变体。

在一些实施方式中，PK部分是野生型HST。在其他实施方式中，PK部分是在N413和/或N611和/或S12处具有突变的HST(S12是潜在的O-连接糖基化位点)，产生具有改变的糖基化的HST(即HST N413S、HST N611S、HST N413S/N611S和HST S12A/N413S/N611S)。

接头结构域

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括接头结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白包括多个接头结构域。在一些实施方式中，接头域是多肽接头。在某些方面，希望使用多肽接头将Fc或其变体或片段与一个或多个核酸酶结构域融合以形成RNase-Fc融合蛋白。

在一个实施方式中，多肽接头是合成的。如本文所用，关于多肽接头的术语“合成的”包括包含氨基酸序列的肽(或多肽)，所述氨基酸序列(其可以是或可以不是天然存在的)其以线性氨基酸序列连接至其在自然界中并非天然连接的序列(其可以是或可以不是天然存在的)(例如，Fc序列)的。例如，多肽接头可以包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变，例如添加、置换或缺失)或包含第一氨基酸序列(其可以是或可以不是天然存在的)。可以使用本发明的多肽接头，例如，以确保Fc或其变体或片段并置，以确保功能性Fc或其变体或片段的正确折叠和形成。优选地，与本发明相容的多肽接头将是相对非免疫原性的并且不会抑制结合蛋白的单体亚基之间的任何非共价结合。

在某些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白采用如SEQ ID NO:37中所示的NLG接头。

在某些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白采用多肽接头将任何两个或多个符合读框(in frame)的结构域连接到单个多肽链中。在一个实施方式中，两个或更多个结构域可以独立地选自本文讨论的任何Fc结构域、或其变体或片段、或核酸酶结构域。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的RNase结构域通过接头结构域可操作地偶联至Fc结构域。在一些实施方式中，多肽接头可用于融合相同的Fc片段，从而形成同源二聚体Fc区。在其他实施方式中，多肽接头可用于融合不同的Fc片段，从而形成异源二聚体Fc区。在其他实施方式中，本发明的多肽接头可用于将第一个Fc片段的C-末端与第二个Fc片段的N-末端遗传融合以形成完整的Fc结构域。

在一个实施方式中，多肽接头包含Fc结构域的一部分，或其变体或片段。例如，在一个实施方式中，多肽接头可包含Fc片段(例如，C或N结构域)，或Fc结构域或其变体的不同部分。

在另一个实施方式中，多肽接头包含gly-ser接头或由gly-ser接头组成。如本文所用，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser接头包含式(Gly₄Ser)n的氨基酸序列，其中n是正整数(例如1、2、3、4或5)。优选的gly/ser接头是(Gly₄Ser)4。另一种优选的gly/ser接头是(Gly₄Ser)3。另一种优选的gly/ser接头是(Gly₄Ser)5。在某些实施方式中，gly-ser接头可以插入在多肽接头的两个其他序列之间(例如，本文所述的任何多肽接头序列)。在其他实施方式中，gly-ser接头连接在多肽接头(例如，本文所述的任何多肽接头序列)的另一序列的一端或两端。在其他实施方式中，两个或更多个gly-ser接头串联(in series)并入多肽接头中。

在其他实施方式中，本发明的多肽接头包含生物学相关肽序列或其序列部分。例如，生物学相关肽序列可包括但不限于源自抗排异(rejection)或抗炎肽的序列。所述抗排异或抗炎肽可以选自细胞因子抑制肽、细胞粘附抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽。在一个优选的实施方式中，多肽接头包含选自IL-1抑制或拮抗肽序列、促红细胞生成素(EPO)-模拟肽序列、血小板生成素(TPO)-模拟肽序列、G-CSF模拟肽序列、TNF拮抗剂肽序列、整联蛋白结合肽序列、选择素拮抗剂肽序列、抗病原体肽序列、血管活性肠肽(VIP)模拟肽序列、钙调素拮抗剂肽序列，肥大细胞拮抗剂，SH3拮抗剂肽序列，尿激酶受体(UKR)拮抗剂肽序列、生长抑素或皮质抑素模拟肽序列、以及巨噬细胞和/或T细胞抑制肽序列的肽序列。示例性的肽序列公开于美国专利号6,660,843中，其通过引用并入本文，其中任何一个都可以用作多肽接头。

适用于RNase-Fc融合蛋白的其他接头是本领域已知的，例如，US5,525,491中公开的富含丝氨酸的接头、Arai et al.,Protein Eng 2001；14:529-32中公开的螺旋形成肽接头(例如，A(EAAAK)nA(n＝2-5))、以及Chen et al.,Mol Pharm 2011；8:457-65中公开的稳定接头，即二肽接头LE，一种凝血酶敏感的二硫环肽接头、以及α-螺旋形成接头LEA(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄ALE(SEQ ID NO:39)。

其他示例性接头包括GS接头(即(GS)n)、GGSG(SEQ ID NO:40)接头(即(GGSG)n)、GSAT接头(SEQ ID NO:41)、SEG接头和GGS接头(即(GGSGGS)n)，其中n是正整数(例如，1、2、3、4或5)。其他适用于RNase-Fc融合蛋白的接头可以使用公开可用的数据库找到，如接头数据库(ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww)。接头数据库是多功能酶中的结构域间接头的数据库，其用作新型融合蛋白中的潜在接头(参见，例如，George et al.,ProteinEngineering 2002；15:871-9)。

应当理解，可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入编码多肽接头的核苷酸序列中，从而将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入多肽接头，来产生这些示例性多肽接头的变体形式。可以通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)引入突变。

本公开的多肽接头的长度为至少一个氨基酸并且可以具有不同的长度。在一个实施方式中，本发明的多肽接头长度为约1至约50个氨基酸。在上下文中使用的术语“约”表示+/-两个氨基酸残基。由于接头长度必须为正整数，因此长度为约1至约50个氨基酸的长度是指长度为1至48-52个氨基酸的长度。在另一个实施方式中，本公开的多肽接头长度为约10-20个氨基酸。在另一个实施方式中，本公开的多肽接头长度为约15至约50个氨基酸。

在另一个实施方式中，本公开的多肽接头长度为约20至约45个氨基酸。在另一个实施方式中，本公开的多肽接头长度为约15至约25个氨基酸。在另一个实施方式中，本公开的多肽接头是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个或更多个氨基酸的长度。

可以使用本领域已知的技术将多肽接头引入多肽序列中。可以通过DNA序列分析来确认修饰。质粒DNA可用于转化宿主细胞以稳定生产所产生的多肽。

糖基化改变的含有RNase核酸酶的融合蛋白

糖基化(例如，O-连接或N-连接糖基化)可以影响本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白的血清半衰期，例如通过最大限度地减少甘露糖和去唾液酸糖蛋白受体以及其他凝集素样受体从循环中的清除。因此，在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc蛋白，以无糖基化、去糖基化或糖基化不足的形式制备。优选地，N-连接糖基化被改变并且RNase-Fc融合蛋白被无糖基化。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白中符合Asn-X-Ser/Thr(X可以是除Pro之外的任何其他天然存在的氨基酸)共有体的所有天冬酰胺残基被突变为不作为N-连接糖基化受体的残基(例如丝氨酸、谷氨酰胺)，从而当在令蛋白质糖基化的细胞中合成时消除RNase-Fc融合蛋白的糖基化

在一些实施方式中，缺乏N-连接糖基化位点的RNase-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中产生。在一个实施方式中，哺乳动物细胞是CHO细胞。因此，在一个具体实施方式中，在CHO细胞中产生无糖基化的RNase-Fc融合蛋白。

在其他实施方式中，N-糖基化的减少或缺乏，通过在例如宿主(例如，细菌(如大肠杆菌))，被工程化为缺乏一种或多种对糖基化很重要的酶的哺乳动物细胞，或用防止糖基化的试剂(如衣霉素(Dol-PP-GlcNAc形成的抑制剂))处理的哺乳动物细胞，中产生RNase-Fc融合蛋白来实现。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白在低等真核生物中产生，该低等真核生物被工程化以产生具有复杂N-聚糖而非高甘露糖型糖的糖蛋白(参见，例如，US2007/0105127)。

在一些实施方式中，糖基化RNase-Fc融合蛋白(例如，在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中产生的那些)经化学或酶促处理以去除一个或多个碳水化合物残基(例如，一种或多种甘露糖、岩藻糖和/或N-乙酰氨基葡糖残基)或修饰或掩蔽一个或多个碳水化合物残基。此类修饰或掩蔽可降低RNase-Fc融合蛋白与甘露糖受体，和/或去唾液酸糖蛋白受体，和/或其他凝集素样受体的结合。化学去糖基化可以通过用三氟甲磺酸(TFMS)处理RNase-Fc融合蛋白来实现，，如例如Sojar et al.,JBC 1989；264:2552-9and Sojar et al.,MethodsEnzymol 1987；138:341-50中公开的，或通过用氟化氢处理来实现，如Sojar et al.(1987,supra)中公开的。从RNase-Fc融合蛋白中酶促去除N-连接的碳水化合物可以通过用蛋白N-糖苷酶(PNGase)A或F处理RNase-Fc融合蛋白来实现，如Thotakura et al.(MethodsEnzymol 1987；138:350-9)中公开的。其他适合使用的本领域公认的市售去糖基化酶包括内切-α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3和内切糖苷酶H。在一些实施方式中，这些酶中的一种或多种可用于使本公开的RNase-Fc融合蛋白去糖基化。去糖基化的替代方法公开于例如US 8,198,063中。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白是部分去糖基化的。部分去糖基化可以通过用内切糖苷酶(例如，内切糖苷酶H)处理RNase-Fc融合蛋白来实现，所述内切糖苷酶切割N连接的高甘露糖碳水化合物，但不切割复杂类型的碳水化合物，留下一个与天冬酰胺相连的GlcNAc残基。用内切糖苷酶H处理的RNase-Fc融合蛋白将缺乏高甘露糖碳水化合物，导致与肝甘露糖受体的相互作用减少。尽管该受体识别末端GlcNAc，但与蛋白质表面上的单个GlcNAc产生有效相互作用的可能性不如完整的高甘露糖结构。

在其他实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的糖基化被修饰，例如通过氧化、还原、脱水、置换、酯化、烷基化、唾液酸化、碳-碳键裂解等，以减少血液中的RNase-Fc融合蛋白的清除。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白用高碘酸盐和硼氢化钠处理以修饰碳水化合物结构。高碘酸盐处理使邻二醇氧化，裂解碳-碳键并用醛基取代羟基；硼氢化物将醛还原为羟基。许多糖残基包括邻二醇，因此通过这种处理被裂解。用这些药物依次处理溶酶体酶β-葡糖醛酸酶可以证明使用高碘酸盐和硼氢化钠的血清半衰期延长(参见，例如，Houba etal.(1996)Bioconjug Chem 1996:7:606-11；Stahl et al.PNAS 1976；73:4045-9；Achordet al.Pediat.Res 1977；11:816-22；Achord et al.Cell 1978；15:269-78)。一种用高碘酸盐和硼氢化钠处理的方法在Hickman et al.,BBRC 1974；57:55-61中被公开。一种用高碘酸盐和氰基硼氢化物处理的方法增加了蓖麻毒蛋白的血清半衰期和组织分布，其在Thorpe et al.Eur J Biochem 1985；147:197-206被公开。

在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的碳水化合物结构可以通过添加一种或多种额外的干扰甘露糖或去唾液酸糖蛋白受体或其他凝集素样受体识别结构部分来掩蔽。

在一些实施方式中，通过突变编码RNase-Fc融合蛋白的核酸去除一个或多个潜在糖基化位点，从而在使蛋白质糖基化的细胞(例如哺乳动物细胞如CHO细胞)中合成时减少RNase-Fc融合蛋白的糖基化(糖基化不足)。在一些实施方式中，如果例如糖基化不足的RNase-Fc融合蛋白表现出增加的活性或有助于增加的血清半衰期，则可能需要通过突变其中潜在的N-连接的糖基化位点来选择性地糖基化不足的RNase-Fc融合蛋白。在其他实施方式中，如果例如这样的修饰改善了RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期，则可能需要使RNase-Fc融合蛋白的部分糖基化不足，使得某些结构域缺乏N-糖基化。或者，可以修饰糖基化受体附近的其他氨基酸，破坏糖基化酶的识别基序，而不必改变通常被糖基化的氨基酸。

在一些实施方式中，可以通过引入糖基化位点来改变RNase-Fc融合蛋白的糖基化。例如，可以修饰RNase-Fc融合蛋白的氨基酸序列以引入用于Asn-X-Ser/Thr的N-连接糖基化的共有序列(X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。可以在整个RNase-Fc融合蛋白的氨基酸序列中的任何位置添加额外的N-连接糖基化位点。优选地，糖基化位点被引入氨基酸序列中的位置基本上不降低RNase-Fc融合蛋白活性。

