具体实施方式

在本文中使用一些定义描述本发明，所述定义如在下面和整个申请中所给出的那样。

定义

所公开的主题可以使用如下所述的定义和技术用语进一步描述。在本文中使用的定义和技术用语仅用于描述特定实施方案，不意在是限制性的。

如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确规定。例如，术语“一个基因”或“一种寡糖”应当被解释为分别意指“一个或多个基因”和“一种或多种寡糖”，除非上下文另外明确规定。如本文所使用的，术语“多个”意指“两个或更多个”。

如本文所用，“大约”、“大致”、“基本上”和“显著地”将由本领域普通技术人员理解并将在它们所使用的上下文中做一定程度的改动。如果在术语使用的上下文中使得该术语的使用对于本领域普通技术人员来说不清楚，那么“大约”和“大致”将意指至多为特定项加或减10％，且“基本上”和“显著地”将意指超过特定项的加或减10％。

如本文所用，术语“包括”具有与术语“包含”和“含有”相同的含义。术语“包含”和“含有”应当被解释为“开放式”过渡术语，它允许包括权利要求所述的那些组分以外的其他组分。术语“组成”和“由…组成”应当解释为“封闭式”过渡术语，它不允许包括权利要求中所述的组分以外的其他组分。术语“基本上由…组成”应当解释为部分封闭式且允许仅包括不根本上改变所要求保护的主题的性质的其他组分。

短语“诸如”应当解释为“例如，包括”。此外任何和所有示例性的语言(包括但不限于“诸如”)的使用意在仅更好地说明本发明，不对发明的范围做任何限制，除非以其他的方式要求保护。

此外，在其中使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯用用法的那些情况下，一般这样的结构意在本领域普通技术人员将理解该惯用用法的意义(例如，“具有A、B和C中至少一种的系统”包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B两者、A和C两者、B和C两者、和/或A、B和C三者的系统)范围内。本领域技术人员进一步将理解实际上任何提出两个或更多个备选项的转折词和/或短语，无论在描述或图表中，应当理解为考虑包括术语之一、任一个术语、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”要被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所述的数字并且是指可以随后分解成多个范围和子范围的范围。范围包括每个单个数字。因此，例如，具有1-3个成员的组是指具有1、2或3个成员的多个组。类似地，具有6个成员的组是指具有1、2、3、4、或6个成员的多个组，等等。

情态动词“可以”是指优选地使用或选择所描述的几个实施方案或包含在这些实施方案内的特征中的一个或多个选项或选择。在关于特定的实施方案或包含在该实施方案内的特征没有公开任何选项或选择的情况下，情态动词“可以”是指关于如何制作或使用所述的实施方案的一个方面或包含在该实施方案中的特征的确认行为，或使用关于所述的实施方案或包含在该实施方案中的特征的专门技能的最终决定。在后一种情况下，情态动词“可以”具有与助动词“能够”相同的含义和内涵。

如本文所用，术语“结合”、“相互作用”和“占用”是指共价相互作用、非共价相互作用和空间相互作用。共价相互作用是通过共用一对电子(单键)、两对电子(双键)或三对电子(三键)形成的两个原子或基团之间的化学键。共价相互作用在本领域中还已知为电子对相互作用或电子对键。非共价相互作用包括但不限于，范德华相互作用、氢键、弱化学键(通过短程非共价力)、疏水相互作用、离子键等。非共价相互作用的综述可参见Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,第三版，Garland Publishing,1994。空间相互作用一般理解为包括其中化合物的结构使得其能够借助于其三维结构占用位点的那些作用，与化合物和该位点之间的任何吸引力相反。

多核苷酸和合成方法

术语“核酸”和“寡核苷酸”，如本文所用，是指多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)，以及作为嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷的任何其他类型的多聚核苷酸。在术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多聚核苷酸”之间在长度方面不意在有区别，这些术语将可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。为了在本发明的方法中使用，寡核苷酸也包括其中碱基、糖或磷酸盐主链被修饰的核苷酸类似物以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸类似物。

寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括通过诸如Narang等人1979,Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人,1979,Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人,1981,Tetrahedron Letters 22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺酯；和美国专利号4,458,066的固相载体法的方法直接化学合成，上面每篇文献均通过引用并入本文。寡核苷酸和修饰的核苷酸的缀合物的合成方法的综述在Goodchild,1990,Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187中提供，该文献通过引用并入本文。

术语“扩增反应”是指导致模板核酸序列的拷贝增加或导致模板核酸转录的任何化学反应，包括酶促反应。扩增反应包括：逆转录，聚合酶链式反应(PCR),包括实时PCR(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(Innis等人编,1990)),和连接酶链式反应(LCR)(参见Barany等人,美国专利号5,494,810)。示例性的“扩增反应条件”或“扩增条件”典型地包括两个或三个步骤循环。两步循环具有高温变性步骤，接着是杂交/延伸(或连接)步骤。三步骤循环包括变性步骤，接着是杂交步骤，接着是单独的延伸步骤。

术语“靶标”、“靶序列”、“靶区域”和“靶核酸”，如本文所用，是同义词，并且是指核酸的被扩增、测序或检测的区域或序列。

术语“杂交”，如本文所用，是指因互补碱基配对导致由两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间发生或在包含最小的错配区域的“基本上互补的”核酸链之间发生。在强烈优选完全互补的核酸链的杂交的条件下是指“严格杂交条件”或“序列特异性杂交条件”。基本上互补序列的稳定双链体可以在不太严格的杂交条件下实现；耐受的错配程度可以通过适当地调节杂交条件来控制。核酸技术领域技术人员可以经验性地考虑许多变量来确定双链体稳定性，这些变量包括，例如，寡核苷酸的长度和碱基对组成，离子强度和错配碱基对的发生率，遵循由现有技术提供的指南(参见，例如，Sambrook等人,1989,Molecular Cloning–A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York；Wetmur,1991,Critical Review inBiochem.and Mol.Biol.26(3/4):227-259；和Owczarzy等人,2008,Biochemistry,47:5336-5353,它们通过引用并入本文)。

术语“引物”，如本文所用，是指能够在合适的条件下充当DNA合成的起始点的寡核苷酸。这样的条件包括其中在处于适宜的缓冲液和在合适的温度下四种不同的核苷三磷酸和延伸试剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)的存在下诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的那些条件。

引物优选是单链DNA。引物的适宜长度取决于引物的预期用途，但典型地范围为约6-约225个核苷酸，包括中间范围，诸如15-35个核苷酸、18-75个核苷酸以及25-150个核苷酸。短引物分子一般要求较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要影响模板核酸的确切序列，但必须与模板充分互补以进行杂交。用于扩增给定靶序列的合适引物的设计在本领域中是众所周知的并且记载在本文所引用的文献中。

引物可以加入附加特征，所述特征允许引物的检测或固定化但不改变引物的基本特性，即充当DNA合成的起始点。例如，引物可以包含在5’端处的附加核酸序列，该附加核酸序列不与靶核酸杂交，但有助于扩增产物的克隆或检测，或允许RNA转录(例如，通过加入启动子)或蛋白翻译(例如，通过加入5’-UTR，诸如内部核糖体进入位点(IRES)或3’-UTR元件，诸如poly(A)_n序列，其中n的范围为约20-约200)。与模板充分互补以进行杂交的引物区在本文中被称为杂交区。

如本文所用，如果引物在扩增反应中在足够严格的条件下使用时，该引物与靶核酸基本上杂交，则该引物对靶序列是“特异的”。典型地，如果引物-靶标双链体稳定性大于在引物和样品中发现的任何其他序列之间形成的双链体的稳定性，则该引物对靶序列是特异的。本领域技术人员将认识到多种因素，诸如盐条件以及引物的碱基组成和错配的位置，都将影响引物的特异性，并且在许多情况下需要进行引物特异性的常规实验确认。可以在引物可以仅与靶序列形成稳定的双链体的情况下选择杂交条件。因此，在合适的严格扩增条件下使用靶标特异性引物使得能够选择性地扩增包含靶标引物结合位点的那些靶序列。

