一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维及其制备方法
阅读说明：本技术 一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维及其制备方法 (Polyacrylonitrile fiber with biological activity and preparation method thereof ) 是由 王永 杨世炜 林海 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维,采用如下方法制备得到：在碱性溶液中水解聚丙烯腈纤维后,与胶原蛋白水溶液、交联溶液混合,调节pH值,进行化学改性2～72h；所述碱性溶液的原料包括NaHCO-(3)、NaOH和水；所述交联溶液的原料包括交联剂、缓冲物质和水；所述胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维中含有胶原蛋白和聚丙烯腈。本发明方法制备的聚丙烯腈纤维保持了胶原良好的天然结构,能较好促进成纤维细胞的粘附和增殖,有利于成纤维细胞的定向生长和功能表达,具有良好的生物相容性、力学性能,有利于软组织修复,特别适合如腹壁缺损等所需要的力学强度要求；本发明方法工艺简单,反应条件温和,反应体系稳定高效,反应试剂绿色环保。(The invention discloses a polyacrylonitrile fiber with biological activity, which is prepared by the following method: hydrolyzing polyacrylonitrile fibers in an alkaline solution, mixing the hydrolyzed polyacrylonitrile fibers with a collagen aqueous solution and a crosslinking solution, adjusting the pH value, and carrying out chemical modification for 2-72 h; the raw material of the alkaline solution comprises NaHCO 3 NaOH and water; starting material for the crosslinking solutionComprises a cross-linking agent, a buffer substance and water; the collagen modified polyacrylonitrile fiber contains collagen and polyacrylonitrile. The polyacrylonitrile fiber prepared by the method maintains a good natural structure of collagen, can better promote adhesion and proliferation of fibroblasts, is beneficial to directional growth and functional expression of the fibroblasts, has good biocompatibility and mechanical properties, is beneficial to soft tissue repair, and is particularly suitable for mechanical strength requirements needed by abdominal wall defects and the like; the method has the advantages of simple process, mild reaction conditions, stable and efficient reaction system and green and environment-friendly reaction reagents.)
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维及其制备方法。
背景技术