据报道，添加O-连接糖基化位点会改变蛋白质(如生长激素、促卵泡激素、IGFBP-6、因子IX和许多其他蛋白质)的血清半衰期(例如，如Okada et al.,Endocr Rev 2011；32:2-342；Weenen et al.,J Clin Endocrinol Metab 2004；89:5204-12；Marinaro et al.,European Journal of Endocrinology 2000；142:512-6；US 2011/0154516中公开的)。因此，在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的O-连接糖基化(在丝氨酸/苏氨酸残基上)被改变。用于改变O-连接糖基化的方法是本领域的常规方法并且可以实现，例如通过β-消除(参见，例如，Huang et al.,Rapid Communications in Mass Spectrometry 2002；16:1199-204；Conrad,Curr Protoc Mol Biol 2001；Chapter 17:Unit17.15A；Fukuda,Curr ProtocMol Biol 2001；Chapter 17；Unit 17.15B；Zachara et al.,Curr Protoc Mol Biol2011；Unit 17.6；)；通过使用市售的试剂盒(例如，GlycoProfile^TM Beta-EliminationKit,Sigma)；或者通过用一系列外切糖苷酶(如但不限于β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)处理RNase-Fc融合蛋白直到只剩下Galβ1-3GalNAc和/或GlcNAcβ1-3GalNAc，然后用例如内切-α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(即O-糖苷酶)处理。此类酶可从例如NewEngland Biolabs商购获得。在其他实施方式中，RNase-Fc融合蛋白被改变以在RNase-Fc融合蛋白中引入O-连接糖基化，如在例如，Okada et al.(supra),Weenen et al.(supra),US2008/0274958；以及US2011/0171218中公开。在一些实施方式中，将一个或多个O-连接糖基化共有位点引入RNase-Fc融合蛋白，如CXXGGT/S-C(SEQ ID NO:59)(van den Steen etal.,In Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,Michael Cox,ed.,1998；33:151-208)，NST-E/D-A(SEQ ID NO:60),NITQS(SEQ ID NO:61),QSTQS(SEQ IDNO:62),D/E-FT-R/K-V(SEQ ID NO:63),C-E/D-SN(SEQ ID NO:64),以及GGSC-K/R(SEQ IDNO:65)。可以在整个RNase-Fc融合蛋白的氨基酸序列中的任何位置添加额外的O-连接糖基化位点。优选地，糖基化位点被引入氨基酸序列中的位置基本上不降低RNase-Fc融合蛋白活性。或者，如例如WO 87/05330和Aplin et al.,CRC Crit Rev Biochem 1981；259-306)中所描述的，通过化学修饰RNase-Fc融合蛋白中的氨基酸来引入O-连接的糖部分。

在一些实施方式中，N-连接和O-连接糖基化位点均被引入RNase-Fc融合蛋白中，优选在氨基酸序列中的位置基本上不降低RNase-Fc融合蛋白活性。

在RNase-Fc融合蛋白中引入、减少或消除糖基化(例如N-连接或O-连接糖基化)并使用本领域的常规方法确定此类糖基化状态的修饰是否增加或减少了RNase-Fc融合蛋白的活性或血清半衰期，完全在技术人员的能力范围内。

在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白可包含改变的糖型(例如，岩藻糖基化不足或不含岩藻糖的聚糖)。

在一些实施方式中，具有改变的糖基化的RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期相对于相应的糖基化RNase-Fc融合蛋白(例如，RNase-Fc融合蛋白，其中潜在的N-连接糖基化位点未发生突变)增加至少约1.5倍，如至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1000倍，或1000倍或更多。可以使用本领域公认的常规方法来确定糖基化状态改变的RNase-Fc融合蛋白的血清半衰期。

在一些实施方式中，具有改变的糖基化的RNase-Fc融合蛋白(例如，无糖基化、去糖基化或糖基化不足的RNase-Fc融合蛋白)保留了相应糖基化RNase-Fc融合蛋白(例如，RNase-Fc融合蛋白，其中潜在的N-连接糖基化位点未发生突变)活性的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％

在一些实施方式中，改变RNase-Fc融合蛋白的糖基化状态可以通过直接增加活性或通过增加生物利用度(例如血清半衰期)来增加活性。因此，在一些实施方式中，具有改变的糖基化的RNase-Fc融合蛋白的活性相对于相应的糖基化RNase-Fc融合蛋白(例如，RNase-Fc融合蛋白，其中潜在的N-连接糖基化位点未发生突变)增加至少1.3倍，如至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍，至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍，或10倍或更高。

技术人员可以使用本领域公认的方法容易地确定RNase-Fc融合蛋白的糖基化状态。在优选的实施方式中，糖基化状态使用质谱法确定。在其他实施方式中，可以评估与伴刀豆球蛋白A(Con A)的相互作用以确定RNase-Fc融合蛋白是否糖基化不足。与相应的糖基化RNase-Fc融合蛋白相比，糖基化不足的RNase-Fc融合蛋白预计与Con A-Sepharose的结合降低。SDS-PAGE分析也可用于比较糖基化不足的蛋白质和相应糖基化蛋白质的迁移率。与糖基化蛋白相比，糖基化不足的蛋白预计在SDS-PAGE中具有更大的迁移率。用于分析蛋白质糖基化状态的其他合适的本领域公认的方法在例如Roth et al.,InternationalJournal of Carbohydrate Chemistry 2012；1-10中公开。

具有不同糖基化状态的RNase-Fc融合蛋白的药代动力学(如血清半衰期)可以使用常规方法测定，例如，通过将RNase-Fc融合蛋白引入小鼠体内，例如静脉内，在预定时间点采集血样，并测定和比较样品中RNase-Fc融合蛋白的水平和/或活性。

制备RNase-Fc融合蛋白的方法

本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白，是使用重组DNA技术在转化或转染的宿主细胞中制备的。为此，制备了编码RNase-Fc融合蛋白的重组DNA分子。制备这种DNA分子的方法是本领域公知的。例如，编码RNase-Fc融合蛋白的序列可以使用合适的限制酶从DNA中剪切。或者，可以使用化学合成技术(如氨基磷酸酯方法)来合成DNA分子。此外，可以使用这些技术的组合。

本发明还包括能够在合适的宿主中表达RNase-Fc融合蛋白的载体。该载体包含编码与适当表达控制序列可操作地偶联的RNase-Fc融合蛋白的DNA分子。在DNA分子插入载体之前或之后影响这种有效连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体核酸酶结构域、起始信号、终止信号、帽信号、聚腺苷酸化信号和其他涉及转录或翻译控制的信号。

其上具有DNA分子的所得载体用于转化或转染合适的宿主。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白可以通过将两个或更多个包含编码RNase-Fc融合蛋白的DNA的表达载体共转染或共转化到合适的宿主中来制备。可以使用本领域公知的方法进行这种转化或转染。

在本发明的实践中可以使用大量可用的和众所周知的宿主细胞中的任何一种。特定宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些包括，例如，与所选表达载体的兼容性、由DNA分子编码的RNase-Fc融合蛋白的毒性、转化或转染率、RNase-Fc融合蛋白的回收容易程度、表达特征、生物安全性和费用。必须理解这些因素之间的平衡，即并非所有宿主对于特定DNA序列的表达都可能同样有效。在这些一般指南中，有用的微生物宿主包括培养的细菌(例如大肠杆菌)、酵母(例如酵母属)和其他真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人类)细胞或本领域已知的其他宿主。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白在CHO细胞中产生。

接下来，培养和纯化转化或转染的宿主。宿主细胞可以在常规发酵或培养条件下培养，以便表达所需的化合物。这种发酵和培养条件是本领域公知的。最后，通过本领域熟知的方法从培养物中纯化RNase-Fc融合蛋白。

化合物也可以通过合成方法制备。例如，可以使用固相合成技术。合适的技术是本领域众所周知的，包括在Merrifield(1973),Chem.Polypeptides,pp.335-61(Katsoyannisand Panayotis eds.)；Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis et al.,Biochem Intl 1985；10:394-414；Stewart and Young(1969),Solid Phase PeptideSynthesis；U.S.Pat.No.3,941,763；Finn et al.(1976),The Proteins(3rd ed.)2:105-253；and Erickson et al.(1976),The Proteins(3rd ed.)2:257-527中公开的那些。在一些实施方式中，含有衍生肽或含有非肽基团的化合物可以通过众所周知的有机化学技术合成。

分子表达/合成的其他方法是本领域普通技术人员通常已知的。

药物组合物

在某些实施方式中，单独施用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白。在某些实施方式中，在施用至少一种其他治疗剂之前施用RNase-Fc融合蛋白。在某些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白与至少一种其他治疗剂的施用同时施用。在某些实施方式中，在施用至少一种其他治疗剂之后施用RNase-Fc融合蛋白。在其他实施方式中，在施用至少一种其他治疗剂之前施用RNase-Fc融合蛋白。本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白与其他试剂/化合物联合。在一些实施方式中，同时施用RNase-Fc融合蛋白和其他药剂。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白和其他药剂不同时施用，在施用所述药剂之前或之后施用RNase-Fc融合蛋白。在一些实施方式中，受试者在相同的预防期、疾病发生期和/或治疗期同时接受RNase-Fc融合蛋白和其他药剂。

本公开的药物组合物可以在联合疗法中施用，即，与其他药剂联合。在某些实施方式中，联合疗法包含与至少一种其他药剂联合的RNase-Fc融合蛋白。药剂包括但不限于体外合成制备的化学组合物、抗体、抗原结合区及其组合和缀合物。在某些实施方式中，药剂可充当激动剂、拮抗剂、别构调节剂或毒素。

在某些实施方式中，本公开提供包含RNase-Fc融合蛋白以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

在某些实施方式中，本公开提供包含RNase-Fc融合蛋白和治疗有效量的至少一种额外治疗剂，以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

在某些实施方式中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。在一些实施方式中，制剂材料用于皮下和/或静脉施用。在某些实施方式中，药物组合物可包含用于改变、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在某些实施方式中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；双糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如明胶)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80、氚、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒介物(delivery vehicles)；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington'sPharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company(1995)。在一些实施方式中，制剂包含PBS；20mM NaOAC,pH 5.2,50mM NaCl；和/或10mMNAOAC,pH 5.2,9％蔗糖。

在某些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白和/或治疗分子与本领域已知的延长半衰期的媒介物连接。此类媒介物包括但不限于聚乙二醇、糖原(例如，RNase-Fc融合蛋白的糖基化)和葡聚糖。此类媒介物在例如美国申请系列号09/428,082(现为美国专利号6,660,843)和公开的PCT申请号WO 99/25044中被描述。

在某些实施方式中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如想要的给药途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,supra。在某些实施方式中，此类组合物可影响本公开的融合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在某些实施方式中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是水性的或非水性的。例如，在某些实施方式中，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料。在一些实施方式中，盐水包括等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方式中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可进一步包含山梨糖醇或其合适的替代物。在某些实施方式中，可以通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于储存的包含RNase-Fc融合蛋白的组合物(具有或不具有至少一种额外的治疗剂)。此外，在某些实施方式中，可以使用合适的赋形剂(如蔗糖)将包含RNase-Fc融合蛋白的组合物(有或没有至少一种额外的治疗剂)制备成冻干物。

在某些实施方式中，可选择药物组合物用于肠胃外递送。在某些实施方式中，可以选择组合物用于吸入或通过消化道递送，如口服。这种药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。

在某些实施方式中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方式中，缓冲液用于将组合物维持在生理pH或轻微低的pH范围内，通常在约5至约8的pH范围内。

在某些实施方式中，当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可以是无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的所需RNase-Fc融合蛋白，有或没有额外的治疗剂。在某些实施方式中，肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中RNase-Fc融合蛋白在有或没有至少一种额外治疗剂的情况下被制备成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方式中，制备可涉及将所需分子与可提供产品的受控或持续释放的试剂进行制剂，然后可通过仓库注射(depot injection)递送所述产品。在某些实施方式中，也可以使用透明质酸，并且可以具有促进循环持续时间的效果。在某些实施方式中，可植入的药物递送装置可用于引入所需的分子。

在某些实施方式中，药物组合物可以制备成用于吸入。在某些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白，有或没有至少一种额外的治疗剂，可以制备成用于吸入的干粉。在某些实施方式中，包含RNase-Fc融合蛋白的吸入溶液，有或没有至少一种额外的治疗剂，可以与用于气雾剂递送的推进剂一起制备。在某些实施方式中，溶液可以被雾化。肺部施用在PCT申请号PCT/US94/001875中被进一步描述，其描述了化学修饰的蛋白的肺部递送。

在某些实施方式中，预期制剂可以口服施用。在某些实施方式中，以这种方式施用的RNase-Fc融合蛋白，在有或没有至少一种额外的治疗剂的情况下，可以与或不与通常用于混合固体剂型(如片剂和胶囊)的那些载体一起制备。在某些实施方式中，胶囊可设计成当在胃肠道中生物利用度最大化且系统前降解最小化的点处释放制剂的活性部分。在某些实施方式中，可以包括至少一种额外的药剂以促进RNase-Fc融合蛋白和/或任何额外的治疗剂的吸收。在某些实施方式中，还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

在某些实施方式中，药物组合物可以包括有效量的RNase-Fc融合蛋白，有或没有至少一种额外的治疗剂，与适合制造片剂的无毒赋形剂混合。在某些实施方式中，通过将片剂溶解在无菌水或另一种合适的媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。在某些实施方式中，合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。

额外的药物组合物对于本领域技术人员来说是显而易见的，包括在持续或受控递送制剂中包含有或没有至少一种额外治疗剂的RNase-Fc融合蛋白的制剂。在某些实施方式中，本领域技术人员也已知用于制备多种其他持续或受控递送手段，如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和仓库注射剂的技术。参见例如，PCT申请号PCT/US93/00829描述了用于药物组合物的递送的多孔聚合物微粒的控释。在某些实施方式中，缓释制剂可以包括成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式的半透聚合物基质。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(美国专利号3,773,919和EP058,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman etal,Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer et al.,JBiomed Mater Res,15:167-277(1981)and Langer,Chem Tech,12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al,supra)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在某些实施方式中，持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的若干方法中的任一种制备。参见，例如，Eppstein et al,PNAS,82:3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方式中，这可以通过无菌过滤膜过滤来实现。在某些实施方式中，若组合物是冻干的，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该灭菌方法。在某些实施方式中，用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方式中，肠胃外组合物通常被放入具有无菌进入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