如本文所用，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合的酶。“DNA聚合酶”催化脱氧核糖核苷酸的聚合。已知的DNA聚合酶包括，例如，强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶和水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶，等等。“RNA聚合酶”催化核糖核苷酸的聚合。DNA聚合酶的前述实例也称为DNA-依赖性DNA聚合酶。RNA-依赖性DNA聚合酶也包括在DNA聚合酶的范围内。逆转录酶包括由逆转录病毒编码的病毒聚合酶，它是RNA-依赖性DNA聚合酶的实例。RNA聚合酶(“RNAP”)的已知实例包括，例如，T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶等。RNA聚合酶的前述实例也称作DNA-依赖性RNA聚合酶。上述酶中的任一个的聚合酶活性可以通过本领域中熟知的手段确定。

术语“启动子”是指指引RNA聚合酶和其他反式作用转录因子起始从DNA模板的RNA转录的顺式作用DNA序列，所述DNA模板包含该顺式作用DNA序列。

如本文所用，术语“序列限定的生物聚合物”是指具有特异性一级序列的生物聚合物。在基因编码具有特异性一级序列的生物聚合物的情况下，序列限定的生物聚合物可以等同于基因编码限定的生物聚合物。

如本文所用，“表达模板”是指充当转录至少一个RNA的底物的核酸，所述RNA可以翻译成序列限定的生物聚合物(例如，多肽或蛋白)。表达模板包括由DNA或RNA构成的核酸。用作用于表达模板的核酸的合适的DNA来源包括基因组DNA、cDNA和可以转变为cDNA的RNA。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自任何生物来源，诸如组织样品、活检、拭子、痰液、血液样品、粪便样品、尿液样品、刮擦物等。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自宿主细胞或病毒来源和来自任何物种，包括现存的和灭绝的生物体。如本文所用，“表达模板”和“转录模板”具有相同的含义并且可互换使用。

在某些示例性实施方案中，提供了载体，诸如，例如，表达载体，含有编码本文所述的一个或多个rRNA或报告多肽和/或蛋白的核酸。如本文所用，术语“载体”是指能够运输与该载体连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，质粒是指其中可以连接其他DNA片段的环状双链DNA环。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，所公开的方法和组合物意在包括此类其他形式的表达载体，诸如具有等同功能的病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

在某些示例性实施方案中，在本文所述的一种或多种方法中重组表达载体包含以适合表达核酸序列的形式的核酸序列(例如，编码本文所述的一个或多个rRNA或报告多肽和/或蛋白的核酸)，这意味着重组表达载体包括可操作地连接到待表达的核酸序列的一个或多个调控序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”意在表示编码本文所述的一个或多个rRNA或报告多肽和/或蛋白的核苷酸序列以允许表达该核苷酸序列的方式连接到所述调控序列(例如，在体外转录和/或翻译系统中)。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列记述于，例如Goeddel；GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。

寡核苷酸和多核苷酸可以任选地包括一种或多种非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的实例包括，但不限于二氨基嘌呤、S²T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。核酸分子也可以在碱基部分(例如，在一般可利用用于与互补的核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在一般不能与互补的核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸盐主链被修饰。

如本文所用，“缺失”意指相对于天然多核苷酸序列去除了一个或多个核苷酸。在本文公开的工程化菌株可以包括在一个或多个基因中的缺失(例如，gmd中的缺失和/或waaL中的缺失)。优选地，缺失产生无功能的基因产物。如本文所用，“插入”意指相对于天然多核苷酸序列加入一个或多个核苷酸。在本文中公开的工程化菌株可以包括一个或多个基因中的插入(例如，gmd中的插入和/或waaL中的插入)。优选地，缺失导致无功能基因产物。如本文所用，“置换”意指用不是多核苷酸序列天然所有的核苷酸替换天然多核苷酸序列的核苷酸。本文公开的工程化菌株可以包括一个或多个基因中的置换(例如，gmd中的置换和/或waaL中的置换)。优选地，置换产生无功能基因产物，例如，其中置换在基因产物的编码序列中引入了提前终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)。在一些实施方案中，本文公开的工程化菌株可以包括其中置换引入了多个提前终止密码子(例如，TAATAA、TAGTAG或TGATGA)的两个或更多个置换。

在一些实施方案中，本文公开的工程化菌株可以被改造为包括并表达一个或多个异源基因。如本领域将理解的那样，异源基因是在工程化菌株天然存在时不天然存在于该菌株中的基因。对大肠杆菌异源的基因是不存在于大肠杆菌中的基因并且可以是天然存在于另一微生物中的基因(例如，来自空肠弯曲杆菌的基因)或天然不存在于任何其他已知的微生物中的基因(例如，人工基因)

肽、多肽、蛋白和合成方法

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是指包含通过酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物链的分子。术语“氨基酸残基”包括但不限于包含在由下列组成的组的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A),半胱氨酸(Cys或C),天冬氨酸(Asp或D),谷氨酸(Glu或E),苯丙氨酸(Phe或F),甘氨酸(Gly或G),组氨酸(His或H),异亮氨酸(Ile或I),赖氨酸(Lys或K),亮氨酸(Leu或L),甲硫氨酸(Met或M),天冬酰胺(Asn或N),脯氨酸(Pro或P),谷氨酰胺(Gln或Q),精氨酸(Arg或R),丝氨酸(Ser或S),苏氨酸(Thr或T),缬氨酸(Val或V),色氨酸(Trp或W),和酪氨酸(Tyr或Y)残基。术语“氨基酸残基”也可以包括非标准或非天然氨基酸。术语“氨基酸残基”可以包括α-、β-、γ-和δ-氨基酸。

在一些实施方案中，术语“氨基酸残基”可以包括包含在由下列组成的组的非标准或非天然氨基酸残基：高半胱氨酸、2-氨基己二酸、N-乙基天冬酰胺、3-氨基己二酸、羟基赖氨酸、β-丙氨酸、β-氨基-丙酸、别-羟基赖氨酸2-氨基丁酸、3-羟基脯氨酸、4-氨基丁酸、4-羟基脯氨酸、哌啶酸、6-氨基己酸、异锁链素、2-氨基庚酸、别-异亮氨酸、2-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、3-氨基异丁酸、N-甲基异亮氨酸、2-氨基庚二酸、6-N-甲基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、N-甲基缬氨酸、锁链素、正缬氨酸、2,2'-二氨基庚二酸、正亮氨酸、2,3-二氨基丙酸、鸟氨酸和N-乙基甘氨酸。术语“氨基酸残基”可以包括前述任一种氨基酸的L异构体或D异构体。

非标准或非天然氨基酸的其他实例包括，但不限于，对-乙酰基-L-苯丙氨酸、对-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对-丙炔基氧基苯丙氨酸、对-丙炔基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcpβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对-溴代苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；甲硫氨酸氨基酸的非天然类似物；亮氨酸氨基酸的非天然类似物；异亮氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤代、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒代、酯、硫代酸、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟基胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其组合；具有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；金属结合氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；光笼锁(photocaged)和/或光致异构氨基酸；生物素或含生物素类似物的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解的或可光致裂解的氨基酸；具有延伸的侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸；含碳连接糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；氨基硫代酸；α,α二取代氨基酸；β-氨基酸；γ-氨基酸，除脯氨酸或组氨酸以外的环状氨基酸，和除苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸以外的芳香族氨基酸。