早在1894年法国化学家Moreau就首次提出了聚丙烯腈(PAN)的合成，由于受第二次世界大战影响，聚丙烯腈纤维的工业化生产直到1950年才分别被德国I.G.Farbenindustrie公司和美国DuPont公司实现，德国的商品名为贝纶(Perlon)，美国的商品名为奥纶(Orlon)。我国自20世纪70年代引进第一条聚丙烯腈纤维生产线起，聚丙烯腈纤维的生产研究就发展迅猛，目前，我国几乎拥有所有世界上生产聚丙烯腈纤维的工艺路线。根据海关数据显示，我国2018年仅进口各类聚丙烯腈纤维达14.95万吨，总进口聚丙烯腈纤维金额超过4亿美元，反映出国内对差别化聚丙烯腈纤维的需求依然很大。并且，随着聚丙烯腈新用途的开发，聚丙烯腈纤维的应用也不仅局限于服装、家居装饰和产业用途，聚丙烯腈材料因具有良好的热学稳定性和机械力学稳定性，并具有优异的可塑性以及抗菌性能，目前已在血液透析膜、抗菌敷料、人工肝超滤器等医用非植入物方面得到研究和开发。然而，聚丙烯腈材料由于自身生物相容性较差，在运用于植入机体的软组织修复之前，还必须经过改性，才能满足机体对植入物生物相容性的要求。
目前，对聚丙烯腈材料进行改性以增强其生物相容性的方式主要有聚合物共混改性、纺丝溶液添加及共聚改性，但上述丙烯腈纤维改性技术并不适用于制备软组织修复材料，原因主要有以下几点：
(1)存在反应温度过高，会对胶原蛋白的结构产生强烈的破坏作用，这将会影响胶原蛋白在软组织修复方面的应用价值；(2)反应体系中运用有毒有害化学试剂且难以除去，给改性聚丙烯腈纤维带来了潜在的毒副反应，限制了改性聚丙烯腈纤维在生物医用邻域的应用价值；(3)部分聚丙烯腈纤维改性工艺中胶原蛋白接枝改性效率低下，对于提高改性聚丙烯腈纤维的生物相容性效果有限；(4)部分聚丙烯腈改性材料运用生物惰性材料，细胞无法黏附再生，长期留存体内将增加植入物相关并发症发生的风险。
因此，如何创造出一种能够运用于机体软组织修复的改性聚丙烯腈纤维以便满足生物医药、组织工程等方面的巨大需求，已经成为了组织工程领域研究的热点和亟待解决的问题。
发明内容
胶原是一种具有高级结构的蛋白质，其分子组成和结构很大程度的决定了最终的性能，如生物相容性和生物活性，因此在采用胶原作为原料构建组织工程支架或植入器械时必须采用有效措施保护其组成和结构不产生明显变化。由于胶原的组成和结构受到温度、pH、酶制剂、化学和物理因素的重要影响，因此可使用的技术手段和方法都比较受限。
本发明主要解决的技术问题是提供一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维及其制备方法，该方法反应体系稳定、高效、毒性低，制备得到的聚丙烯腈纤维生物相容性、力学强度好，能够应用于软组织修复材料中。
本发明所述软组织修复材料，是指用以修复和/或替代机体中发生病变或者损伤的软组织，恢复或部分恢复原有组织形态和功能的材料，例如，可以是组织工程支架材料。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
提供一种具有生物活性的聚丙烯腈纤维，采用如下方法制备得到：
将水解聚丙烯腈纤维、交联溶液混合后活化，与1mg/L～10mg/L胶原蛋白混合反应，调节pH值为6～9，反应2～72h即得；
所述活化的条件为：pH值为3～6，活化温度为18℃～40℃，活化时间为0.3～2h。
由于胶原与聚丙烯腈的共价交联受到多方面因素的影响，如聚丙烯腈的水解程度(即聚丙烯腈分子上的羧基含量及其暴露程度)；胶原分子中氨基含量与聚丙烯腈中羧基含量的比例(即胶原的相对用量及胶原分子的卷曲状态)；交联剂与催化剂及反应条件的调控(即EDC和NHS的用量、加入方式以及pH、反应时间)等因素的影响，因此，本发明通过限定聚丙烯腈的水解条件、胶原用量、交联剂、催化剂、反应条件等参数，从而保证交联反应的进行，得到一种生物相容性和生物活性均优的纤维材料。
进一步地，所述水解聚丙烯腈纤维用量为1.000～1.100g，优选为1.001～1.066g；
所述胶原蛋白的用量为50～200mg，优选为60～150mg。
在本发明中，所述交联溶液中包括交联剂、缓冲物质；
进一步地，所述交联剂选自戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或几种，优选为EDC/NHS；更进一步地，所述交联溶液中EDC的浓度为10～200mmol/L，优选为60mmol/L；NHS的浓度为10mmol/L～100mmol/L，优选为40mmol/L；
本发明所述缓冲物质选自磷酸缓冲系统、碳酸缓冲系统中的一种；所述磷酸缓冲系统是指由磷酸、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾中的两种或两种以上组成，所述碳酸缓冲系统是指由碳酸盐和碳酸氢盐组成；本发明所述缓冲物质中的组分为能保持溶液pH稳定的混合物。
在本发明的
具体实施方式
中，本发明所述缓冲物质选自磷酸、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾和/或其对应的水合物中的两种或两种以上；进一步地，所述缓冲物质选自Na2HPO4、NaH2PO4的混合溶液。
进一步地，所述活化的条件为：pH值为4.7，活化温度为20℃～25℃，活化时间为0.5～1小时。
胶原是一种对温度极其敏感的天然蛋白，过高温度不仅会丧失三股螺旋等二级结构，而且会发生分子链断裂或水解，本发明采用上述温和的反应条件使其参与反应，能够保证胶原的组成和结构不受到明显破坏，使其与聚丙烯腈形成有效的键合，从而构建得到一种具有良好生物相容性和生物活性的纤维材料。