在某些实施方式中，一旦药物组合物被制备，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。在某些实施方式中，此类制剂可以以即用型形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干的)储存。

在某些实施方式中，提供了用于生产单剂量施用单元的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒可包含具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在某些实施方式中，包括包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和溶血注射器)的试剂盒。在某些实施方式中，治疗上使用的包含RNase-Fc融合蛋白的药物组合物的有效量，有或没有至少一种额外的治疗剂，将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将理解，根据某些实施方式，治疗的适当剂量水平将因此，部分地取决于递送的分子、RNase-Fc融合蛋白的适应症，有或没有至少一种额外的治疗剂、给药途径和患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在某些实施方式中，临床医生可以滴定剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。在某些实施方式中，取决于上述因素，典型的剂量可以在约0.5mg/kg至高达约50mg/kg或更多的范围内。在某些实施方式中，剂量范围可为约5-10mg/kg、约2-8mg/kg、约3-6mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg或约10mg/kg。

在某些实施方式中，给药频率将考虑所用制剂中RNase-Fc融合蛋白和/或任何额外治疗剂的药代动力学参数。在某些实施方式中，临床医生将施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。在某些实施方式中，该组合物因此可以作为单剂给药，或随着时间的推移作为两个或更多个剂(其可能含有或可能不含有相同量的所需分子)或作为经由植入装置或导管的连续输注给药。适当剂量的进一步细化由本领域普通技术人员常规进行并且在他们常规执行的任务范围内。在某些实施方式中，可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当的剂量。

在某些实施方式中，药物组合物的给药途径与已知方法一致，例如口服，通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过缓释系统或植入装置。在某些实施方式中，组合物可通过推注或通过输注或通过植入装置连续施用。

在某些实施方式中，组合物可以通过植入膜、海绵或另一种合适的材料来局部给药，在该材料上已经吸收或包封了所需的分子。在某些实施方式中，若使用植入装置的，该装置可植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可通过扩散、定时释放丸剂或连续施用。

在某些实施方式中，可能需要以离体方式使用包含RNase-Fc融合蛋白的药物组合物，有或没有至少一种额外的治疗剂。在此类情况下，将已从患者体内取出的细胞、组织和/或器官暴露于包含RNase-Fc融合蛋白的药物组合物，有或没有至少一种额外的治疗剂，然后然后将细胞、组织和/或器官移植回患者体内。

在某些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白和/或任何额外的治疗剂可以通过植入某些已经遗传工程化的细胞来递送，使用如本文所述的方法，以表达和分泌多肽。在某些实施方式中，此类细胞可以是动物或人类细胞，并且可以是自体的、异源的或异种的。在某些实施方式中，细胞可以永生化。在某些实施方式中，为了减少免疫反应的机会，可以将细胞封装以避免渗入周围组织。在某些实施方式中，封装材料通常是生物相容的、半透性聚合物外壳或膜，其允许蛋白质产物的释放但防止细胞被患者的免疫系统或来自周围组织的其他有害因素破坏。

体外测定

本领域已知的各种体外测定可用于评估本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白的功效。

例如，培养的来自正常受试者、狼疮患者PBMC或干燥症患者PBMC的人类PBMC被分离、培养并用各种刺激处理(例如，TLR配体、共刺激抗体、免疫复合物和正常或自身免疫血清)，在存在或不存在RNase-Fc融合蛋白的情况下。可以使用市售试剂(如来自Biolegend(San Diego,CA)的针对各种细胞因子(例如，IL-6、IL-8、IL-10、IL-4、IFN-γ和TNF-α)的抗体对试剂盒))测量受刺激细胞产生的细胞因子。在适合测定的不同时间点(例如，24、48小时或以后的时间点)收集培养物上清液，以确定RNase-Fc融合蛋白对细胞因子产生的影响。使用例如可从PBL interferon source(Piscataway,NJ)获得的抗人IFN-α抗体和标准曲线试剂测量IFN-α的产生。使用人类淋巴细胞亚群(分离的单核细胞、B细胞、pDC、T细胞等)进行类似的测定；使用例如可从Miltenyi Biotech(Auburn,CA)获得的市售的基于磁珠的分离试剂盒进行纯化。

多色流式细胞术可用于通过测量淋巴细胞活化受体(如PBMC中的CD5、CD23、CD69、CD80、CD86和CD25)的表达来评估RNase-Fc融合蛋白对免疫细胞活化的影响，或使用本领域公认的常规方法在刺激后不同时间点分离细胞亚群。

RNase-Fc融合蛋白的功效也可以通过将SLE或干燥症(Sjogren’s)患者血清与正常人pDC一起孵育以激活IFN输出来测试，如在例如Ahlin et al.,Lupus 2012:21:586-95；Mathsson et al.,Clin Expt Immunol 2007；147:513-20；and Chiang et al.,J Immunol2011；186:1279-1288中所述。不受理论束缚，SLE或干燥症患者血清中循环的含有核酸免疫复合物，促进核酸抗原通过Fc受体介导的内吞作用进入pDC内体，随后核酸结合并激活内体的TLR7、8和9。为了评估RNase-Fc融合蛋白的影响，将SLE或干燥症患者血清或血浆用RNase-Fc融合蛋白进行预处理，然后加入从健康志愿者中分离的pDC细胞培养物中。然后确定在多个时间点产生的IFN-α的水平。通过降解含有核酸的免疫复合物，有效的RNase-Fc融合蛋白有望减少IFN-α的产生量。

RNase-Fc融合蛋白的有效性通过将用本文公开的RNase-Fc融合蛋白处理的细胞的测定结果与用对照制剂处理的细胞的测定结果进行比较来证明。处理后，相对于处理前存在的标记物水平，或相对于在对照组中测量的水平，有效的RNase-Fc融合蛋白的处理组中，上述各种标记物(例如，细胞因子、细胞表面受体、增殖)的水平通常得到改善。

治疗方法

本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括本公开的RNase-Fc融合蛋白，在治疗自身免疫性疾病或异常免疫反应中特别有效。在这点上，应当理解，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括本公开的RNase-Fc融合蛋白，用于控制、抑制、调节、治疗或消除对外部和自身抗原的不需要的免疫反应。在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括本公开的RNase-Fc融合蛋白，用于治疗或减轻患有自身免疫性疾病的患者的疲劳。在一些实施方式中，疲劳是干燥综合征相关的疲劳。

在一些方面，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白，通过施用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白(如RNase-Fc融合蛋白)，将其以有效量或足够量提供给有需要的人类患者，可用于治疗人类患者的自身免疫性疾病，从而治疗疾病。本公开涵盖了适用于实现所需效果的任何给药途径(例如，静脉内、肌肉内、皮下)。疾病病症的治疗可导致与该病症相关的症状的减少，这可以是长期的或短期的，或者甚至是短暂的有益效果。在一些实施方式中，干燥症的治疗导致与疾病或病症相关的疲劳减少。

生化测定

在一些实施方式中，向有需要的人类患者施用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白以治疗干燥综合征。在一些方面，通过比较与安慰剂相比的用本文公开的RNase-Fc融合蛋白治疗的人类患者的IFN-α水平、IFN-α反应基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环免疫复合物水平来证明RNase-Fc融合蛋白的有效性。

例如，选择或鉴定需要治疗的人类受试者(例如，满足美国-欧洲共识的干燥症分类标准的患者)。受试者可能需要，例如减轻干燥综合征的病因或症状，例如pSS。在一些实施方式中，患者患有干燥综合征并且需要减轻疲劳。受试者的鉴别可以在临床环境中或其他地方进行，例如在受试者的家中通过受试者自己使用自测试剂盒。

在基线(第1天)，向有需要的患者施用合适的第一剂量的本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白。RNase-Fc融合蛋白如本文所述制备。在基线(第1天)和第一次给药后一段时间后，例如，第8天、第15天、第29天、第43天、第57天、第71天、第85天、第99天或研究结束时，例如，通过测量IFN-α水平、IFN-α反应基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环免疫复合物水平评估患者的状况。也可以测量其他相关标准。给药的数量和强度根据受试者的需要进行调整。治疗后，受试者的IFN-α水平、IFN-α反应基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环免疫复合物水平相对于治疗前存在的水平，或相对于在类似患病但未治疗/对照受试者中测量的水平，被降低和/或改善。

疲劳测定

各种患者报告结果(PRO)仪器已在测量慢性病受试者的疲劳中使用并得到验证。此类PRO是本领域已知的并且可用于评估本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白的功效。EULAR干燥综合征患者报告指数(ESSPRI)

欧洲抗风湿病联盟(EULAR)干燥综合征(SS)患者报告指数(ESSPRI)旨在评估原发性干燥综合征患者的症状(Seror et al.,Ann.Rheum.Dis.2011；70:968-972)。ESSPRI被开发为一种全球评分，用于衡量原发性干燥综合征的所有重要和致残症状：干燥、四肢疼痛和疲劳。ESSPRI已被证明足以衡量每个症状而不会损失内容有效性，并且评分很容易计算。

ESSPRI是一种患者管理的问卷，用于评估原发性干燥综合征患者的症状。问卷包括三个量表，以下每个症状一个量表：(1)干燥，(2)肢体疼痛，和(3)疲劳。ESSPRI的每个组成部分都用一个0-10的数字量表来衡量，全球ESSPRI评分是三个量表的平均值：(干燥+肢体疼痛+疲劳)/3。ESSPRI评分下降至少1分具有临床意义。

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。治疗后，与治疗前患者的疲劳水平相比，和/或与用对照制剂治疗的患者相比，由ESSPRI测量的患者的疲劳通常减少。

FACIT-疲劳

慢性疾病治疗疲劳功能评估量表(FACIT-Fatigue)用于评估个人过去一周日常活动中的疲劳程度。

FACIT-疲劳问卷和评分与解释材料可从FACIT.org(Elmhurst,Ill.,USA)获得。FACIT-Fatigue问卷提供了一系列通用和有针对性的测量。FACIT疲劳量表具有许多优点，包括高内部效度、高重测信度、可靠性和对各种慢性健康状况患者变化的敏感性、易用性以及在各种环境中使用(K.F.Tennant,Try This:best Practices in Nursing Care toOlder Adults,Issue 30,2012；Chandran et al.,Ann.Rheum.Dis.2007；66:936-939)。

FACIT-Fatigue是一个包含13项的问卷，最初开发用于测量癌症患者的疲劳，现在用于测量干燥症患者的疲劳。患者被要求回答13个问题，评分从0到4(0＝完全没有，1＝有点，2＝有些，3＝很多，4＝非常)。疲劳量表有13个项目，其中52为最高分。疲劳量表中的较高评分对应于较低的疲劳水平并表明较好的生活质量。

为了计算FACIT疲劳评分，将否定短语问题的回答评分颠倒，然后将13个项目回答相加。有回答的11个项目的得分颠倒了(项目得分＝4-回答，如果回答没有丢失)，两个项目(项目7-8)的回答不变。添加所有项目，以便更高的评分对应于更少的疲劳。在跳过个别问题的情况下，使用量表中其他答案的平均值按比例分配评分。

FACIT-疲劳＝13*[总分(颠倒项目)+总分(项目7-8)]/回答的项目数

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。治疗后，与治疗前患者的疲劳水平相比，和/或与用对照制剂治疗的患者相比，由FACIT疲劳量表测量的患者的疲劳通常减少。

疲劳概况

开发疲劳概况(ProF)是为了建立一种评估工具，该工具可有效表征与原发性干燥综合征相关的疲劳。因此，在ProF问卷中使用了原发性干燥综合征患者用来表达他们对疲劳、不适和疼痛的抱怨的词语。ProF已被证明是一种可靠且有效的工具，可用于测量原发性干燥综合征患者的疲劳和全身不适的严重程度。

ProF是一份16项自填式问卷，分为两个领域，一个是躯体疲劳，一个是精神疲劳。躯体疲劳领域包括12个项目，分为四个方面：(a)需要休息(4个项目)，(b)起步不佳(3个项目)，(c)耐力低(3个项目)，以及(d)肌肉无力(2个项目)。精神疲劳领域包括4个项目，分为两个方面：(a)注意力不集中(两个项目)和(b)记忆力差(两个项目)。根据患者在过去两周内最糟糕的感觉，患者对每个项目评分，范围为0-7(0＝“完全没有问题”和7＝“可以想象的一样糟糕”)。每个方面的评分可以通过将每个方面内的项目评分相加并将总和除以每个方面中的项目数来获得。每个领域(例如，躯体、精神)的评分可以通过将每个领域内的方面评分相加并将总和除以每个领域内的方面数量来获得。评分越高表示疲劳程度越高。(Bowmanet al.,Rheumatology,2004；43:758-764；Strombeck et al.,Scand.J.Rheumatol.2005；34:455-459；Segal et al.,Arthritis Rheum.2008Dec.15；59(12):1780-1787)。

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。治疗后，与治疗前患者的疲劳水平相比，和/或与用对照制剂治疗的患者相比，由PROF测量的患者的疲劳通常减少。

评估干燥综合征相关疲劳的减轻情况

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。在一些实施方式中，当与治疗前患者的疲劳水平相比和/或与用对照制剂治疗的患者相比时，用RNase-Fc融合蛋白治疗的患者将表现出(demonstrate)疲劳减轻。在一些实施方式中，疲劳是干燥综合征相关的疲劳。