如本文所用，“肽”被定义为典型地20个或更少的氨基酸长度，更典型地为12个或更少的氨基酸长度的氨基酸的短聚合物(Garrett&Grisham,Biochemistry,第二版，1999,Brooks/Cole,110)。在一些实施方案中，本文考虑的肽可以包括不超过约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。多肽，也称作蛋白，典型的长度≥100个氨基酸(Garrett&Grisham,Biochemistry,第二版,1999,Brooks/Cole,110)。本文考虑的多肽可以包含，但不限于，100、101、102、103、104、105、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约900、约925、约950、约975、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500或更多个氨基酸残基。

本文考虑的肽可以进一步被修饰以包括非氨基酸部分。修饰可以包括但不限于：酰基化(例如，O-酰基化(酯),N-酰基化(酰胺),S-酰基化(硫酯),乙酰化(例如，在蛋白的N-末端处或在赖氨酸残基处加入乙酰基),甲酰化脂化(例如，连接硫辛酸盐，其为一种C8官能团),肉豆蔻酰化(例如，连接肉豆蔻酸，其为一种C14饱和酸),棕榈酰化(例如，连接棕榈酸，其为一种C16饱和酸),烷基化(例如，加入烷基，诸如在赖氨酸或精氨酸残基处加入甲基),异戊二烯化或戊烯化(例如，加入异戊二烯基诸如法尼醇或香叶基香叶醇),C-末端处的酰胺化,糖基化(例如，将糖基添加至天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸，产生糖蛋白)。与糖化作用(它被认为是糖类的非酶促连接)不同，有聚唾液酸化(例如，加入聚唾液酸)、糖基磷脂酰肌醇化(例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚形成)、羟基化、碘化作用(例如，甲状腺激素的碘化)、和磷酸化(例如，加入磷酸基，通常加入到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)。修饰作用可以包括加入糖基化标签(例如，任选地在C-末端加入4xDQNAT)和/或组氨酸标签(例如，6xHis)。

本文中可以对肽、多肽、蛋白及其变体制备参照。参照氨基酸序列可以包括，但不限于，SEQ ID NO:1-10中任一个的氨基酸序列。如本文所考虑的变体可以具有包括相对于参照氨基酸序列的保守氨基酸置换的氨基酸序列。例如，如本文所考虑的变体肽、多肽或蛋白可以包括相对于参照肽、多肽或蛋白的保守氨基酸置换和/或非保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是预期很少干扰参照肽、多肽或蛋白的特性的那些置换，“非保守氨基酸置换”是预期大多数干扰参照肽、多肽或蛋白的特性的那些置换。换句话说，保守氨基酸置换基本上保留了参照肽、多肽或蛋白的结构和功能。下表提供了示例性保守氨基酸置换的列表。

表1

保守氨基酸置换通常保持了:(a)在置换区中肽、多肽或蛋白主链的结构，例如，作为β片层或α螺旋构象，(b)置换位点处分子的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的体积(bulk)。非保守氨基酸置换通常破坏了：(a)在置换区中肽、多肽或蛋白主链的结构，例如，作为β片层或α螺旋构象，(b)置换位点处分子的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的体积。

本文考虑了包含相对于肽、多肽或蛋白的参照氨基酸序列的缺失的变体。“缺失”是指氨基酸或核苷酸序列中导致相对于参照序列缺少一个或多个氨基酸残基或核苷酸的改变。缺失移除至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或200个氨基酸残基或核苷酸。缺失可以包括内部缺失或末端缺失(例如，参照多肽的N-末端截短或C-末端截短或参照多核苷酸的5’-末端或3’-末端截短)。

本文考虑了包含肽、多肽或蛋白的参照氨基酸序列的片段的变体。“片段”是氨基酸序列中序列与参照序列相同但长度比参照序列短的一部分。片段可以包含至多达参照序列的整个长度减去至少一个氨基酸残基。例如，片段可以分别包含参照多肽的5-1000个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，片段可以包含参照多肽的至少5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、250或500个连续氨基酸残基。片段可以优先地选自分子的特定区域。术语“至少一个片段”涵盖全长多肽。

本文考虑包含相对于肽、多肽或蛋白的参照氨基酸序列的插入或添加的变体。词语“插入”和“添加”是指导致加入一个或多个氨基酸残基的氨基酸或序列的变化。插入或添加可以指1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸残基。

本文还考虑融合蛋白。“融合蛋白”是指通过将如本文公开的至少一个肽、多肽或蛋白或其变体与至少一个异源蛋白肽、多肽或蛋白(或其片段或变体)融合形成的蛋白。所述异源蛋白可以在所述肽或其变体的N-末端、C-末端或两个末端处融合。

“同源性”是指两个或更多个多肽序列之间的序列相似性，或可互换地，序列同一性。同源性、序列相似性和序列同一性百分比可以使用本领域和本文所述的方法确定。

短语“同一性百分比”和“％同一性”当应用于多肽序列时是指使用标准化算法比对至少两个多肽序列之间残基匹配的百分比。多肽序列比对的方法是众所周知的。一些比对方法考虑了保守氨基酸置换。这些保守置换，在上文更详细地进行了解释，一般保留了在置换位置处的电荷和疏水性，因此保留了多肽的结构(且因此保留了功能)。氨基酸序列的同一性百分比可以如本领域中理解的那样确定。(参见，例如，美国专利号7,396,664,该专利的全部内容通过引用并入本文)。普遍使用和自由获得的序列比较算法包由美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等人(1990)J.Mol.Biol.215:403410)提供，它可获自几个来源，包括NCBI、Bethesda、Md.的网站。BLAST软件包包括各种序列分析程序，包括“blastp”，该程序用来将已知的氨基酸序列与来自各种各样数据库的其他氨基酸序列进行比对。

同一性百分比可以在整个限定的多肽序列长度内测量，例如，由特定SEQ ID数来限定(例如，SEQ ID NO:1-10中的任一个)，或可以在较短的长度内测量，例如，在取自较大的限定的多肽序列的片段长度内，例如，至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。此类长度仅是示例性的，要理解在本文中在表、图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可以测量同一性百分比的长度。

特定多肽序列的“变体”可以被定义为利用可在美国国家生物技术信息中心网站获得的“BLAST 2 Sequences”工具使用blastp与所述多肽序列之一的特定长度相比与所述特定多肽序列具有至少50％序列同一性的多肽序列。(参见Tatiana A.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250)。与所述多肽之一的特定限定长度相比，这样的多肽对可以显示例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更大的序列同一性。“变体”可以与参照多肽具有基本上相同的功能活性(例如，糖基化酶活性或其他活性)。本文考虑“基本上分离的或纯化的”氨基酸序列。术语“基本上分离的或纯化的”是指从其天然环境移出的氨基酸序列，该序列与它们天然相关的其他组分至少60％游离，优选至少75％游离，和更优选至少90％游离，甚至更优选至少95％游离。本文考虑的变体多肽可以包括SEQ ID NOs:1-10中任一个的变体多肽。

如本文所用，“翻译模板”是指从表达模板转录的RNA产物，所述翻译模板可以被核糖体用来合成多肽或蛋白。

术语“反应混合物”，如本文所用，是指包含进行给定反应所需的试剂的溶液。如果反应混合物包含进行该反应所需的全部试剂，则它被称作完全反应混合物。反应混合物的组分可以单独地保存在单独的容器中，每个容器包含全部组分中的一种或多种。组分可以单独包装用于商业化并且可用的商业试剂盒可以包含反应混合物的反应组分中的一种或多种。

本文所述的方法的步骤可以以任何合适的次序进行，除非本文另外指明或上下文另外地明确地与其相悖。所述步骤可以重复或反复任何次数以实现期望的目标，除非本文另外指明或上下文另外地明确地与其相悖。

本文中记载了本发明的优选方面，包括发明人所知晓的用于执行本发明的最佳方式。在阅读了前面的描述后，对本领域普通技术人员来说，那些优选方面的变化形式是显而易见的。发明人期望本领域普通技术人员根据情况而定来采用这些变化形式，并且发明人期望本发明以如本文具体描述之外的其他方式实施。因此，本发明包括根据所适用法律允许的附带的权利要求中所述的主题的所有改动方式和等效形式。此外，上述要素的所有可能变化形式的任何组合包括在本发明的范围之内，除非本文另外指明或上下文另外明确地与其相悖。