在本发明的具体实施方式中，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，优选牛I型胶原蛋白；
进一步地，所述胶原蛋白的浓度为5mg/mL；
进一步地，与胶原蛋白混合后，调节的pH值为8，反应48h。
在本发明的具体实施方式中，所述水解聚丙烯腈纤维的制备方法为：将聚丙烯腈纤维、碱性溶液混合反应，反应结束后冷却，经酸化、干燥即得。
本发明所述干燥的方法包括但不限于冷冻干燥法、真空干燥法、喷雾干燥法，在本发明的具体实施方式中，优选冷冻干燥。
进一步地，所述聚丙烯腈纤维的线密度为1.67dtex～6.67dtex，优选为2.22～5.55dtex。
进一步地，所述碱性溶液选自NaHCO3、NaOH、(Na)2CO3的一种或几种，优选为NaHCO3、NaOH的混合溶液；进一步优选为1％的NaHCO3、NaOH的混合溶液；
进一步地，聚丙烯腈:NaOH:NaHCO3的质量比为3:0.7:0.3。
本发明所述碱性溶液可将聚丙烯腈纤维大分子的氰基极性基团水解转化为羧基，使其与胶原蛋白中氨基反应生成酰胺键来实现改性反应，此外，NaOH和NaHCO3采用特定质量比配制的碱性溶液还能除去聚丙烯腈纤维表面的蜡质并暴露纤维本身，从而增加材料表面，有助于表面改性的进行。但高浓度、长时间的水解将导致聚丙烯腈纤维表面过度粗糙，反而降低细胞表面黏附，因此需要在合适碱性条件及水解时间下进行碱性水解。
进一步地，所述反应的条件为：温度为70～99℃，冷凝回流时间为40～75h；优选温度为85～95℃，冷凝回流时间为48～72h；
进一步地，所述酸化采用的试剂为盐酸溶液。
聚丙烯腈属于疏水性材料，而胶原是亲水性的，因此将这两种高分子直接物理混合容易出现相分离，本发明采用特定条件对聚丙烯腈进行改性，能够改善其亲疏水性能，进一步使其与胶原分子产生共价交联，产生稳定的复合。水解后的聚丙烯腈纤维与胶原蛋白进行化学交联可提高胶原蛋白的氨基与水解聚丙烯腈纤维中羧基反应生成酰胺键的效率，并且也能促进胶原蛋白之间进行自交联反应，在聚丙烯腈纤维表面形成充分均匀的胶原蛋白层，以提高聚丙烯腈纤维表面胶原蛋白层的机械强度和稳定性，因此，聚丙烯腈的水解率对改善最终的聚丙烯腈纤维的机械强度、稳定性具有重要作用。本发明方法能够使得到的聚丙烯腈水解率、胶原含量同时满足产品需求。
本发明所述聚丙烯腈纤维的水解率为1％～20％，胶原蛋白含量为1％～20％，优选为聚丙烯腈纤维的水解率为6％～15％，胶原蛋白含量为1％～20％。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法工艺简单，反应条件温和，减少了对胶原蛋白结构的破坏，反应体系稳定高效，反应试剂绿色环保、毒性低，减少了产物中有毒物质残留，从而影响生物相容性的问题。
(2)本发明中的胶原蛋白是通过“零长度”交联使其与聚丙烯腈分子上水解产生羧基共价交联，不管是在水相溶液中，还是在植入体内的局部微环境中，都具有良好的稳定性，可以在植入部位长期发挥作用，从而达到组织修复的目的。
(3)本发明方法得到的聚丙烯腈纤维的水解率为6％～15％，改性后得到的聚丙烯腈纤维中的胶原蛋白含量为1％～20％，能够使聚丙烯腈水解率、改性聚丙烯腈纤维中胶原含量同时满足产品需求，不仅保持了胶原良好的天然结构，较好的促进了成纤维细胞的粘附和增殖，使得成纤维细胞分泌的基质沿着纤维分布，有利于成纤维细胞的定向生长和功能表达，具有良好的生物相容性；同时，还具有能够满足软组织修复的力学强度，特别适合如腹壁缺损等所需要的力学强度要求，可应用于编织软组织修复材料。
附图说明
图1为胶原蛋白投料比对胶原含量的影响图；
图2为胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维扫描电镜图；
图3为胶原蛋白改性聚丙烯纤维与聚丙烯纤维及水解聚丙烯纤维的FT-IR图；
图4为PAN水解率对力学性能的影响图；
图5为成纤维细胞在胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维上的粘附与增殖结果图；
其中，图2中的A、聚丙烯腈纤维，B、水解聚丙烯腈纤维，C、胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维，胶原蛋白含量4.90％，D、胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维，胶原蛋白含量9.03％；
图5中，A.聚丙烯腈纤维，B.胶原蛋白改性聚丙烯腈，胶原蛋白含量4.8％，C.胶原蛋白改性聚丙烯腈，胶原蛋白含量7.9％，D.胶原蛋白改性聚丙烯腈，胶原蛋白含量10.75％。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)以聚丙烯腈(PAN)纤维:NaOH:NaHCO3＝3:0.7:0.3的质量比分别称取PAN纤维、NaOH和NaHCO3，称取3g、线密度为2.22～5.55dtex的PAN纤维置于500mL的三口烧瓶中，称取0.7g NaOH和0.3g NaHCO3配制成浓度为1％的碱溶液，将其加入置有PAN纤维三口烧瓶中，开动搅拌器，搅拌选择速度为60～100r/min，升温至85～95℃，并冷凝回流48～72h，使充分溶胀，反应结束后，将样品冷却至室温，用大量水洗后以盐酸溶液酸化，再用大量水洗，冷冻干燥，即得到水解PAN纤维样品。