在一些实施方式中，通过与治疗前患者的疲劳程度或与受类似折磨的未治疗或对照患者的疲劳程度相比较，通过一种或多种患者报告的指数(例如，ESSPRI、PROF、FACIT)测量患者的疲劳来评估患者的状况。在一些实施方式中，当与用对照制剂治疗的患者相比时，通过评估用本文公开的RNase-Fc融合蛋白治疗的患者的EULAR SS患者报告指数(ESSPRI)、概况或疲劳(PROF)和/或慢性疾病治疗功能评估(FACIT)疲劳量表来证明RNase-Fc融合蛋白的有效性。在一些实施方式中，与治疗前患者的ESSPRI指数、PROF和/或FACIT疲劳量表相比，或与用对照制剂治疗的患者相比，用RNase-Fc融合蛋白治疗的患者将表现出(demonstrate)ESSPRI指数、PROF和/或FACIT疲劳量表有所改善。

例如，选择或鉴别需要治疗的人类受试者(例如，满足美国风湿病学会SLE标准的患者，或满足美国-欧洲共识干燥症分类标准的患者)。受试者可能需要，例如，减轻SLE或干燥综合征的病因或症状(如疲劳)。受试者的鉴别可以在临床环境中或其他地方进行，例如在受试者的家中通过受试者自己使用自测试剂盒。

在基线(第1天)，向有需要的患者施用合适的第一剂量的本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白。RNase-Fc融合蛋白如本文所述制备。在基线(第1天)和第一次给药后一段时间后，例如，第8天、第15天、第29天、第43天、第57天、第71天、第85天、第99天或研究结束时，通过ESSPRI指数、PROF和/或FACIT疲劳量表评估患者的状况。也可以测量其他相关标准。给药的数量和强度根据受试者的需要进行调整。治疗后，可以注意到以下一项或多项结果的改善：(1)相对于治疗前的ESSPRI指数或相对于类似的患病但未治疗/对照受试者的ESSPRI指数的改善，(2)相对于治疗前的PROF或相对于类似的患病但未治疗/对照受试者的PROF的改善，(3)可以注意到相对于治疗前的FACIT疲劳量表或相对于类似的患病但未治疗/对照受试者的FACIT疲劳量表的改善。在一些实施方式中，ESSPRI指数的改善是临床上有意义的改善。ESSPRI指数有临床意义的改善是ESSPRI评分下降至少1分。

疲劳测定的神经心理学分析

本领域已知的各种神经心理学测定可用于评估本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白的功效。

数字符号替换测试

数字符号替换测试(DSST)提供了一种有效且灵敏的测试来衡量受许多领域影响的认知功能障碍。DSST对一系列临床人群(包括干燥综合征患者)的认知功能障碍的存在以及认知功能的变化都很敏感。这种神经心理学测试被广泛使用的、高度经验证的且极其敏感的测试读取执行功能相关的输入。

DSST是一种限时的纸笔认知测试，在一张纸上给出。该测试要求患者根据纸张顶部的键将符号与数字匹配。患者将符号复制到一行数字下方的空格中，并计算在允许的时间内(例如90或120秒)正确符号的数量。该测试提供有关执行任务的准确性和速率的数据。患者在DSST上的表现与现实世界的功能结果相关，如完成日常任务的能力，以及在一系列精神疾病中从功能障碍中的恢复。DSST测试可用于评估患者的注意力和/或专注力。

DSST是一种多因素测试，可测量一系列认知操作，并提供一种实用且有效的方法来随时间监测认知功能。为了在DSST上表现良好，患者必须具有完整的运动速度、注意力和视觉感知功能，包括扫描和书写或绘画的能力(即基本的精神灵活性)。DSST提供了检测认知障碍的高灵敏度性，并具有许多优点，包括简洁、可靠、对变化的敏感性以及最小的语言、文化和教育对测试性能的影响。(Jaeger,J.,Journal of Clinical Psycopharmacology,38(5),513-518,October 2018)。

此外，DSST用于临床开发以定义药代动力学/药效学(PK/PD)关系。该测试还用作CNS研究中的PD生物标记物，可以区分两种剂量的选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)。

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。治疗后，与治疗前患者的认知功能水平相比，和/或与用对照制剂治疗的患者相比，由DSST测试测量的患者的认知功能通常得到改善。

评估干燥综合征相关认知功能的改善

在一些实施方式中，本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性通过评估用本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白包括RNase-Fc融合蛋白或其药物组合物，治疗后患者疲劳的改善来证明。在一些实施方式中，当与治疗前患者的认知功能水平相比和/或与用对照制剂治疗的患者相比时，用RNase-Fc融合蛋白治疗的患者表现出认知功能的改善。在一些实施方式中，患者患有干燥综合征。

在一些实施方式中，通过与治疗前患者的认知功能或与受类似折磨的未治疗或对照患者的认知功能相比较，通过一种或多种一种或多种神经心理学测定(例如，DSST)测量患者的认知功能来评估患者的状况。在一些实施方式中，当与用对照制剂治疗的患者相比时，通过评估用本文公开的RNase-Fc融合蛋白治疗的患者的DSST测试的结果来证明RNase-Fc融合蛋白的有效性。在一些实施方式中，与治疗前患者的DSST测试相比，或与用对照制剂治疗的患者相比，用RNase-Fc融合蛋白治疗的患者将表现出(demonstrate)DSST测试有所改善。

例如，选择或鉴别需要治疗的人类受试者(例如，满足美国风湿病学会SLE标准的患者，或满足美国-欧洲共识干燥症分类标准的患者)。受试者可能需要，例如，减轻SLE或干燥综合征的病因或症状(如疲劳)。受试者的鉴别可以在临床环境中或其他地方进行，例如在受试者的家中通过受试者自己使用自测试剂盒。

在基线(第1天)，向有需要的患者施用合适的第一剂量的本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括RNase-Fc融合蛋白。RNase-Fc融合蛋白如本文所述制备。在基线(第1天)和第一次给药后一段时间后，例如，第8天、第15天、第29天、第43天、第57天、第71天、第85天、第99天或研究结束时，例如通过DSST测试来评估患者的状况。也可以测量其他相关标准。给药的数量和强度根据受试者的需要进行调整。治疗后，DSST测试评分相对于治疗前的DSST测试评分或相对于类似的患病但未治疗/对照受试者有所改善。

给药方案

通过本领域技术人员已知的常规方法将本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白，包括本公开的RNase-Fc融合蛋白和/或本公开的药物组合物，制备成用于人类受试者的药学上可接受的剂型。在一些实施方式中，本公开的药物组合物中活性成分(即，RNase-Fc融合物)的实际剂量水平被改变(are varied)以获得一定量的活性成分，其对特定人类患者、组合物和/或给药方式有效实现所需的治疗反应，而不会对患者产生不可接受的毒性。

所选剂量水平将取决于多种因素，包括特定的RNase-Fc融合蛋白的活性、施用途径、施用时间、施用的特定RNase-Fc融合蛋白的排泄或代谢速率、吸收的速率和程度、治疗的持续时间、与特定RNase-Fc融合蛋白联合使用的其他药物、化合物和/或材料、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和接受治疗的患者的既往病史、以及医学领域众所周知的因素。

一般而言，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物的合适剂量是在人类受试者中可有效产生治疗效果的最低剂量的活性成分的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，用于人类患者的本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物的静脉内、口服和皮下剂量，当用于所示效果时，范围为每周每千克体重约0.5mg至约50mg。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或药物组合物以每周每公斤体重约0.5mg至约50mg的剂量通过注射(例如，通过静脉内注射，例如，通过输注)施用给有需要的人类患者。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以通常每周约1-20mg/kg、每周2-10mg/kg、每周5-15mg/kg、每周5-10mg/kg、或每周2-5mg/kg的剂量施用于人类患者。在一些实施方式中，每周大于10mg/kg、或大于15mg/kg或大于20mg/kg的剂量可能是必要的。在一些实施方式中，每周小于20mg/kg、或小于15mg/kg或小于10mg/kg的剂量可能是必要的。在一些实施方式中，肠胃外给药如例如静脉注射施用于人类患者为每周约5-10mg/kg。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以约0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg 25mg/kg的每周、每两周、每月或每半月(例如，每2个月、每3个月)的剂量施用于人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以1mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以2mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以3mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以4mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以5mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以6mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以7mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以8mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以9mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以10mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以12mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，RNase-Fc融合蛋白以15mg/kg每周、每两周、每月或每半月的剂量施用给人类患者。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

如果需要，将本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物的每周、每两周、每月或半月有效剂量，任选地在单位剂型中，作为两个、三个、四个、五个、六个或更多的子剂量施用给人类患者，在一天中以适当的间隔分开施用(例如，作为静脉注射或输液)。在一些实施方式中，给药是每天一次施用。在一些实施方式中，根据需要，给药是每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月一次或多次施用，以获得治疗效果(例如，足以消化与自身抗体和/或含有免疫复合物的RNA复合的循环RNA)。在一些实施方式中，给药是每周一次施用(例如，静脉内注射或输注)。在一些实施方式中，给药是每两周一次或多次施用。在一些实施方式中，给药是每两周一次施用。在一些实施方式中，给药是每月一次或多次施用。在一些实施方式中，给药是每月一次施用。在一些实施方式中，给药是每半月(例如，每2个月、每3个月)一次或多次施用。在一些实施方式中，给药是每2个月或每3个月一次施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

在一些实施方式中，给药是每周一次施用(例如静脉注射或输注)持续两周，然后每两周施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，给药是每周一次施用持续三周，然后每两周施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，给药是每周一次施用持续四个星期，然后每两周施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，给药是每周一次施用持续两周，然后每月施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，给药是每周一次施用持续三周，然后每月施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，给药是每周一次施用持续四个星期，然后每月施用一次以达到或维持治疗效果。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。如本文所用，最初的每周施用随后每两周、每月或每半月给药被称为“负荷剂量(loading dose)”。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约1mg/kg的剂量每周施用(例如，通过静脉注射或输注)。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约3mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约4mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约6mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约7mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约8mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约9mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约12mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约15mg/kg的剂量每周施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。如本文所用，每周(weekly)被理解为具有每周(every week)的本领域公认的含义。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约1mg/kg的剂量每两周施用(例如，通过静脉注射或输注)。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约3mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约4mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约6mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约7mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约8mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约9mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约12mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约15mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。如本文所用，每两周(biweekly)被理解为具有每两周(every two week)的本领域公认的含义。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约1mg/kg的剂量每三周一次施用(例如，通过静脉注射或输注)。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约3mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约4mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约6mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约7mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约8mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约9mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约12mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约15mg/kg的剂量每三周一次施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。如本文所用，每三周一次(every third week)被理解为具有每三周一次(once every three weeks)的本领域公认的含义。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约1mg/kg的剂量每月施用(例如，通过静脉注射或输注)。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约3mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约4mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约6mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约7mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约8mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约9mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约12mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约15mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。如本文所用，每月(monthly)被理解为具有每月(every month)的本领域公认的含义。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用(例如，通过静脉内注射或输注)持续两周，然后以约2mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约2mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约2mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用持续两周，然后以约2mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约2mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约2mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约2mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用(例如，通过静脉内注射或输注)持续两周，然后以约5mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约5mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约5mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用持续两周，然后以约5mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约5mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约5mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约5mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用(例如，通过静脉内注射或输注)持续两周，然后以约10mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约10mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约10mg/kg的剂量每两周施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用持续两周，然后以约10mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用持续三周，然后以约10mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，本公开的RNase-Fc融合蛋白或组合物以约10mg/kg的剂量每周施用持续四周，然后以约10mg/kg的剂量每月施用。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

如在本领域中所理解的，每周、每两周、每三周或每月施用可以是如上所述的一次或多次施用或分剂量。

在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约2mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约3mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约4mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约5mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约6mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约7mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约8mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约9mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每周约10mg/kg。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约2mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约3mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约4mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约5mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约6mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约7mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约8mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约9mg/kg。在一个实施方式中，RNase-Fc融合蛋白的有效量为每个人类受试者每两周约10mg/kg。在一些实施方式中，前述剂量被制备成用于静脉注射。

炎症相关分子的方法和用途

本文提供了本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关基因、炎症相关蛋白、促炎分子)的诊断和治疗的方法和用途。本文进一步提供了通过检测从受试者获得的样品中一种或多种炎症相关分子(例如，量或表达水平)的存在或确定其量或表达水平来鉴定患有干燥症的可能对本文所述的RNA核酸酶试剂的治疗有响应的受试者的方法，其中一种或多种炎症相关分子的存在或量或表达水平指示受试者可能对RNA核酸酶试剂的治疗有响应。

炎症相关分子

在一些方面，本公开提供了用于检测来自受试者的样品(例如来自患有干燥综合征的受试者的样品)中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的存在或确定炎性相关分子的量或表达水平的方法。在一些方面，本公开提供了通过确定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱，并且比较从受试者获得的样品中测定的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用核糖核酸酶核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的候选者的方法，其中炎症相关基因表达谱指示受试者是用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的候选者。

如本文所用，术语“炎症相关分子”是指在炎症或炎症反应中起作用的分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是促炎分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是抗炎分子。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症介质。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关蛋白。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关细胞因子。在一些实施方式中，炎症相关分子是炎症相关基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4、STAT5B、CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4和/或STAT5B。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-5。

在一些实施方式中，炎症相关基因是TNF受体。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-6受体。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-1辅助蛋白。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL1。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL-17受体A。

在一些实施方式中，炎症相关基因是LTBR4。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT5B。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL10(IP-10)。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CD163。