无细胞蛋白合成(CFPS)

本文公开的菌株和系统可以适用于本领域中已知的无细胞蛋白合成方法。参见，例如，美国专利号4,496,538；4,727,136；5,478,730；5,556,769；5,623,057；5,665,563；5,679,352；6,168,931；6,248,334；6,531,131；6,869,774；6,994,986；7,118,883；7,189,528；7,338,789；7,387,884；7,399,610；8,703,471；和8,999,668。还参见美国申请公开号2015-0259757,2014-0295492,2014-0255987,2014-0045267,2012-0171720,2008-0138857,2007-0154983,2005-0054044和2004-0209321。还参见美国申请公开号2005-0170452；2006-0211085；2006-0234345；2006-0252672；2006-0257399；2006-0286637；2007-0026485；2007-0178551。还参见PCT国际申请公开号2003/056914；2004/013151；2004/035605；2006/102652；2006/119987；和2007/120932。还参见Jewett,M.C.,Hong,S.H.,Kwon,Y.C.,Martin,R.W.,和Des Soye,B.J.2014,“Methods for improved in vitroprotein synthesis with proteins containing non standard amino acids,”美国专利申请系列号:62/044,221；Jewett,M.C.,Hodgman,C.E.,和Gan,R.2013,“Methods foryeast cell-free protein synthesis,”美国专利申请系列号:61/792,290；Jewett,M.C.,J.A.Schoborg,和C.E.Hodgman.2014,“Substrate Replenishment and ByproductRemoval Improve Yeast Cell-Free Protein Synthesis,”美国专利申请系列号:61/953,275；和Jewett,M.C.,Anderson,M.J.,Stark,J.C.,Hodgman,C.E.2015,“Methods foractivating natural energy metabolism for improved yeast cell-free proteinsynthesis,”美国专利申请系列号:62/098,578。还参见Guarino,C.,&DeLisa,M.P.(2012).A prokaryote-based cell-free translation system that efficiently synthesizesglycoproteins.Glycobiology,22(5),596-601。所有这些参考文献的全部内容通过引用并入本申请中。

在某些示例性实施方案中，本文所述的一种或多种方法在器皿中执行，例如，单个器皿。术语“器皿”，如本文所用，是指适合用于容纳本文所述的一种或多种反应物(例如，用于一个或多个转录、翻译,和/或糖基化步骤)的任何容器。器皿的实例包括，但不限于，微量滴定板、试管、微量离心管、烧杯、烧瓶、多孔板、比色皿、流动系统、微纤维、显微镜盖玻片等。

在某些示例性实施方案中，生理学相容的(但不一定是天然的)离子和缓冲液用于转录、翻译和/或糖基化，例如，谷氨酸钾、氯化铵等。生理学细胞质盐条件是本领域技术人员所熟知的。

本文公开的菌株和系统可以应用于无细胞蛋白方法以便制备糖基化大分子(例如，糖基化肽、糖基化蛋白和糖基化脂质)。可以使用所公开的菌株和系统制备的糖基化蛋白可以包括具有N-连接糖基化(即，连接到天冬酰胺和/或精氨酸侧链的氮的聚糖)和/或O-连接糖基化(即，连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸和/或羟基脯氨酸的羟基氧的聚糖)的蛋白。糖基化脂质可以包括通过氧原子O-连接的聚糖，诸如神经酰胺。

本文公开的糖基化大分子可以包括由本领域中已知的单体构成的无分支的和/或分支的糖链，所述单体诸如，但不限于，葡萄糖(例如，β-D-葡萄糖)、半乳糖(例如，β-D-半乳糖)、甘露糖(例如，β-D-甘露糖)、岩藻糖(例如，α-L-岩藻糖)、N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、神经氨酸、N-乙酰基神经氨酸(即，唾液酸)和木糖，它们可以通过各自的糖基转移酶(例如，寡糖转移酶、GlcNAc转移酶、GalNAc转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶)连接到糖基化大分子、生长的聚糖链或供体分子(例如，供体脂质和/或供体分子)。本文公开的糖基化大分子可以包括本领域中已知的聚糖。

所公开的无细胞蛋白合成系统可以利用粗制的和/或至少部分分离的和/或纯化的组分。如本文所用，术语“粗制的”可以意指通过破坏和裂解细胞并且至多从破坏的和裂解的细胞最小程度地纯化粗制组分(例如通过将所述破坏和裂解的细胞离心并在离心后从上清液和/或沉淀物收集所述粗制组分)获得的组分。术语“分离的或纯化的”是指从其天然环境移出的组分，并且所述组分与它们天然相关的其他组分至少60％游离，优选至少75％游离，和更优选至少90％游离，甚至更优选至少95％游离。

在富含用于糖基化的组分的原核生物细胞裂解物中的无细胞糖蛋白合成(CFGpS)

本发明公开了用于进行无细胞糖蛋白合成(CFGpS)的组合物和方法。在一些实施方案中，所述组合物和方法包括或利用富含用于糖基化的组分并从原核生物的基因修饰株制备的原核生物细胞裂解物。

在一些实施方案中，基因修饰的原核生物是大肠杆菌的基因修饰株或适合用于制备用于CFGpS的裂解物的任何其他原核生物。任选地，大肠杆菌的修饰株来源于rEc.C321。优选地，所述修饰株包括优选地产生能够高得率地进行无细胞蛋白合成的裂解物的基因组修饰(例如，缺失了使基因不可操作的基因)。此外，优选地，修饰的菌株包括优选地产生包含相对高浓度的用于糖基化的糖前体的裂解物(例如，相对于没有所述基因组修饰的菌株)的基因组修饰(例如，缺失了使基因不可操作的基因)。在一些实施方案中，从所述修饰的菌株制备的裂解物包含的糖前体的浓度比从未修饰的菌株制备的裂解物高至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更高。作为实例，但非限制，可用于本发明方法、试剂盒和系统的细菌来源菌株包括大肠杆菌的重组菌株，诸如选自缺乏prfA、endA、gor、rne和lpxM的一种或多种基因产物的大肠杆菌的重组菌株。用于本公开的方法、试剂盒和系统的合适的重组菌株可以包括，但不限于：rEcoliΔprfAΔendAΔgorΔrne(705),大肠杆菌BL21(DE3),大肠杆菌CLM24,大肠杆菌CLM24ΔlpxM,大肠杆菌CLM24ΔlpxM CH-IpxE,大肠杆菌CLM24ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE,大肠杆菌CLM24ΔlpxM CH-IpxETT-IpxE KL-IpxE,和大肠杆菌CLM24ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE KL-IpxE KO-IpxE。

在一些实施方案中，所述修饰的菌株包括导致在糖基化中利用的单糖(例如，葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖、唾液酸、神经氨酸、岩藻糖)浓度增加的修饰。这样，所述修饰可以使代谢在糖基化中利用的单糖或多糖的酶失活。在一些实施方案中，所述修饰使脱水酶或碳氧裂解酶(EC 4.2)失活(例如，通过缺失编码该酶的基因的至少一部分)。具体地，所述修饰可以使GDP-甘露糖4,6-脱水酶(EC 4.2.1.47)失活。当所述修饰的菌株是大肠杆菌时，所述修饰可以包括gmd基因的失活修饰(例如，通过缺失gmd基因的至少一部分)。大肠杆菌gmd基因的序列在本文中作为SEQID NO:1提供，大肠杆菌GDP-甘露糖4,6-脱水酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2提供。