(2)将Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中，在20℃～25℃条件下混合均匀，溶液中各物质的浓度为：60mmol/L EDC、40mmol/L NHS、0.2mol/L Na2HPO4·2H2O和0.2mol/L NaH2PO4，用NaOH调节其pH至3.8～4.5，得到交联溶液。
(3)于常温下，将步骤(1)中经水解并干燥后的聚丙烯腈纤维置入交联溶液中，调节pH值为4.7，在18℃活化0.5～1小时，再缓慢滴入5mg/mL牛Ⅰ型胶原蛋白，并调节反应体系pH值为8，利用磁力搅拌器在60～100r/min下匀速搅拌24h。将获得的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维以大量水洗，并进行冷冻干燥，得到胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维。
实施例2
(1)以聚丙烯腈(PAN)纤维:NaOH:NaHCO3＝3:0.7:0.3的质量比分别称取PAN纤维、NaOH和NaHCO3，称取3g、线密度为2.22～5.55dtex的PAN纤维置于500mL的三口烧瓶中，称取0.7g NaOH和0.3g NaHCO3配制成浓度为1％的碱溶液，将其加入置有PAN纤维三口烧瓶中，开动搅拌器，搅拌选择速度为60～100r/min，升温至85～95℃，并冷凝回流48～72h，使充分溶胀，反应结束后，将样品冷却至室温，用大量水洗后以盐酸溶液酸化，再用大量水洗，冷冻干燥，即得到水解PAN纤维样品。
(2)将Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中，在20℃～25℃条件下混合均匀，溶液中各物质的浓度为：60mmol/L EDC、40mmol/L NHS、0.2mol/L Na2HPO4·2H2O和0.2mol/L NaH2PO4，用NaOH调节其pH至3.8～4.5，得到交联溶液。
(3)于常温下，将步骤(1)中经水解并干燥后的聚丙烯腈纤维置入交联溶液中，调节pH值为3，在40℃活化0.5～1小时，再缓慢滴入10mg/mL牛Ⅰ型胶原蛋白，并调节反应体系pH值为9，利用磁力搅拌器在60～100r/min下匀速搅拌12h。将获得的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维以大量水洗，并进行冷冻干燥，得到胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维。
实施例3
(1)以聚丙烯腈(PAN)纤维:NaOH:NaHCO3＝3:0.7:0.3的质量比分别称取PAN纤维、NaOH和NaHCO3，称取3g、线密度为2.22～5.55dtex的PAN纤维置于500mL的三口烧瓶中，称取0.7g NaOH和0.3g NaHCO3配制成浓度为1％的碱溶液，将其加入置有PAN纤维三口烧瓶中，开动搅拌器，搅拌选择速度为60～100r/min，升温至85～95℃，并冷凝回流48～72h，使充分溶胀，反应结束后，将样品冷却至室温，用大量水洗后以盐酸溶液酸化，再用大量水洗，冷冻干燥，即得到水解PAN纤维样品。
(2)将Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中，在20℃～25℃条件下混合均匀，溶液中各物质的浓度为：60mmol/L EDC、40mmol/L NHS、0.2mol/L Na2HPO4·2H2O和0.2mol/L NaH2PO4，用NaOH调节其pH至3.8～4.5，得到交联溶液。
(3)于常温下，将步骤(1)中经水解并干燥后的聚丙烯腈纤维置入交联溶液中，调节pH值为5，在30℃活化1.5小时，再缓慢滴入1mg/mL牛Ⅰ型胶原蛋白，并调节反应体系pH值为7，利用磁力搅拌器在60～100r/min下匀速搅拌72h。将获得的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维以大量水洗，并进行冷冻干燥，得到胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维。
实施例4
(1)以聚丙烯腈(PAN)纤维:NaOH:NaHCO3＝3:0.7:0.3的质量比分别称取PAN纤维、NaOH和NaHCO3，称取3g、线密度为2.22～5.55dtex的PAN纤维置于500mL的三口烧瓶中，称取0.7g NaOH和0.3g NaHCO3配制成浓度为1％的碱溶液，将其加入置有PAN纤维三口烧瓶中，开动搅拌器，搅拌选择速度为60～100r/min，升温至85～95℃，并冷凝回流48～72h，使充分溶胀，反应结束后，将样品冷却至室温，用大量水洗后以盐酸溶液酸化，再用大量水洗，冷冻干燥，即得到水解PAN纤维样品。