在一些实施方式中，炎症相关基因是RIPK2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CCR2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL5，其是编码蛋白质“白介素5(IL-5)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是TNFRSF1A，其是编码蛋白质“TNF受体超家族成员1A”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL6R，其是编码蛋白质“白介素6受体(IL-6受体)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL1RAP，其是编码蛋白质“白介素1受体辅助蛋白”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL1，其是编码蛋白质“C-X-C基序趋化因子配体1(CXCL1)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL17RA，其是编码蛋白质“白介素17受体A”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是LTB4R，其是编码蛋白质“白三烯B4受体”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT5B，其是编码蛋白质“信号转导和转录激活因子5B(转录因子STAT5B)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL10，其是编码蛋白质“C-X-C基序趋化因子配体10(IP-10)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CD163，其是编码蛋白质“CD163”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是RIPK2，其是编码蛋白质“受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CCR2，其是编码蛋白质“C-C基序趋化因子受体2(CCR2)”的基因。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R、STAT5B、CXCL10、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R和/或STAT5B。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL10、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是APOL3、HGF、TBC1D23、SETD6、CCR2、CD47、CD163、CD36、CYBB、PLA2G7、IDO1、RIPK2、ACER3、CXCL10、AIMP1、BIRC3、SNX4、PTPN2、VAMP7、APPL1、CSF1、GBA、GPS2、AKT1、MAPKAPK2、PGLYRP1、NUPR1、TNFRSF1A、MAPK13、ORM2、CCN3、F11R、NFAM1、IL17RA、MMP25、ADAM8、NDST1、FOS、NLRP12、PIK3CD、IL1RAP、IL1R2、STAT5B、TREM1、SIRPA、IL6R、SLC11A1、LTB4R、BCL6、MMP9、FPR1、FPR2、TBXA2R、NOD2、IL1RN、IL5、CXCL1、TPST1、ZC3H12A、TYROBP和/或CDK19。

在一些实施方式中，炎症相关基因是APOL3。在一些实施方式中，炎症相关基因是HGF。在一些实施方式中，炎症相关基因是TBC1D23。在一些实施方式中，炎症相关基因是SETD6。在一些实施方式中，炎症相关基因是CCR2。在一些实施方式中，炎症相关基因是CD47。在一些实施方式中，炎症相关基因是CD163。在一些实施方式中，炎症相关基因是CD36。在一些实施方式中，炎症相关基因是CYBB。在一些实施方式中，炎症相关基因是PLA2G7。在一些实施方式中，炎症相关基因是IDO1。在一些实施方式中，炎症相关基因是RIPK2。在一些实施方式中，炎症相关基因是ACER3。在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL10。在一些实施方式中，炎症相关基因是AIMP1。在一些实施方式中，炎症相关基因是BIRC3。在一些实施方式中，炎症相关基因是SNX4。在一些实施方式中，炎症相关基因是PTPN2。在一些实施方式中，炎症相关基因是VAMP7。在一些实施方式中，炎症相关基因是APPL1。在一些实施方式中，炎症相关基因是CSF1。在一些实施方式中，炎症相关基因是GBA。在一些实施方式中，炎症相关基因是GPS2。在一些实施方式中，炎症相关基因是AKT1。在一些实施方式中，炎症相关基因是MAPKAPK2。在一些实施方式中，炎症相关基因是PGLYRP1。在一些实施方式中，炎症相关基因是NUPR1。在一些实施方式中，炎症相关基因是TNFRSF1A。在一些实施方式中，炎症相关基因是MAPK13。在一些实施方式中，炎症相关基因是ORM2。在一些实施方式中，炎症相关基因是CCN3。在一些实施方式中，炎症相关基因是F11R。在一些实施方式中，炎症相关基因是NFAM1。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL17RA。在一些实施方式中，炎症相关基因是MMP25。在一些实施方式中，炎症相关基因是ADAM8。在一些实施方式中，炎症相关基因是NDST1。在一些实施方式中，炎症相关基因是FOS。在一些实施方式中，炎症相关基因是NLRP12。在一些实施方式中，炎症相关基因是PIK3CD。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL1RAP。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL1R2。在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT5B。在一些实施方式中，炎症相关基因是TREM1。在一些实施方式中，炎症相关基因是SIRPA。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL6R。在一些实施方式中，炎症相关基因是SLC11A1。在一些实施方式中，炎症相关基因是LTB4R。在一些实施方式中，炎症相关基因是BCL6。在一些实施方式中，炎症相关基因是MMP9。在一些实施方式中，炎症相关基因是FPR1。在一些实施方式中，炎症相关基因是FPR2。在一些实施方式中，炎症相关基因是TBXA2R。在一些实施方式中，炎症相关基因是NOD2。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL1RN。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL5。在一些实施方式中，炎症相关基因是CXCL1。在一些实施方式中，炎症相关基因是TPST1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZC3H12A。在一些实施方式中，炎症相关基因是TYROBP。在一些实施方式中，炎症相关基因是CDK19。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT1和STAT2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT1。

在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT2。

在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF606和TRIM37。

在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF606。

在一些实施方式中，炎症相关基因是TRIM37。

在一些实施方式中，炎症相关基因是ACKR3和MAP3K8。

在一些实施方式中，炎症相关基因是ACKR3。

在一些实施方式中，炎症相关基因是MAP3K8。

在一些实施方式中，炎症相关基因是“STAT1”，其是编码蛋白质“信号转导和转录激活因子1”的基因，其是细胞因子信号通路的关键介质。

在一些实施方式中，炎症相关基因是“STAT2”，其是编码蛋白质“信号转导和转录激活因子2”的基因，其是细胞因子信号通路的关键介质。

在一些实施方式中，炎症相关基因是“ZNF606”，其是编码蛋白质“锌指蛋白606”的基因，其在宿主对病毒感染的反应中起作用。

在一些实施方式中，炎症相关基因是“TRIM37”，其是编码蛋白质“含有三联基序的蛋白质37”的基因，其在I类MHC介导的抗原呈递通路中起作用。

在一些实施方式中，炎症相关基因是“MAP3K8”，其是编码蛋白质“丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶8”的基因，其是NFκB、TNF、IL-2和TLR4信号传导的诱导剂。

在一些实施方式中，“ACKR3”是指编码蛋白质“非典型趋化因子受体3”的基因，其用作CXCL11和CXCL12的受体。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CRELD1、PARVG、ACAP1、RXRB、COX19、CERS4、B4GALT7、ZNF329、ZFAND2B、NELFB、EMD、UBTF、PYCR2、RNF216、SEC24C、NUMA1、CARD11、EMG1、ZNF576、TRAF2、MAP2K7、CDK4、KHDC4、GIPC1、ILF3、GBP4、FCER1G、STAT1、STAT2、DTX3L、EPSTI1、PARP9、TRIM22、SP140、TRIM5、PSMB9、MAP3K8、ACOT9、XRCC2、KLF5、NBPF10、PRUNE2、LACTB、FAM241A、CCDC169、KLHL33、KDM1B、FANCL、MR1和/或TRIM13。

在一些实施方式中，炎症相关基因是PLCB1、EFHC2、RING1、REV1、HIBADH、C2ORF68、PPP2R2A、HADHA、ENY2、ZNF671、ERP29、TOB1、NUDT16L1、ZNF329、ZFAND2B、YIPF2、SNUPN、ZNF606、ELAC1、ECI1、HAX1、PFDN6、COQ8B、GOLGA8N、TOMM7、PIK3C2B、LOXHD1、FAM122C、IGHD、SYS1、OR2A42、OR2A1、IL4R、GRB10、RAB20、MOB3C、KLHL33、USF3、PFFIBP1、CD40、PLEKHA2、ABL2、PI3、TIMELESS、CLHC1、KMT5A、BCL7A、HACE1、TRIM37和/或C5ORF22。

在一些实施方式中，炎症相关基因是KHDC4、PMS2、GIMAP1-GIMAP5、SLC25A25、EML2、ZNF790、VSIG1、AXIN2、DHRS3、TESPA1、RGPD5、SPOUT1、TRAF3IP3、RPL13A、NUDT16L1、ACKR3、TFPT、SPAG7、TOB1、ZFAND2B、ZNF329、UBTF、HIC2、TRMT61A、ZNF324B、PRKCE、PLEKHA2、BCL7A、ZNF608、TIMELESS、FCHSD2、SMG7、ATXN1、CNNM2、SIPA1L2、CDKL5、TSKU、GGA3、TESK2、BTN2A2、UBXN7、CHP2、MAP3K8、POU5F2、NF1、XRCC2、NME9、KLHL33、MR1和/或USF3。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CRELD1、PARVG、ACAP1、RXRB、COX19、CERS4、B4GALT7、ZNF329、ZFAND2B、NELFB、EMD、UBTF、PYCR2、RNF216、SEC24C、NUMA1、CARD11、EMG1、ZNF576、TRAF2、MAP2K7、CDK4、KHDC4、GIPC1、ILF3、GBP4、FCER1G、STAT1、STAT2、DTX3L、EPSTI1、PARP9、TRIM22、SP140、TRIM5、PSMB9、MAP3K8、ACOT9、XRCC2、KLF5、NBPF10、PRUNE2、LACTB、FAM241A、CCDC169、KLHL33、KDM1B、FANCL、MR1、TRIM13、PLCB1、EFHC2、RING1、REV1、HIBADH、C2ORF68、PPP2R2A、HADHA、ENY2、ZNF671、ERP29、TOB1、NUDT16L1、ZNF329、ZFAND2B、YIPF2、SNUPN、ZNF606、ELAC1、ECI1、HAX1、PFDN6、COQ8B、GOLGA8N、TOMM7、PIK3C2B、LOXHD1、FAM122C、IGHD、SYS1、OR2A42、OR2A1、IL4R、GRB10、RAB20、MOB3C、KLHL33、USF3、PFFIBP1、CD40、PLEKHA2、ABL2、PI3、TIMELESS、CLHC1、KMT5A、BCL7A、HACE1、TRIM37、C5ORF22、KHDC4、PMS2、GIMAP1-GIMAP5、SLC25A25、EML2、ZNF790、VSIG1、AXIN2、DHRS3、ESPA1、RGPD5、SPOUT1、TRAF3IP3、RPL13A、NUDT16L1、ACKR3、TFPT、SPAG7、TOB1、ZFAND2B、ZNF329、UBTF、HIC2、TRMT61A、ZNF324B、PRKCE、PLEKHA2、BCL7A、ZNF608、TIMELESS、FCHSD2、SMG7、ATXN1、CNNM2、SIPA1L2、CDKL5、TSKU、GGA3、TESK2、BTN2A2、UBXN7、CHP2、MAP3K8、POU5F2、NF1、XRCC2、NME9、KLHL33、MR1和/或USF3。