在一些实施方案中，所述修饰的菌株包括使在糖基转移酶通路中被利用的酶失活的修饰。在一些实施方案中，所述修饰使寡糖连接酶失活(例如，通过缺失编码该酶的基因的至少一部分)。具体地，所述修饰可以使任选地将O-抗原缀合到脂质A核心寡糖上的O-抗原连接酶失活。所述修饰可以包括waaL基因中的失活修饰(例如，通过缺失waaL基因的至少一部分)。大肠杆菌waaL基因的序列在本文中作为SEQ ID NO:3提供，大肠杆菌O-抗原连接酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO:4提供。

在一些实施方案中，所述修饰的菌株包括使脱水酶或碳氧裂解酶失活的修饰(例如，通过缺失编码该酶的基因的至少一部分)，该修饰的菌株还包括使寡糖连接酶失活的修饰(例如，通过缺失编码该酶的基因的至少一部分)。所述修饰的菌株可以包括gmd和waaL两者的失活或缺失。

在一些实施方案中，所述修饰的菌株可以被修饰以表达一种或多种正交或异源基因。具体地，所述修饰的菌株可以进行基因修饰以表达与糖蛋白合成相关的正交或异源基因，诸如参与脂质-连接的寡糖(LLO)通路的糖基转移酶(GT)。在一些实施方案中，所述修饰的菌株可以被修饰以表达正交或异源寡糖转移酶(EC 2.4.1.119)(OST)。寡糖转移酶或OST是将寡糖从脂质转移到蛋白质的酶。

具体地，所述修饰的菌株可以被基因修饰以表达糖基化系统中的正交或异源基因(例如，N-连接的糖基化系统和/或O-连接的糖基化系统)。空肠弯曲杆菌的N-连接的糖基化系统已经转移至大肠杆菌。(参见Wacker等人,“N-linked glycosylation inCampylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli,”Science 2002,Nov 29；298(5599):1790-3,该文献的全部内容通过引用并入本文)。具体地，所述修饰的菌株可以被修饰以表达空肠弯曲杆菌的pgl基因座的一种或多种基因或同源pgl基因座的一种或多种基因。Pgl基因座的基因包括pglG,pglF,pglE,wlaJ,pglD,pglC,pglA,pglB,pglJ,pglI,pglH,pglK和gne,它们用来合成脂质-连接的寡糖(LLO)，并将LLO的寡糖部分通过寡糖转移酶转移到蛋白。

可以在基因修饰的菌株中表达的合适的正交或异源寡糖转移酶(OST)可以包括空肠弯曲杆菌寡糖转移酶PglB。空肠弯曲杆菌OST的基因称为pglB,其序列作为SEQ ID NO:5提供，空肠弯曲杆菌PglB的氨基酸序列作为SEQ ID NO:6提供。PglB催化寡糖向存在于蛋白上的D/E-Y-N-X-S/T基序(Y,X≠P)的转移。在本文公开的方法、试剂盒和系统中有用的OST酶的其他非限制性实例可以包括，但不限于，大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)PglB、海鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)PglB、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)PglB、巨大脱硫弧菌(Desulfovibrio gigas)PglB和普通脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)PglB。

粗制细胞裂解物可以从本文公开的修饰菌株制备。粗制细胞裂解物可以从本文公开的不同的修饰菌株制备，并且所述粗制细胞裂解物可以组合在一起制备混合粗制细胞裂解物。在一些实施方案中，一种或多种粗制细胞裂解物可以从包括优选地产生包含相对高浓度的用于糖基化的糖前体(例如，与没有基因组修饰的菌株相比)的裂解物的基因组修饰(例如，缺失了使得基因不可操作的基因)的一种或多种修饰菌株制备。在一些实施方案中，一种或多种粗制细胞裂解物可以从已经被修饰以表达与糖蛋白合成相关的一种或多种正交或异源基因或基因簇的一种或多种修饰菌株制备。优选地，所述粗制细胞裂解物或混合粗制细胞裂解物富含糖基化组分，诸如脂质-连接的寡糖(LLO)、糖基转移酶(GT)、寡糖转移酶(OST)或它们的任意组合。更优选地，所述粗制细胞裂解物或混合粗制细胞裂解物富含展示核心真核生物聚糖的Man₃GlcNAc₂ LLO和/或展示全唾液酸化人聚糖的Man₃GlcNAc₄Gal₂Neu₅Ac₂ LLO。例如，但非限制，在所公开的方法、试剂盒和系统中有用的聚糖结构可以包括但不限于土拉热弗朗西丝菌SchuS4 O-多糖、大肠杆菌O78 O-多糖、大肠杆菌O-7O-多糖、大肠杆菌O-9O-多糖引物、空肠弯曲杆菌庚糖N-聚糖、海鸥弯曲杆菌PglB己糖N-聚糖,工程化海鸥弯曲杆菌PglB己糖N-聚糖、产琥珀酸沃廉菌己糖N-聚糖和真核生物Man₃GlcNac₂ N-聚糖结构。

所公开的粗制细胞裂解物可以在无细胞糖蛋白合成(CFGpS)系统中用来合成多种多样的糖蛋白。在CFGpS系统中合成的糖蛋白可以包括原核生物糖蛋白和真核生物蛋白，包括人蛋白。在体外合成糖蛋白的方法中可以通过使用本文公开的粗制细胞裂解物或粗制细胞裂解物的混合物执行下列步骤来利用CFGpS系统：(a)执行靶糖蛋白的基因的无细胞转录；(b)进行无细胞翻译；和(c)进行无细胞糖基化。所述方法可以在单一器皿或多个器皿中进行。优选地，合成方法的步骤可以使用单一反应器皿来进行。所公开的方法可以用来合成各种各样的糖蛋白，包括原核生物糖蛋白和真核生物糖蛋白。

生物缀合物疫苗制备

尽管蛋白-聚糖偶联技术(PGCT)代表了生物缀合物疫苗制备的简化和成本有效策略，但其具有三个主要限制。首先，工艺开发时间管线、糖基化通路设计-构建-测试(DBT)周期、和生物缀合物制备都受细胞生长的限制。第二，还没有显示FDA批准的载体蛋白(诸如来自破伤风梭菌和白喉棒状杆菌的毒素)是否证明与活大肠杆菌中的N-连接糖基化相容。第三，选择非天然聚糖已知会被空肠弯曲杆菌寡糖转移酶(OST)PglB低效率地转移。

生物缀合物的模块化体外制备平台具有解决所有这些限制的潜力。在本文中，我们证明了针对土拉热弗朗西丝菌和大肠杆菌的致病菌株的生物缀合物可以通过协同地体外转录、翻译和N-糖基化在持续仅20小时的无细胞糖蛋白合成(CFGpS)反应中产生。该系统具有将新抗菌疫苗的工艺开发和分配时间管线从几周减少到几天的潜力。此外，因为CFGpS平台的模块化性质以及无细胞系统已经证明了与活细胞相比制备膜蛋白的优势这一事实，该方法可以容易地被应用用来使用FDA批准的载体蛋白(诸如破伤风梭菌和白喉棒状杆菌毒素(它们是膜定位的))来制备生物缀合物。这可以简单地通过将编码这些载体蛋白的质粒提供至CFGpS反应中来实现。另外，因为CFGpS的模块化性质，体外方式可以用来成型原型空肠弯曲杆菌OST的其他天然或工程化同源物以鉴定具有提高的转移目标O-抗原LLO的效率的候选OST。这可以通过富集具有目标OST的裂解物并将它们与LLO裂解物混合在混合的裂解物CFGpS反应物中来实现，如我们以前所描述的那样。(参见WO2017/117539，该申请的全部内容通过引用并入本文)。最后，我们证明了无细胞生物缀合物合成反应物可以被冻干并且保留了生物缀合物合成能力，证明了CFGpS系统对于新疫苗的按需、便携的和低成本制备或开发工作的潜力。这种用于体外生物缀合物疫苗制备的新方法已经证明了相对于现有方法的快速、模块化和便携式疫苗成型和制备的优势。我们的技术使得能够快速地制备针对用户指定的细菌靶标的生物缀合物疫苗以进行治疗性开发或基础研究。