(2)将Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中，在20℃～25℃条件下混合均匀，溶液中各物质的浓度为：60mmol/L EDC、40mmol/L NHS、0.2mol/L Na2HPO4·2H2O和0.2mol/L NaH2PO4，用NaOH调节其pH至3.8～4.5，得到交联溶液。
(3)于常温下，将步骤(1)中经水解并干燥后的聚丙烯腈纤维置入交联溶液中，调节pH值为6，在25℃活化2小时，再缓慢滴入8mg/mL牛Ⅰ型胶原蛋白，并调节反应体系pH值为7.5，利用磁力搅拌器在60～100r/min下匀速搅拌12h。将获得的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维以大量水洗，并进行冷冻干燥，得到胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维。
实施例1～4中，聚丙烯腈纤维的水解率为6％～15％，得到的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维直径为20～100μm、胶原蛋白含量为1～20％。
实施例5胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维中胶原蛋白含量的控制
采用水解率相同的PAN纤维和相同的胶原蛋白接枝改性方法，仅通过调节胶原蛋白加入量可以改变最终胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维中的胶原蛋白含量，由图1可以看出，胶原蛋白加入的比例越高，改性产物中胶原蛋白含量越高。
表面形貌
对本发明方法获得的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维进行电镜检查，其表面形貌结果见图2。
从图2可以直观的看出，未改性的PAN纤维直径均匀、表面有较为明显的纤维条纹(A)；而PAN经碱水解后，表面的纤维开始出现局部断裂和破损的情况(B)；进一步经胶原表面改性后，可以看到纤维表面有较完整且平滑的胶原涂层(C)；胶原接枝率增大后，涂层的厚度明显增加，粗糙度增加，表面积增大(D)。
PAN水解与胶原接枝有效性验证
进一步地，将本发明方法获得的聚丙烯腈纤维、水解聚丙烯腈纤维及胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维用傅里叶红外光谱仪进行扫描，其结果见图3。从图3结果可看出，与聚丙烯腈纤维相比，经碱水解后的聚丙烯腈纤维有大量的羟基峰(2500-3500cm-1)，而2250cm-1左右的腈基峰明显减少，表明碱水解作用的有效性；进一步，与聚丙烯腈纤维和水解聚丙烯腈纤维相比，经胶原蛋白改性后的聚丙烯腈纤维在1600cm～1700cm酰胺谱带位置出现新的特征吸收峰，说明胶原蛋白已经有效接枝到聚丙烯腈纤维的表面。
力学性能检测
PAN受到碱的作用刚产生水解时，原本存在于PAN纤维内部的应力得到释放，使纤维的延伸性有所提高；随着PAN水解率的增加，纤维表面出现破裂的比例增大，程度也逐渐加剧，宏观表现出的载荷和断裂伸长率等力学性能都逐步降低。从由图4A、B可以看出，当PAN水解率低于8.7％时，纤维的载荷和拉伸位移均比未水解的PAN更高，但当水解率达到10.05％时，载荷和拉伸位移均有所下降。
生物相容性检测
将本发明方法获得的不同胶原蛋白含量的改性聚丙烯腈纤维与未改性的聚丙烯腈纤维，用75％乙醇浸泡过夜处理，用无菌PBS溶液清洗，并用紫外线消毒灭菌。再将事先准备好的成纤维细胞进行计数并离心，用细胞培养液制备具有一定数量的细胞悬液。将细胞悬液均匀的接种在已灭菌的不同胶原蛋白浓度的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维与聚丙烯腈纤维上，接种密度为1×104个/mL，用细胞培养液(含10％胎牛血清的α-MEM培养基和1％双抗)进行后续培养。在7d时取样用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图5所示，胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维细胞黏附增殖比聚丙烯腈纤维情况好，但相比胶原蛋白含量为4.8％、7.9％的改性聚丙烯腈纤维，胶原蛋白含量为10.75％的胶原蛋白改性聚丙烯腈纤维上的细胞生长情况更好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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