在一些实施方式中，炎症相关基因是CRELD1。在一些实施方式中，炎症相关基因是PARVG。在一些实施方式中，炎症相关基因是ACAP1。在一些实施方式中，炎症相关基因是RXRB。在一些实施方式中，炎症相关基因是COX19。在一些实施方式中，炎症相关基因是CERS4。在一些实施方式中，炎症相关基因是B4GALT7。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF329。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZFAND2B。在一些实施方式中，炎症相关基因是NELFB。在一些实施方式中，炎症相关基因是EMD。在一些实施方式中，炎症相关基因是UBTF。在一些实施方式中，炎症相关基因是PYCR2。在一些实施方式中，炎症相关基因是RNF216。在一些实施方式中，炎症相关基因是SEC24C。在一些实施方式中，炎症相关基因是NUMA1。在一些实施方式中，炎症相关基因是CARD11。在一些实施方式中，炎症相关基因是EMG1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF576。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRAF2。在一些实施方式中，炎症相关基因是MAP2K7。在一些实施方式中，炎症相关基因是CDK4。在一些实施方式中，炎症相关基因是KHDC4。在一些实施方式中，炎症相关基因是GIPC1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ILF3。在一些实施方式中，炎症相关基因是GBP4。在一些实施方式中，炎症相关基因是FCER1G。在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT1。在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT2。在一些实施方式中，炎症相关基因是DTX3L。在一些实施方式中，炎症相关基因是EPSTI1。在一些实施方式中，炎症相关基因是PARP9。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRIM22。在一些实施方式中，炎症相关基因是SP140。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRIM5。在一些实施方式中，炎症相关基因是PSMB9。在一些实施方式中，炎症相关基因是MAP3K8。在一些实施方式中，炎症相关基因是ACOT9。在一些实施方式中，炎症相关基因是XRCC2。在一些实施方式中，炎症相关基因是KLF5。在一些实施方式中，炎症相关基因是NBPF10。在一些实施方式中，炎症相关基因是PRUNE2。在一些实施方式中，炎症相关基因是LACTB。在一些实施方式中，炎症相关基因是FAM241A。在一些实施方式中，炎症相关基因是CCDC169。在一些实施方式中，炎症相关基因是KLHL33。在一些实施方式中，炎症相关基因是KDM1B。在一些实施方式中，炎症相关基因是FANCL。在一些实施方式中，炎症相关基因是MR1。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRIM13。在一些实施方式中，炎症相关基因是PLCB1。在一些实施方式中，炎症相关基因是EFHC2。在一些实施方式中，炎症相关基因是RING1。在一些实施方式中，炎症相关基因是REV1。在一些实施方式中，炎症相关基因是HIBADH。在一些实施方式中，炎症相关基因是C2ORF68。在一些实施方式中，炎症相关基因是PPP2R2A。在一些实施方式中，炎症相关基因是HADHA。在一些实施方式中，炎症相关基因是ENY2。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF671。在一些实施方式中，炎症相关基因是ERP29。在一些实施方式中，炎症相关基因是TOB1。在一些实施方式中，炎症相关基因是NUDT16L1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF329。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZFAND2B。在一些实施方式中，炎症相关基因是YIPF2。在一些实施方式中，炎症相关基因是SNUPN。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF606。在一些实施方式中，炎症相关基因是ELAC1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ECI1。在一些实施方式中，炎症相关基因是HAX1。在一些实施方式中，炎症相关基因是PFDN6。在一些实施方式中，炎症相关基因是COQ8B。在一些实施方式中，炎症相关基因是GOLGA8N。在一些实施方式中，炎症相关基因是TOMM7。在一些实施方式中，炎症相关基因是PIK3C2B。在一些实施方式中，炎症相关基因是LOXHD1。在一些实施方式中，炎症相关基因是FAM122C。在一些实施方式中，炎症相关基因是IGHD。在一些实施方式中，炎症相关基因是SYS1。在一些实施方式中，炎症相关基因是OR2A42。在一些实施方式中，炎症相关基因是OR2A1。在一些实施方式中，炎症相关基因是IL4R。在一些实施方式中，炎症相关基因是GRB10。在一些实施方式中，炎症相关基因是RAB20。在一些实施方式中，炎症相关基因是MOB3C。在一些实施方式中，炎症相关基因是KLHL33。在一些实施方式中，炎症相关基因是USF3。在一些实施方式中，炎症相关基因是PFFIBP1。在一些实施方式中，炎症相关基因是CD40。在一些实施方式中，炎症相关基因是PLEKHA2。在一些实施方式中，炎症相关基因是ABL2。在一些实施方式中，炎症相关基因是PI3。在一些实施方式中，炎症相关基因是TIMELESS。在一些实施方式中，炎症相关基因是CLHC1。在一些实施方式中，炎症相关基因是KMT5A。在一些实施方式中，炎症相关基因是BCL7A。在一些实施方式中，炎症相关基因是HACE1。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRIM37。在一些实施方式中，炎症相关基因是C5ORF22。在一些实施方式中，炎症相关基因是KHDC4。在一些实施方式中，炎症相关基因是PMS2。在一些实施方式中，炎症相关基因是GIMAP1-GIMAP5。在一些实施方式中，炎症相关基因是SLC25A25。在一些实施方式中，炎症相关基因是EML2。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF790。在一些实施方式中，炎症相关基因是VSIG1。在一些实施方式中，炎症相关基因是AXIN2。在一些实施方式中，炎症相关基因是DHRS3。在一些实施方式中，炎症相关基因是ESPA1。在一些实施方式中，炎症相关基因是RGPD5。在一些实施方式中，炎症相关基因是SPOUT1。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRAF3IP3。在一些实施方式中，炎症相关基因是RPL13A。在一些实施方式中，炎症相关基因是NUDT16L1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ACKR3。在一些实施方式中，炎症相关基因是TFPT。在一些实施方式中，炎症相关基因是SPAG7。在一些实施方式中，炎症相关基因是TOB1。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZFAND2B。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF329。在一些实施方式中，炎症相关基因是UBTF。在一些实施方式中，炎症相关基因是HIC2。在一些实施方式中，炎症相关基因是TRMT61A。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF324B。在一些实施方式中，炎症相关基因是PRKCE。在一些实施方式中，炎症相关基因是PLEKHA2。在一些实施方式中，炎症相关基因是BCL7A。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF608。在一些实施方式中，炎症相关基因是TIMELESS。在一些实施方式中，炎症相关基因是FCHSD2。在一些实施方式中，炎症相关基因是SMG7。在一些实施方式中，炎症相关基因是ATXN1。在一些实施方式中，炎症相关基因是CNNM2。在一些实施方式中，炎症相关基因是SIPA1L2。在一些实施方式中，炎症相关基因是CDKL5。在一些实施方式中，炎症相关基因是TSKU。在一些实施方式中，炎症相关基因是GGA3。在一些实施方式中，炎症相关基因是TESK2。在一些实施方式中，炎症相关基因是BTN2A2。在一些实施方式中，炎症相关基因是UBXN7。在一些实施方式中，炎症相关基因是CHP2。在一些实施方式中，炎症相关基因是MAP3K8。在一些实施方式中，炎症相关基因是POU5F2。在一些实施方式中，炎症相关基因是NF1。在一些实施方式中，炎症相关基因是XRCC2。在一些实施方式中，炎症相关基因是NME9。在一些实施方式中，炎症相关基因是KLHL33。在一些实施方式中，炎症相关基因是MR1。在一些实施方式中，炎症相关基因是USF3。

因此，在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种炎症相关基因的减少。在一些方面，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL-1、IL-17受体A、LTBR4和/或STAT5B。在一些方面，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R和/或STAT5B。

因此，在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种炎症相关基因的减少和疲劳的改善。在一些方面，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL-1、IL-17受体A、LTBR4和/或STAT5B。在一些方面，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R和/或STAT5B。

在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种炎症相关基因的增加。在一些方面，炎症相关基因是CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种炎症相关基因的增加和疲劳的改善。在一些方面，炎症相关基因是CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。

在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种细胞因子增加。在一些方面，细胞因子是CXCL10(IP-10)。

在一些方面，本公开提供用于治疗有需要的患者的干燥症的方法，该方法包括向患者施用有效量的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)，其中治疗导致一种或多种细胞因子的增加和疲劳的改善。在一些方面，细胞因子是CXCL10(IP-10)。

在一些方面，本公开提供了通过确定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者的方法；并且将患有干燥症的受试者的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱进行比较，其中炎症相关基因表达谱指示受试者是用RNA核酸酶试剂治疗的候选者。在一些方面，炎症相关基因包括MAP3K8、ACKR3、STAT1、STAT2、TRIM37和/或ZNF606。

因此，在一些方面，本公开提供了通过检测从受试者获得的样品中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的存在来鉴定可能对本文所述的RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)的治疗有响应的患有干燥综合征的受试者的方法，其中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的存在表明受试者可能对药剂治疗有响应。在一些方面，确定样品中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的量或表达水平并将其与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的参考量或参考表达水平进行比较。在一些方面，当样品中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的量或表达水平相对于炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的参考量或参考表达水平增加时，那么患者可能对本文公开的RNA核酸酶试剂的治疗有响应。在一些方面，当样品中炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的量或表达水平相对于炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的参考量或参考表达水平降低时，那么患者可能对本文公开的RNA核酸酶试剂的治疗有响应。

在一些方面，本公开提供了一种鉴定可能对本文所述的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗有响应的患者的方法，其中来自患者的样品与核酸探针接触，该核酸探针与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的DNA或RNA中的互补靶序列杂交，从而在核酸探针与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的DNA或RNA之间形成杂交复合物。为了检测探针与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的靶DNA或RNA序列的杂交，探针用分子标记物标记；例如，放射性标记、荧光标记、酶标记或地高辛。在一些方面，探针-靶标复合物的存在表明患者可能对治疗有响应。在一些方面，将样品中探针-靶标复合物的量与对照进行比较。在一些方面，当样品中探针-靶标复合物的量相对于对照增加时，患者可能对用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应。在一些方面，当样品中探针-靶标复合物的量相对于对照减少时，患者可能对用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应。

在一些方面，本公开提供了一种鉴定可能对本文所述的RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗有响应的患者的方法，其中来自患者的样品与特异性结合炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白)或其抗原结合片段的抗体接触，从而与炎症相关分子形成复合物，检测抗体-炎症相关分子复合物的存在，其中复合物的存在表明患者可能对治疗有响应。在一些方面，将样品中抗体-炎症相关分子复合物的量与对照进行比较。在一些方面，当样品中抗体-炎症相关分子复合物的量相对于对照增加时，患者可能对用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应。在一些方面，当样品中抗体-炎症相关分子复合物的量相对于对照减少时，患者可能对用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应。

诊断方法

本公开提供了与在一个或多个样品中检测和/或定量本文所述的一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)(例如，STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8)相关的方法，其中单独或组合的一种或多种炎症相关分子的检测和/或定量将表明RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)将为患有干燥症的患者提供治疗效果或益处的可能性。

本文提供了通过测定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者的方法；并且将患有干燥症的受试者的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱进行比较，其中炎症相关基因表达谱指示受试者是用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的候选者。在一些方面，基因表达谱中的炎症相关基因包括MAP3K8、ACKR3、STAT1、STAT2、TRIM37和/或ZNF606。

本文进一步提供了通过测定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者的方法；并且将患有干燥症的受试者的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱进行比较，其中当来自患有干燥症的受试者的样品中一种或多种炎症相关基因的量等于或大于从合适的对照受试者获得的样品中一种或多种炎症相关基因的量时，炎症相关基因表达谱指示受试者是用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的候选者。在一些实施方式中，基因表达谱中的炎症相关基因包括ZNF606和/或ACKR3。

本文进一步提供了通过测定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者的方法；并且将患有干燥症的受试者的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱进行比较，其中当来自患有干燥症的受试者的样品中一种或多种炎症相关基因的量少于从合适的对照受试者获得的样品中一种或多种炎症相关基因的量时，炎症相关基因表达谱指示受试者是用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的候选者。在一些实施方式中，基因表达谱中的炎症相关基因包括STAT1、STAT2、TRIM37和/或MAP3K8。

本文进一步提供了通过测定从受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱来鉴定患有干燥症的受试者作为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者的方法，其中该谱中的炎症相关基因包括MAP3K8、ACKR3、STAT1、STAT2、TRIM37和/或ZNF606；并且将患有干燥症的受试者的炎症相关基因表达谱与从合适的对照受试者获得的样品中的炎症相关基因表达谱进行比较，并将受试者鉴定为用RNA核酸酶试剂治疗的候选者，其中a)样品中ZNF606的表达水平相对于对照增加；b)样品中ACKR3的表达水平相对于对照增加；c)样品中STAT1的表达水平相对于对照降低；d)样品中STAT2的表达水平相对于对照降低；e)样品中TRIM37的表达水平相对于对照降低；f)样品中MAP3K8的表达水平相对于对照降低；或g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的任意组合。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：确定从患者获得的样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)(例如，STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8)的量相对于炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的参考量，其中样品中炎症相关分子(例如炎症相关基因)的量相对于炎症相关分子(例如炎症相关基因)的参考量指示患者对治疗有响应的可能性。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：确定从患者获得的样品中一种或多种炎症相关基因的量；并且将样品中一种或多种炎症相关基因的量与一种或多种炎症相关基因的参考量进行比较，其中当样品中一种或多种炎症相关基因的量等于或大于一种或多种炎症相关基因的参考量时，患者可能对治疗有响应。在一些实施方式中，炎症相关基因是ZNF606和/或ACKR3。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：确定从患者获得的样品中一种或多种炎症相关基因的量；并且将样品中一种或多种炎症相关基因的量与一种或多种炎症相关基因的参考量进行比较，其中当样品中一种或多种炎症相关基因的量小于一种或多种炎症相关基因的参考量时，患者可能对治疗有响应。在一些实施方式中，炎症相关基因是STAT1、STAT2、TRIM37和/或MAP3K8。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：确定患者样品中一组炎症相关基因的表达水平，其中该组包含STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8；将样品中该组的表达水平与对照中该组的表达水平进行比较，其中样品中炎症相关基因的量相对于对照中炎症相关基因的量指示患者对治疗有响应的可能性。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：确定患者样品中一组炎症相关基因的表达水平，其中该组包含STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8；将样品中该组的表达水平与对照中该组的表达水平进行比较，并鉴定可能对RNA核酸酶试剂的治疗有响应的患者，其中a)样品中ZNF606的表达水平相对于对照增加；b)样品中ACKR3的表达水平相对于对照增加；c)样品中STAT1的表达水平相对于对照降低；d)样品中STAT2的表达水平相对于对照降低；e)样品中TRIM37的表达水平相对于对照降低；f)样品中MAP3K8的表达水平相对于对照降低；或者g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的任意组合。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：将样品与核酸探针接触，该酸探针与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的DNA或RNA中的互补靶序列杂交，从而在核酸探针与炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的DNA或RNA之间形成杂交复合物；确定样品中复合物的量相对于参考样品中复合物的量，其中样品中复合物的量相对于参考样品中复合物的量指示患者对用RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)治疗敏感的可能性。

本文进一步提供了鉴定可能对使用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗有响应的干燥症患者的方法，所述方法包括：使样品与至少一种特异性结合炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的诊断抗体或其抗原结合片段接触，从而形成诊断性抗体-炎症相关分子复合物；确定样品中复合物相对于参考样品中复合物的量，其中样品中复合物的量相对于参考样品中复合物的量表明患者对用RNA核酸酶试剂(例如RSLV-132)治疗敏感的可能性。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一个或多个炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性的变化指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。在一些方面，一种或多种炎症相关分子是炎症相关基因。在一些方面，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4、STAT5B、CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。在一些方面，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R、STAT5B、CXCL10、CD163、RIPK2和/或CCR2。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一个或多个炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性的降低指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。在一些方面，一种或多种炎症相关分子是炎症相关基因。在一些方面，炎症相关基因是IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4和/或STAT5B。在一些方面，炎症相关基因是IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R和/或STAT5B。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一个或多个炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平和/或活性的增加指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。在一些方面，一种或多种炎症相关分子是炎症相关基因。在一些方面，炎症相关基因是CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性的增加指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。在一些方面，细胞因子是CXCL10(IP-10)。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性的降低指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。

本文进一步提供了用于监测用RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)治疗的干燥症患者的响应的方法，所述方法包括：确定在用RNA核酸酶试剂治疗前获得的患者的第一个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；确定在用RNA核酸酶试剂治疗后获得的来自患者的第二个样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性；比较第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性与第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，其中相对于第一样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性，第二样品中一种或多种细胞因子的表达水平和/或活性的变化指示用RNA核酸酶试剂治疗的患者的响应。在一些方面，细胞因子是CXCL10(IP-10)。