本发明人不知晓具有制备糖蛋白或生物缀合物疫苗的能力的任何原核生物无细胞系统。有一些用于无细胞糖蛋白制备的市售真核细胞裂解物系统(Promega,ThermoFisher)，但这些系统不涉及过表达正交糖基化机制并且不能够以我们的系统可以做到的那样进行模块化的用户指定的糖基化。因此原因，我们感到我们的发明仍然具有很重大的商业前途。

本发明公开的体外生物缀合物疫苗制备方法已经证明了相对于现有方法的快速、模块化和便携式疫苗成型和制备的优势。此系统解决了现有制备方式的限制，使其成为用于抗菌疫苗制备的有吸引力的备选或补充策略。鉴于抗生素耐药细菌感染所引起的不断增长的医疗保健问题，该方法具有非常有价值地用于开发、制备和分配针对各种各样的致病性细菌菌株的新疫苗的潜力。本公开的方法的优势包括：按需表达生物缀合物疫苗；成型新生物缀合物疫苗候选物；成型新生物缀合物疫苗制备通路；将生物缀合物疫苗分配给资源匮乏场所。

总之，我们公开了第一种能够进行糖蛋白疫苗的协同的无细胞转录、翻译和糖基化的原核生物无细胞系统。公开的系统能够在20小时内制备生物缀合物疫苗。系统的模块化使得能够快速地利用各种载体蛋白成型新糖基化通路和疫苗候选物。合适的载体可以包括但不限于流感嗜血杆菌蛋白D(PD)(SEQ ID NO:7)、脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白(PorA)(SEQID NO:8)、白喉棒状杆菌毒素(CRM197)(SEQ ID NO:9)、破伤风梭菌毒素(TT)(SEQ ID NO:10)、TT(TTc)的片段C、TT的轻链结构域(TT轻链)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、与MBP融合的人胰高血糖素肽、Superfolder绿色荧光蛋白(GFP)、单链可变抗体片段(scFv)、人促红细胞生成素变体、空肠弯曲杆菌AcrA和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)内毒素A(EPA)或其变体。该系统的组分和产物可以被冻干，这使得具有广泛的快速分配疫苗制备技术的潜力。所公开的系统将在原核生物细胞裂解物中制备生物缀合物所需的时间从几周减少到几天，这可以在该技术的商业化中提供有竞争力的优势。

本发明公开的生物缀合物可以配制成疫苗，该疫苗任选地可以包括用于诱导和/或启动免疫应答的其他药剂，诸如佐剂。术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以充当组织储库，该储库缓慢地释放抗原，佐剂还可以充当非特异性地增强免疫应答的淋巴样系统激活物。可以在本发明公开的组合物中利用的佐剂的实例包括但不限于共聚物佐剂(例如，Pluronic brand poloxamer 401,CRL1005，或低分子量共聚物佐剂，诸如佐剂),聚(I:C),R-848(一种Th1-样佐剂),瑞喹莫德,咪喹莫特，PAM3CYS,磷酸铝(例如，AlPO₄),loxoribine,潜在有用的人佐剂诸如BCG(BacilleCalmette-Guerin，卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum),CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN),霍乱毒素衍生的抗原(例如，CTA1-DD),脂多糖佐剂，完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，皂苷(例如，Quil-A),矿物凝胶诸如氢氧化铝，表面活性物质诸如溶血磷脂酰胆碱，普卢兰尼克多元醇类(pluronic polyols),聚阴离子，肽类，水包油或烃乳液(例如，可获自Novartis Vaccines的MF59或Montanide ISA 720),匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。

示例性实施方案

下面的实施方案是说明性的，不意在限制要求保护的主题的范围。

实施方案1.一种合成N-糖基化重组蛋白载体的方法，所述重组蛋白载体任选地可以被用作生物缀合物免疫原或疫苗，所述方法包括进行所述重组蛋白载体的协同转录、翻译和N-糖基化，从而提供所述N-糖基化重组蛋白载体，所述重组蛋白载体可以用作生物缀合物免疫原或疫苗，其中所述N-糖基化重组蛋白载体包含：(i)共有序列(任选地插入在所述蛋白载体中)N-X-S/T，其中X可以是除脯氨酸以外的任何天然或非天然氨基酸；和(ii)来自至少一种细菌的N-连接至所述重组蛋白载体的至少一种抗原多糖，其中所述至少一种抗原多糖任选地是至少一种细菌O-抗原,任选地来自大肠杆菌或土拉热弗朗西斯菌的一个或多个菌株；且所述生物缀合物疫苗任选地可以包括佐剂。

实施方案2.实施方案1所述的方法，其中所述载体蛋白是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的工程化变体。

实施方案3.实施方案1所述的方法，其中所述载体蛋白选自来自破伤风梭菌的毒素的脱毒变体和来自白喉棒状杆菌的毒素的脱毒变体。

实施方案4.实施方案1所述的方法，其中所述载体蛋白选自流感嗜血杆菌蛋白D(PD)、脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白(PorA)以及它们的变体。

实施方案5.前述任一实施方案所述的方法，其中所述方法利用寡糖转移酶(OST)，所述OST是空肠弯曲杆菌PglB的天然存在的细菌同源物。

实施方案6.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述方法利用的OST是空肠弯曲杆菌PglB的工程化变体。

实施方案7.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述方法利用的OST是天然存在的古细菌OST。

实施方案8.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述方法利用的OST是天然存在的单亚基真核生物OST，诸如在布氏锥虫(Trypanosoma bruceii)中发现的那些。

实施方案9.一种粗制细胞裂解物制备方法，其中在所述粗制细胞裂解物的来源菌株中表达正交基因或基因簇，产生富含糖基化组分(脂质-连接的寡糖(LLO)、寡糖转移酶(OST)和/或LLO和OST两者)的裂解物，任选地产生富含LLO(例如，与O-抗原相关的LLO)的单独裂解物和富含OST(例如，其底物是LLO)的单独裂解物，和任选地将所述单独裂解物组合在一起进行载体蛋白的无细胞蛋白合成，所述载体蛋白通过OST的酶活性用LLO的聚糖组分糖基化，并且进一步任选地纯化所述糖基化载体蛋白和任选地将所述糖基化载体蛋白作为免疫原施用。

实施方案10.实施方案9所述的方法，其中所述来源菌株过表达编码寡糖转移酶(OST)的基因。

实施方案11.实施方案9或10所述的方法，其中所述来源菌株过表达合成的糖基转移酶通路，导致产生O-抗原，任选地来自土拉热弗朗西斯菌Schu S4脂质-连接的寡糖的O-抗原(FtLLO)。

实施方案12.实施方案9或10所述的方法，其中所述来源菌株过表达合成的糖基转移酶通路，导致产生O-抗原，任选地来自产肠毒素的大肠杆菌O78脂质-连接的寡糖的O-抗原(EcO78LLO)。

实施方案13.实施方案9-12中任一项所述的方法，其中所述来源菌株过表达糖基转移酶通路和OST，导致产生LLO和OST。

实施方案14.实施方案9或10所述的方法，其中所述来源菌株过表达来自致病性细菌菌株的O-抗原糖基转移酶通路，导致产生O-抗原脂质-连接的寡糖(LLO)。

实施方案15.一种无细胞制备生物缀合物免疫原或疫苗的方法，所述方法包括混合粗制细胞裂解物(例如，实施方案9-14中所述的任一种粗制细胞裂解物)作为一个或多个步骤。

实施方案16.实施方案15所述的方法，其中所述生物缀合物免疫原或疫苗包含为蛋白或肽的免疫原性载体。

实施方案17.实施方案15所述的方法，其中所述生物缀合物免疫原或疫苗包含为蛋白或肽的免疫原性载体，包括选自下列的蛋白或其肽：流感嗜血杆菌蛋白D(PD),脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白(PorA),白喉棒状杆菌毒素(CRM197),破伤风梭菌毒素(TT)和大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，以及它们的变体。

实施方案18.实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述方法的组分可以被冻干并且当再水化时保留生物缀合物合成能力。

实施方案19.实施方案15-18中任一项所述的方法，其中目标是按需疫苗制备。

实施方案20.实施方案15-19中任一项所述的方法，其中目标是在资源受限的场所的疫苗制备。

实施方案21.一种用于体外合成N-糖基化载体蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含下列组分中的一种或多种：(i)第一组分，所述第一组分包含含有正交寡糖转移酶(OST)的细胞裂解物；(ii)第二组分，所述第二组分包含含有O-抗原(例如，包含O-抗原的脂质-连接的寡糖(LLO)的细胞裂解物；(iii)第三组分，所述第三组分包含转录模板和任选地用于从编码载体蛋白的所述转录模板合成mRNA的聚合酶，所述载体蛋白包含插入和/或天然存在的共有序列N-X-S/T,其中X可以是除脯氨酸以外的任何天然或非天然氨基酸。

实施方案22.实施方案21所述的试剂盒，其中所述第一组分、所述第二组分和所述第三组分中的一种或多种是冻干的并且当再水化时保留生物学活性。

实施方案23.实施方案21或22所述的试剂盒，其中所述第一组分细胞裂解物由过表达编码所述正交OST(例如空肠弯曲杆菌PglB)的基因的来源菌株(例如，大肠杆菌)产生。

实施方案24.实施方案21-23中任一项所述的试剂盒，其中所述第二组分细胞裂解物由过表达合成的糖基转移酶通路(例如，用于产生土拉热弗朗西斯菌Schu S4 O-抗原(FtLLO裂解物)的生物合成机制或用于产生产肠毒素的大肠杆菌O78脂质-连接的寡糖(EcO78LLO裂解物)的生物合成机制)的来源菌株产生。

实施方案25.一种无细胞制备糖蛋白的方法，所述糖蛋白任选地可以是适合用作生物缀合物免疫原或疫苗的生物缀合物，所述方法包括：(a)将包含正交寡糖转移酶(OST)的第一细胞裂解物和包含O-抗原(例如，脂质-连接的寡糖(LLO))的第二细胞裂解物混合以制备无细胞蛋白质合成反应物；(b)在所述无细胞蛋白质合成反应物中转录和翻译载体蛋白(例如，任选地通过将所述载体蛋白的转录模板和/或聚合酶加入到所述无细胞蛋白质合成反应物)，所述载体蛋白包含插入的和/或天然存在的共有序列N-X-S/T，其中X可以是除脯氨酸以外的任何天然或非天然氨基酸；以及(c)在所述无细胞蛋白质合成反应物中利用所述细菌O-抗原糖基化所述载体蛋白。

实施方案25.实施方案24所述的方法，其中所述第二细胞裂解物包含所述O-抗原作为脂质-连接的寡糖(LLO)的一部分。

实施方案26.实施方案24或25所述的方法，进一步包括将所述糖蛋白配制为疫苗组合物，任选地包括佐剂。

实施方案27.通过上述任一种方法和/或试剂盒制备的生物缀合物免疫原或疫苗。

实施方案28.一种免疫接种方法，包括将实施方案27所述的疫苗施用于有需要的受试者。

实施例

下面的实施例是说明性的并且不意在限制要求保护的主题的范围。

实施例1–通过在原核生物细胞裂解物中通过重组产生N-糖基化蛋白快速体外合 成生物缀合物疫苗的方法

摘要

缀合物疫苗是用于预防威胁生命的细菌感染的最安全和最有效方法之一[1-10]。生物缀合物疫苗是一种通过蛋白聚糖偶联技术(PGCT)制备的缀合物疫苗类型，其中使用活大肠杆菌细胞中的细菌寡糖转移酶(OST)将多糖抗原通过N-糖基化缀合到重组载体蛋白[11]。生物缀合物疫苗具有极大地减少制备抗菌疫苗所需的时间和成本的潜力。然而，PGCT受以下的限制：i)体内工艺开发时间管线的长度；和ii)FDA-批准的载体蛋白(诸如来自破伤风梭菌(Clostridium tetani)和白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)的毒素)还没有证明与活的大肠杆菌中的N-连接的糖基化作用相容的事实。在此，我们已经应用了无细胞糖蛋白合成(CFGpS)技术使得能够在持续20小时的反应中快速地体外产生针对大肠杆菌和土拉热弗朗西斯菌的致病菌株的生物缀合物疫苗。由于CFGpS系统的模块化特性，这种无细胞策略可以容易地应用以使用FDA批准的载体蛋白产生生物缀合物或产生其他的针对表面抗原基因簇已知的致病细菌的疫苗[11][9][7,10][3,5,6,8]。我们进一步展示了该系统可以被冻干并且保留了生物缀合物合成能力，证明了按需疫苗生产和在资源匮乏场所的开发的潜力。此工作首次证明了在大肠杆菌裂解物中生产生物缀合物疫苗并且作为抗菌疫苗候选物的便携式成型或生产平台具有有前途的应用。

背景和意义

对蛋白的糖基化或将聚糖(糖类)连接到蛋白，是自然界中最丰富的翻译后修饰，在蛋白质折叠和活性中具有至关重要的作用[1-4]。当其首先在二十世纪三十年代发现时[12]，糖基化被认为是真核生物专有的。然而，在二十世纪七十年代在古细菌中也发现了糖蛋白[13,14],在二十世纪九十年代晚期和二十一世纪初期在细菌中发现了糖蛋白[15,16]，确立了糖基化为生命的所有范畴内的核心翻译后修饰。已经记载了多种多样的聚糖结构，包括线性和高度支化的多糖链[17],与其他多肽修饰相比，这产生了指数性增加的信息内容[18]。

由于糖基化在蛋白结构和信息储存中的作用，糖基化参与许多生物过程。在真核生物中，糖蛋白参与免疫识别和应答、细胞内运输和细胞内信号传导[19-22]。此外，糖基化的改变已经显示与疾病状态相关联，包括癌症[23-25]、炎症[26-29]和阿尔兹海默病[30]。在原核生物中，糖基化已知在毒力和宿主侵袭方面具有重要作用[31-33]。基于糖基化在大量生物学过程中的重要作用，已经提议改动生物学的中心法则以包括聚糖作为核心组分[34]。

糖基化的最常见形式是天冬酰胺连接(N-连接)和丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)连接(O-连接)[35]。N-连接的糖基化的特征在于通过寡糖转移酶(OST)向天冬酰胺(Asn)残基的侧链氮加入聚糖部分，所述寡糖转移酶(OST)识别共有序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸[36,37]。此过程发生在内质网中并且辅助蛋白折叠、质量控制和运输[38]。O-连接的糖基化在N-聚糖连接后发生在高尔基体中。不像N-连接的糖基化，对于O-连接的糖基化没有已知的共有序列[39,40]。尽管聚糖在生物学中的重要性，近年来糖科学被认为是一个尚未被充分研究的领域。美国国家科学院2012国家研究年会突出地报道了对糖科学中转化进展的关键性需求[41]。发现细菌中的糖基化通路使得其成为关于此重要的翻译后修饰的新发现[42,43],但需要新的合成和分析工具来推动此领域。