炎症相关分子的测定

可以通过多种方法和技术检测或确定样品中一种或多种本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关基因、炎症相关蛋白、促炎分子如促炎基因或促炎蛋白)的存在或量或表达水平，所述方法和技术检测是本领域已知的且技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫过滤测定(ELIFA)、流式细胞术、MassARRAY、蛋白质组学、基于血液的定量测定(例如血清ELISA)、生化酶活性测定、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PCR)和其他扩增型检测方法(如分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、微阵列分析、基因表达谱分析和/或基因表达系列分析(SAGE)、以及可通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的多种分析中的任何一种。评估基因和基因产物状态的典型方案见于，例如Ausubel et al.,eds.,1995,Current Protocols In Molecular Biology,Units 2(Northern Blotting),4(Southern Blotting),15(Immunoblotting)and 18(PCR Analysis)。也可以使用多重免疫测定如可从基于规则的医学或中观尺度发现(“MSD”)获得的那些。结合本公开的炎症相关分子的诊断抗体可从多种商业来源获得，例如BD Biosciences、ebiosciences、BioLegend、Abcam等。

核酸炎症相关分子技术

在一些实施方式中，本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平可以是核酸表达水平。在一些实施方式中，使用qPCR、rtPCR、RNA-Seq、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、基因表达谱、SAGE、MassARRAY技术或原位杂交(例如，FISH)确定核酸表达水平。在一些实施方式中，炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平在来自干燥症患者的细胞中确定。在一些实施方式中，本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关基因)的表达水平在来自干燥症患者的血细胞中确定。

评估细胞中mRNA的方法是本领域已知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交试验(如使用对一种或多种基因特异的标记核糖探针进行原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增试验(如使用对一种或多种基因特异的互补引物的RT-PCR，以及其他扩增类型的检测方法，例如分支DNA、SISBA、TMA等)。此外，此类方法可包括允许确定生物样品中目标mRNA水平的一个或多个步骤(例如，通过同时检查“管家(housekeeping)”基因(如肌动蛋白家族成员)的比较对照mRNA序列的水平)。

本公开的炎症相关分子(例如，炎症相关基因、促炎基因)的核酸序列是本领域已知的。在一些实施方式中，本公开的炎症相关分子(例如，炎症相关基因)包括IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4、STAT5B、CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和/或CCR2。在一些实施方式中，本公开的炎症相关分子(例如，炎症相关基因)包括IL5、TNFRSF1A、IL6R、IL1RAP、CXCL1、IL17RA、LTB4R、STAT5B、CXCL10、CD163、RIPK2和/或CCR2。在一些实施方式中，本公开的炎症相关分子(例如，炎症相关基因)包括STAT1、STAT2、ZNF606、TRIM37、ACKR3和/或MAP3K8。

在一些实施方式中，可以确定扩增的目标cDNA的序列。方法包括通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样品中的mRNA(如目标mRNA)的实验方案。使用核酸微阵列，来自测试和对照组织样本的测试和对照mRNA样本被逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将探针与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。阵列被配置成使得阵列的每个成员的顺序和位置是已知的。例如，其表达与包含RNA核酸酶试剂(例如，RSLV-132)的治疗的增加或减少的临床益处相关的基因的选择可以排列在固体支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交指示来源自该探针的样品表达该基因。

包括本文所述的任何诊断方法作为涉及用于鉴定可能受益于本文所述治疗(例如，选择治疗或干预)的患者的方法，或涉及治疗的开发(例如，在临床试验中招募患者)的任何方法的一部分，所述治疗的开发比那些不包括诊断方法的方法具有优势，因为可以确定其成员预计需要和/或不需要、受益或对治疗有响应的患者群体。

因此，在一些实施方式中，适用于本公开的炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))是诊断性炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))。在一些实施方式中，炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎症基因))是监测性炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))。在一些实施方式中，炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))是预测性炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))。

炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))可以是其检测指示特定生理状态(例如，疾病状态)的物质或生物事件。例如，患者血清中炎症相关基因的存在可能指示疾病(例如，干燥综合征)。治疗前在患者中测量的炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))可用于确定适合纳入临床试验的患者。治疗后炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))的变化可以预测或识别与候选药物相关的安全问题，或揭示预期预测治疗最终获益的药理活性。炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))可以通过提供关于药物性能的可定量预测来减少药物开发和评估中的不确定性，并且它们可以有助于剂量选择。复合炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))包括规定算法中的几个单独的炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))，当单个炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))未能提供评估所需的所有相关信息时，该算法会达到单一解释性读数(single interpretive readout)。

替代终点是一种炎症相关分子(例如，炎症相关基因或促炎分子(例如，促炎基因))，旨在替代临床终点，并预期基于流行病学、治疗、病理生理或其他科学证据来预测临床益处。

蛋白质炎症相关分子技术

在一些实施方式中，炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白)的量通过确定炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的蛋白质表达水平来测量。本领域有许多已知的和本文描述的测量或确定蛋白质表达水平的技术，它们可用于本公开提供的方法中。例如，在一些实施方式中，炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的蛋白质表达水平使用选自流式细胞术(例如，荧光激活细胞分选(FACS^TM))、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱学、质谱和HPLC的方法来确定。

在一些实施方式中，在允许结合炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的条件下，使样品与特异性结合本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的抗体接触，并且检测由抗体和炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))形成的复合物的存在。在一些实施方式中，使样品与与本文所述的炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的组合特异性结合的抗体组合接触。在一些实施方式中，在来自患有干燥症的患者的细胞中测定炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的蛋白质表达水平。在一些实施方式中，在来自干燥症患者的血细胞中测定炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的蛋白质表达水平。

在一些实施方式中，样品中炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的量使用结合炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))的诊断抗体来确定。在一些实施方式中，抗炎相关分子诊断抗体特异性结合炎症相关分子(例如，炎症相关蛋白或促炎分子(例如，促炎蛋白))。在一些实施方式中，诊断抗体是非人源抗体。在一些实施方式中，诊断抗体是大鼠、小鼠或兔抗体。在一些实施方式中，诊断抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，诊断抗体被直接标记。在其他实施方式中，诊断抗体被间接标记。

试剂盒

本公开提供包含本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白的试剂盒，包括RNase-Fc融合蛋白和使用说明书。所述试剂盒可在合适的容器中包含本文公开的RNase-Fc融合蛋白、一种或多种对照、以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。在一些实施方式中，所述试剂盒包括可注射溶液，其包含RNase-Fc融合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方式中，可注射溶液被制备成用于静脉内施用。在一些实施例中，所述试剂盒包括使用说明书。

所述容器可以包括至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，RNase-Fc融合蛋白可以放入其中，并且在一些情况下，适当地等分。在提供附加组件的情况下，所述试剂盒我可包含可放置该组件的附加容器。所述试剂盒还可以包括用于容纳RNase-Fc融合蛋白的工具和任何其他密闭的试剂容器，用于商业销售。这种容器可以包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶被保留在其中。容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明和/或警告的标签。

实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方式的实施例。提供的实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook,et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry3^rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(l992)。

实施例1

RNase-Fc融合蛋白编码表达载体的产生

本公开的含有RNase的核酸酶融合蛋白的各种实施方式呈现在序列表(表1)中。构建了示例性的RNase-Fc融合蛋白，RSLV-132，其结构如图1所示。具体而言，从RNase-Fc融合蛋白的氨基酸序列开始，使用Genescript(Genescript,Piscatawy,N.J.)的密码子优化直接合成编码RNase-Fc融合蛋白的多核苷酸，以实现在哺乳动物细胞中的最佳表达。优化过程涉及，例如，尽可能避免非常高(>80％)或非常低(<30％)GC含量的区域，并避免顺式作用序列基序，如内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列延伸、RNA不稳定性基序、重复序列和RNA二级结构，以及高等真核生物中的隐蔽剪接供体和受体位点。编码RNase-Fc融合蛋白的DNA被克隆到pcDNA3.1+哺乳动物表达载体中。RSLV-132是一种具有以下构型(图1)的RNase-Fc融合蛋白，产生RSLV-132。

RSLV-132是包含两个多肽的同源二聚体，每个多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。同源二聚体的每个多肽都具有RNase-Fc构型，其中野生型人RNase 1结构域(SEQ IDNO:2)不通过接头可操作地偶联至包含SCC铰链和CH2突变P238S和P331S(SEQ ID NO:22)的人IgGl Fc结构域的N端。

实施例2

瞬时表达和表达RNase-Fc融合蛋白的稳定哺乳动物细胞系

对于瞬时表达，使用FreeStyle^TM MAX试剂，使用制造商推荐的转染方案，将来自实施例1的含有RNase-Fc融合蛋白插入物的表达载体瞬时转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中例如，CHO-S细胞(例如，FreeStyle^TM CHO-S细胞，Invitrogen)。CHO-S细胞保存在含有2mML-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的FreeStyle^TM CHO表达培养基中。

使用本领域已知的常规方法产生表达RNase-Fc融合蛋白的稳定CHO-S细胞系。例如，CHO-S细胞可以用包含RNase-Fc融合蛋白的核酸序列以及编码标记物(例如，GFP，可通过磁珠选择的表面标记物)的核酸序列的病毒(例如，逆转录病毒、慢病毒)感染，该标记物被选择用于例如流式细胞术或磁珠分离(例如，MACSelect^TM系统)。或者，可以使用本领域已知的任何转染方法(如上面提到的电穿孔(Lonza)或FreeStyle^TM MAX试剂)用包含RNase-Fc融合蛋白的核酸序列和可选择标记物的载体转染CHO-S细胞，然后使用例如流式细胞术进行选择。可选择标记物可以整合到与编码RNase-Fc融合蛋白的载体相同的载体或单独的载体中。

通过使用填充有蛋白A琼脂糖珠的柱来捕获分子，然后在柱洗涤缓冲液(例如，90mM Tris、150mM NaCl、0.05％叠氮化钠)中洗涤并使用合适的洗脱缓冲液(例如，0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0)从柱中释放分子，来从培养物上清液中纯化RNase-Fc融合蛋白。使用Centricon浓缩器在PBS中连续旋转通过缓冲液交换进一步浓缩洗脱材料，然后通过0.2μm过滤装置过滤。使用标准分光光度法(例如Bradford、BCA、Lowry、Biuret测定)确定RNase-Fc融合蛋白的浓度。

实施例3

研究设计和患者特征

进行了一项多中心、双盲安慰剂对照研究，以评估8次静脉输注RSLV-132对28名原发性干燥综合征(pSS)患者的影响。根据2002年美欧共识小组(AEGC)，研究参与者年龄在18-85岁之间，被诊断患有原发性干燥综合征。具体而言，该研究是在一部分干燥症患者中进行的，这些患者的抗Ro 52/60自身抗体水平升高，并且血细胞中干扰素刺激的基因表达水平升高(例如，筛选时出现阳性干扰素特征)。研究对象被要求在基线访问之前的30天内保持稳定的联合用药(concomitant medications)。在基线30天内禁用羟氯喹；基线90天内禁用贝利木单抗、阿巴西普或TNF抑制剂；或在基线180天内禁用环磷酰胺或利妥昔单抗。进一步要求患者既往没有头颈部放疗、淋巴瘤、移植物抗宿主病或IgG4相关疾病。在进入研究前60天内(即在基线访问之前)对潜在受试者进行筛选以评估他们进入研究的资格。三十名受试者被筛选并随机进入研究。两名受试者在接受研究治疗前撤回同意。28名受试者参加了这项随机、双盲、安慰剂对照的2期研究(clinicaltrials.gov：NCT03247686)。在研究的第1天进行基线评估。在基线评估之后，患者接受了RSLV-132或安慰剂的第一次输注。

每个受试者按3:1(活性药物：安慰剂)随机分组，并在基线时接受8次10mg/kgRSLV-132或安慰剂输注，每周一次持续两周(三剂)，然后在接下来的10周的研究内每两周一次(即，在第1天(基线)、第8、15、29、43、57、71和85天进行静脉输注)。通过EESPRI、FACIT和疲劳概况(PROF)测量的患者报告结果用于通过比较研究的基线和第99天来评估活性组与对照组。患者报告结果是在第1、29、57、85和99天(或治疗结束)在接受当天剂量之前测量的。在第99天测量疗效终点，在第141、176和211天进行安全性随访。

RSLV-132以9.5mg/mL的浓度存在于一次性小瓶中，该小瓶含有5.3mL不含防腐剂的无菌溶液，包括用于静脉输注稀释的缓冲液。0.9％氯化钠溶液用作安慰剂输注。

该研究是根据赫尔辛基宣言和国际协调会议(ICH)药品临床试验管理规范(GCP)指南的原则进行的。获得了伦理委员会和机构审查委员会的批准，并且所有患者都提供了书面知情同意书。

实施例4

基线时患者特征的评估

为了评估治疗组之间的差异(即，安慰剂治疗的患者与RSLV-132治疗的患者相比)并建立用于分析的基线水平，在治疗前获得了人口统计学和疾病特征。基线患者特征分析包括补体C3和补体C4水平、IgG水平(mg/dL)、ESR水平、ESSDAI评分、ESSPRI评分、FACIT评分和疲劳概况(ProF)的分析。

补体C3和补体C4(C3/C4)测量用于评估免疫系统的激活。血液中C3/C4的测量值用作免疫活性的读取。血液测试测量特定的补体蛋白(C3或C4)并以毫克每分升报告。血液中低水平的C3/C4可以指示疾病或自身免疫。

免疫球蛋白G(IgG)占血清免疫球蛋白的约80％。测量血液样本中的IgG水平可能指示疾病状态。血液中IgG的量通常以毫克每分升报告。

红细胞沉降率(ESR)用作体内炎症的筛查。通常情况下，由于血浆纤维蛋白原、免疫球蛋白和其他急性期反应蛋白的增加，红细胞在某些疾病状态下沉降得更快。红细胞形状或数量的变化也可能影响ESR。将抗凝全血置于狭窄的垂直管中，红细胞在重力作用下从血浆中沉淀出来。它们沉降的速率以一小时后出现在柱子顶部的透明血浆的毫米数(mm/hr)来衡量。

欧洲抗风湿病联盟(EULAR)干燥综合征(SS)疾病活动指数(ESSDAI)是作为对全身活动的同质评估(Seror et al.,Ann Rheum Dis.2010；69(6):1103-1109)而开发的。ESSDAI包括12个领域(即器官系统：皮肤、呼吸、肾脏、关节、肌肉、周围神经系统、中枢神经系统、血液学、腺体、体质性淋巴结病、生物学)。每个领域分为3-4个活动水平。每个活动水平的定义由对该领域应考虑的内容的详细描述提供。可能的评分范围在0-123之间，大约80％的患者评分≤13。

治疗组之间的基线的人口统计学、疾病特征和生化数据相似(表2)。具体而言，研究人群患有由ESSDAI评分确定的轻度至中度疾病和由ESSPRI评分确定的高度疾病活性。研究对象还报告了极度疲劳。安慰剂组的ESSDAI和ESSPRI评分略高于RSLV-132组。补体3、补体4、ESR和IgG测量值与健康值相当，并且两组之间相似(表2)。

表2在基线时的研究对象人口统计学和平均临床特征

实施例5

接受RSLV-132治疗的患者的ESSPRI评分和ESSPRI疲劳都有临床意义的改善

pSS是一种自身免疫性疾病，其特征在于唾液腺和泪腺的淋巴浸润，伴随随后的炎症、腺体损伤和功能丧失导致眼睛干涩和口干。pSS的临床特征可分为两组：(1)可致残并影响大多数患者的良性症状如干燥、疼痛和疲劳；以及(2)可能很严重的全身表现，影响20-40％的患者(Seror et al.Ann Rheum Dis 2011；70:968-972)。

EULAR SS患者报告指数(ESSPRI)旨在评估原发性干燥综合征患者的症状，并已得到FDA的验证和接受。ESSPRI评估患者的干燥、疼痛和疲劳，并以0-10的数字量表评估每种症状。ESSPRI评分下降至少1分具有临床意义。

在研究过程中，接受RSLV-132治疗的患者的ESSPRI评分下降超过1分(图2)。具体而言，接受RSLV-132的患者的ESSPRI评分从基线时的约6分下降到第99天时的约4.5分(图2)，患者自基线的变化为-1.20(图3和表3)。ESSPRI评分的这种改善具有临床意义。相比之下，如图3和表3所示，接受安慰剂治疗的患者自基线的变化为-0.54。此外，与安慰剂组中的0相比，接受RSLV-132治疗的患者的ESSPRI疲劳从研究的基线到第99天改善了大约-1.4(图4)。当分别评估ESSPRI评分的三个组成部分时，与接受安慰剂治疗的对照组患者相比，接受RSLV-132治疗的患者出现干燥相关疲劳的情况有所减少(图5A-5C)。受试者水平数据显示，安慰剂组中25％的受试者和55％或RSLV-132治疗的受试者在ESSPRI中具有最小临床重要改善(MCII)(降低≥1分)(表3)。这些数据提供的证据表明RSLV-132治疗可改善pSS患者的症状，并且有临床意义的疲劳减轻。

表3.第99天的临床疗效测量

实施例6

接受RSLV-132治疗的患者FACIT疲劳评分有临床意义的改善

慢性疾病测试功能评估(FACIT)疲劳量表用于测量慢性疾病的疲劳程度，并广泛用于干燥综合征患者。FACIT疲劳问卷包括13个关于疲劳的问题，这些问题以4-分李克特量表(Likert scale)衡量。总评分范围为0-52，评分越高代表疲劳越少(Chandran et al.,Ann Rheum Dis 2007；66:936-939)。

如图6所示，接受RSLV-132治疗的患者的FACIT疲劳评分有临床意义的改善。特别是，RSLV-132治疗的患者的FACIT评分在研究的基线和第57天之间增加了约6分。相比之下，在研究的第57天，接受安慰剂治疗的患者的FACIT评分增加了大约1分。在研究的第99天，接受RSLV-132治疗的患者的FACIT评分比基线增加了大约6分(平均增加5.9分)。相比之下，在研究的第99天，接受安慰剂治疗的患者的FACIT评分比基线增加了大约1个分(平均增加1.13)。受试者水平数据显示，25％的安慰剂受试者和45％的RSLV-132治疗受试者在FACIT评分中具有最小临床重要改善(MCII)(增加≥6分)(表3)。这些数据提供了RSLV-132治疗改善pSS患者疲劳的证据。

实施例7

接受RSLV-132治疗的患者的疲劳概况(PROF)有所改善

疲劳概况(ProF)用于测量与慢性疾病相关的疲劳，并已用于评估干燥综合征患者的疲劳。疲劳概况由16个项目组成，分为两个领域：(1)躯体疲劳和(2)精神疲劳。疲劳概况评分从0到7，评分越高代表越疲劳。评分可以显示为概况或计算出的总评分(Strombeck etal.,Scand J Rheumatol 2005；34:455-459)。

RSLV-132治疗的患者在研究期间经历了疲劳概况的改善。具体而言，RSLV-132治疗的患者的疲劳概况评分从研究的基线到第99天降低了1分以上(平均降低了1.04分)(图7)。相比之下，接受安慰剂治疗的患者的疲劳概况没有降低，平均降低0.02分(图7)。

值得注意的是，在研究过程中，接受RSLV-132治疗的患者在疲劳概况的精神项目方面经历了具有临床意义的改善，因为精神评分从研究的基线到第99天下降了约1.5分(精神疲劳项目平均下降1.53分)(图8)。相比之下，接受安慰剂治疗的患者疲劳概况评分平均下降0.06分(图8)。如表3所示，在第99天，在25％的安慰剂患者和55％的RSLV-132治疗的患者中观察到精神疲劳反应(降低≥1分)。这些数据提供的证据表明，活性组(接受RSLV-132治疗的患者)在疲劳概况的精神项目方面经历了具有临床意义的改善(降低≥1分)。

接受RSLV-132治疗的患者在疲劳概况的躯体项目方面也有所改善，因为在研究过程中躯体评分从基线下降了约0.8分(图9)。如表3所示，在第99天，在25％的安慰剂患者和50％的RSLV-132治疗患者中观察到躯体疲劳反应(降低≥1分)。接受安慰剂治疗的患者的疲劳概况的精神或躯体项目均未降低。这些数据提供了RSLV-132治疗改善pSS患者疲劳的证据。

实施例8

接受RSLV-132治疗的患者的DSST有统计学显著改善

数字符号替换测试(DSST)用于测量干燥综合征患者的认知功能(例如注意力和专注力)。DSST是一种高度验证、灵敏的仪器，广泛用于涉及CNS药物的临床研究，作为执行功能的读取。DSST是一种有时间限制的纸笔认知测试。该测试要求患者根据纸张顶部的键将符号与数字匹配。患者将符号复制到一行数字下方的空格中，计算出允许时间内正确符号的个数。

对一部分12名患者进行了数字符号替换测试(DSST)。DSST神经心理学测试的结果支持上述疲劳结果。患者在基线和随访(第99天)时接受了DSST。测量与在90秒内完成的数字匹配的符号总数以及完成测试的时间(以秒为单位)。在规定时间内完成的匹配数量增加表明有所改善。完成测试的时间减少也表明有所改善。值得注意的是，与接受安慰剂治疗的患者的变化-2.80相比，接受RSLV-132治疗的患者在基线和随访之间完成测试的时间有统计学意义的改善，变化为16.40(图10A)。如图10B所示，RSLV-132患者完成任务比基线快16.40秒(失去16.4秒)，而安慰剂患者比基线时的原始时间慢2.80秒(增加2.80秒)。接受RSLV-132治疗的患者也表现出基线和随访之间在90秒内完成的匹配数量有所改善(图10A)。DSST测试的改进支持干燥综合征患者疲劳减轻的发现，因为疲劳的减轻与认知能力的提高相对应。

实施例9

RSLV-132的响应者表达关键炎症基因

进行基因表达分析以测定RSLV-132治疗的干燥综合征患者炎症减轻的生化证据，并如下进行。

在Q² Solutions|位于Morrisville,NC的EA Genomics对全血样本进行RNA测序。在研究治疗前的第1天和第99天，在收集管中收集全血。使用Thermo-Fisher的NanoDrop 8000通过分光光度法提取和定量RNA，并使用RNA 6000Nano Assay在Bioanalyzer 2100上评估完整性。使用Illumina TruSeq Stranded Total RNA实验方案和RiboZero Magnetic Gold消耗rRNA，生成50个碱基对的链状和双端测序文库。文库在Illumina HiSeq上测序至目标深度为5000万个读数(reads)。在映射(mapping)之前，进行了去接头(adapter trimming)、均聚物过滤和低质量读数过滤。然后使用STAR v2.4将处理后的读数映射到hg19基因组。使用RSEM 1.2.14进行基因和转录物定量。

基因表达分析的结果提供了用RSLV-132治疗对RSLV-132有临床响应的患者中炎症减轻的生化证据(图11)。这些患者表现出关键炎症通路的广泛减少，这在未达到临床响应的RSLV-132治疗患者中未观察到。临床响应定义为在三种工具中的两种工具中出现最小临床重要改善(MCII)的患者；ESSPRI(降低≥1分)、FACIT(增加≥6分)或疲劳概况(降低≥1分)。使用这些标准，RSLV-132组9/20(45％)患者和安慰剂组2/8(25％)患者出现临床响应。

对于达到或未达到临床响应的RSLV-132受试者，将第99天基因表达的变化与第1天进行比较。从无响应组的7名患者和响应组的7名患者采集全血，并根据上述实验方案使用RNAseq进行基因表达分析。图11热图(heat map)中显示的基因是参与调节先天免疫系统的关键炎症基因，与FACIT工具的结果具有高度相关性(R²>0.6)。达到临床响应的RSLV-132治疗患者表现出炎症相关基因表达的广泛降低，并且在未达到临床响应的受试者中未观察到(图11)。观察到关键炎症基因(如IL-5、TNF受体、IL-6受体、IL-1辅助蛋白、CXCL1、IL-17受体A、LTBR4和STAT5B)的表达在经历过临床响应的RSLV-132治疗患者中降低，但在没有出现临床响应的患者中则不然。在达到临床响应的那些患者中也观察到其他基因的增加，如CXCL10(IP-10)、CD163、RIPK2和CCR2。安慰剂组的两名受试者经历了临床响应，但没有与RSLV-132治疗响应者相似的基因表达谱(数据未显示)。

这些数据提供证据表明，达到临床响应的RSLV-132治疗的受试者显示出炎症相关基因表达降低。

实施例10

RSLV-132的响应者表现出不同的基因表达谱

检查基因表达谱以确定基因表达“指纹”，可用于鉴定可能对RSLV-132治疗有响应的患者。与未出现临床响应的RSLV-132治疗受试者的基线基因表达谱相比，在随后第99天出现临床响应(MCII)的RSLV-132治疗受试者的基线基因表达谱(在研究药物施用之前)之间观察到不同的基因表达模式。

如实施例9所述，对基线时(RSLV-132施用前)患者的血样进行RNAseq。分析了无响应者(用RSLV-132治疗的患者没有表现出临床响应)和响应者(用RSLV-132治疗的患者有临床响应)的基线基因表达谱。检查响应者与无响应者RSLV-132亚组的基因表达谱揭示了响应者之间有趣的谱。如图12A-12C和表4所示，在随后研究的第99天具有阳性临床响应的患者中，在施用研究药物之前的第1天观察到不同的基因表达谱。

当基线基因表达与FACIT(图12A)、ProF(图12B)或ESSPRI(图12C)相关时，在RSLV-132响应者中揭示了特定的谱。STAT1和STAT2表达的降低与FACIT测试相关(图12A)，ZNF606表达的增加和TRIM37表达的降低与ProF测试相关(图12B)，以及ACKR3表达的增加和MAPK3K8表达的降低与ESSPRI测试相关(图12C)。如表4所示，MAP3K8和ACKR3与ESSPRI高度相关(R²>0.9)，STAT1和STAT2与FACIT高度相关(R²>0.76)，以及TRIM37和ZNF606与ProF高度相关(R²>0.71)。这些数据提供的证据表明，在某些患者体内循环的特定RNA分子会促进这些患者体内炎症通路的慢性激活。

表4：在给定工具(ESSPRI、FACIT或ProF)中显示出与MCII强相关性的基因

实施例11

RSLV-132治疗的安全性和耐受性

为了评估RSLV-132治疗的总体安全性和耐受性，在整个研究过程中测量了不良事件。在最终治疗后211天内监测不良事件。RSLV-132治疗组和安慰剂组之间的治疗突发不良事件、严重不良事件和药物相关不良事件的发生率相当(表5)。研究期间未发生死亡。疲劳是研究中最常见的不良事件(AE)。大多数疲劳不良事件都是在研究早期报告的。在研究期间，任一治疗组均未观察到严重感染或输液反应。没有患者因不良事件AE中断药物研究。RSLV-132组中的一名患者出现严重不良事件，并在最后一剂研究药物后88天因腮腺炎住院。这种不良事件似乎与RSLV-132治疗无关。

表5.处理紧急不良事件(TEAE)(安全性分析集)

*在最后一剂研究药物后88天因腮腺炎住院；与研究药物无关

序列表(表1)