由于近年来对细菌糖基化的发现，已经在许多细菌中发现了携带N-和O-连接的聚糖的蛋白[44,45]。被最充分研究的细菌糖基化系统是来自空肠弯曲杆菌的pgl通路，已经显示其在大肠杆菌中功能性表达(图1)[46]。在空肠弯曲杆菌中，蛋白质被1.406kDaGlcGalNAc₅Bac庚糖(Glc:葡萄糖,GalNAc:N-乙酰基半乳糖胺,Bac:bacillosamine)N-糖基化。GT将庚糖组装到脂质锚十一碳异戊二烯焦磷酸酯(undecaprenol pyrophosphate，Und-PP)上，然后用作OST(PglB)的底物进行N-连接的糖基化[47-49]。此通路明显比真核生物糖基化通路更简单，并且已经被用来增加我们对N-连接的糖基化的机制的理解[42,43]。

尽管不是所有细菌都合成糖蛋白，但糖基化经常参与细菌细胞壁的合成。脂多糖(LPS)分子是许多革兰氏阴性细菌的外膜的主要成分，并且由脂质锚(一种寡糖核心)构成，并且可变多糖区被称作O-抗原[32]。荚膜多糖(CPS)是在结构上类似于LPS的另一种类型的表面多糖，不同之处在于在荚膜多糖中，多糖区直接连接到脂质A或磷脂锚[31]。LPS O-抗原(O-PS)和CPS是细菌病原体在不利的宿主环境中存活和进行宿主侵袭所使用的主要工具之一[50-53]。因此，对CPS和O-PS生物合成机制的阐明是抗生素和抗菌疫苗开发所感兴趣的。

抗生素耐药细菌菌株的增加使得有必要开发用于治疗和预防威胁生命的细菌感染的新策略。在2013年，疾病控制和预防中心发布的报告将抗生素耐药性描述为美国最严重的健康威胁之一。缀合物疫苗由与载体蛋白共价连接的CPS或O-PS抗原组成，它是对抗细菌感染的最安全和最有效的预防性措施之一，并且已经被用来减少肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌感染的发病率[1-10]。因为多糖抗原不能直接地活化未致敏T细胞，它们必须被缀合至载体蛋白以便诱导持久的免疫记忆[54]。然而，现有的制备缀合物疫苗的技术是复杂的，涉及多个加工和纯化步骤，得到的产物是不清楚的(图2,顶部)[2]。另外，这些过程是耗时的并且可以需要大规模发酵致病性细菌，使得缀合物疫苗对于在发展中国家中的疫苗接种活动昂贵得无法接受。

最近使用细菌N-糖基化机制实现了在活大肠杆菌细胞中制备重组O抗原-蛋白缀合物(图2,底部)[11]。这些所谓的生物缀合物疫苗具有减少抗菌疫苗制备所需的成本和时间的潜力。已经针对几种细菌靶标开发了生物缀合物，所述细菌靶标包括土拉热弗朗西斯菌[4]、铜绿假单胞菌[11]、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)[9]、痢疾志贺氏菌(Shigella dynsenteriae)[7,10]、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)[8]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[5]、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)[3]和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)[6]。用于生物缀合物制备的体外方法可以将用于新抗菌疫苗的工艺开发时间管线从几个月缩短到几周[55]。

无细胞蛋白合成(CFPS)是允许在粗制细胞裂解物中制备蛋白的新兴领域[55,56]。CFPS技术在50多年前首先由Nirenberg和Matthaei用来破译遗传密码[57]。在二十世纪六十年代晚期和二十世纪七十年代早期，CFPS被采用用来辅助阐明大肠杆菌乳糖[58]和色氨酸[59]操纵子的调控机制。在过去的二十年中，CFPS平台已经经历了急速的发展以满足重组蛋白表达技术不断增加的需求[55]。

CFPS对重组蛋白表达提供了几种优势。具体来说，开放的反应环境允许添加或去除蛋白合成的底物，以及精确的在线反应监测。另外，CFPS反应环境可以完全针对目标蛋白产物的制备并对其优化。CFPS有效地将细胞的目标(生长和繁殖)与工程师的目标(蛋白过表达和简单的产物纯化)分解开，已经证明对于复杂蛋白的制备和蛋白组装是有优势的，所述蛋白包括膜蛋白[60-63]、双特异性抗体[64]、抗体-药物缀合物[65]和病毒样颗粒疫苗[66-68]。总之，与体内方式相比，CFPS技术允许缩短蛋白合成时间管线和增加添加或去除底物的灵活性。特别是大肠杆菌CFPS系统已经被广泛采用，因为其i)具有很高的分批产量，据报道高达2.3g/L绿色荧光蛋白(GFP)[69],ii)所需的底物廉价[70-72],和iii)具有线性放大反应体积超过10⁶L的能力[73]。

在一些真核生物CFPS系统中糖基化是可能的，包括ICE、CHO提取物和人白血病细胞系提取物[74-77]。然而，这些平台利用内源机制来进行糖基化，意味着i)可能的聚糖结构被限制于由宿主细胞天然合成的那些，和ii)糖基化过程以“盲盒”的方式进行，因此难以改造或控制。高活性大肠杆菌CFPS平台的开发近年来大力致力于通过添加正交糖基化组分在大肠杆菌裂解物中实现糖蛋白制备。在一个研究中，Guarino和DeLisa证明了通过向CFPS反应中添加纯化的脂质-连接的寡糖(LLO)和空肠弯曲杆菌OST在大肠杆菌CFPS中产生糖蛋白的能力。实现了50-100μg/mL AcrA(一种空肠弯曲杆菌糖蛋白)的产量[78]。尽管近年来有这些进展，但细菌无细胞糖基化系统还是受到它们不能共同活化有效的蛋白合成和糖基化的限制。我们最近开发了一种无细胞糖蛋白合成(CFGpS)系统，该系统通过在选择性地富含糖基化酶的大肠杆菌裂解物中实现蛋白的模块化的协同转录、翻译和N-糖基化而解决了这种限制问题(参见WO 2017/117539,该申请的全部内容通过引用并入本文)。在此，我们应用此技术平台来制备生物缀合物疫苗从而获得了用于快速、模块化的体外表达生物缀合物的方法。

结果和讨论

用于生物缀合物疫苗制备的无细胞糖蛋白合成(CFGpS)。尽管蛋白-聚糖偶联技术(PGCT)代表了用于生物缀合物疫苗制备的简化的和成本有效的策略，但它具有三个主要限制。首先，工艺开发时间管线、糖基化通路设计-构建-测试(DBT)周期和生物缀合物制备都受细胞生长的限制。第二，还没有显示FDA批准的载体蛋白(诸如来自破伤风梭菌和白喉棒状杆菌的毒素)是否证明与活大肠杆菌中的N-连接糖基化相容。第三，选择非天然聚糖已知会被空肠弯曲杆菌OST(即PglB)低效率地转移[9]。

生物缀合物的模块化体外制备平台具有解决所有这些限制的潜力。在本文中，我们证明了针对土拉热弗朗西丝菌和大肠杆菌的致病菌株的生物缀合物可以通过协同地体外转录、翻译和N-糖基化在持续仅20小时的无细胞糖蛋白合成(CFGpS)反应中产生。该系统具有将新抗菌疫苗的工艺开发和分配时间管线从几周减少到几天的潜力。此外，因为CFGpS平台的模块化性质以及与活细胞相比无细胞系统已经证明了用于制备膜蛋白的优势这一事实[60-63]，该方法可以容易地被应用用来使用FDA批准的载体蛋白(诸如破伤风梭菌和白喉棒状杆菌毒素(它们是膜定位的))来制备生物缀合物。这可以简单地通过将编码这些载体蛋白的质粒提供至CFGpS反应中来实现。另外，因为CFGpS的模块化性质，体外方式可以用来成型原型空肠弯曲杆菌OST的其他天然或工程化同源物(诸如最近记载的那些[9,79,80])，以鉴定具有提高的转移目标O-抗原LLO的效率的候选OST。这可以通过富集具有目标OST的裂解物并将它们与LLO裂解物混合在混合的裂解物CFGpS反应物中来实现，如我们以前所描述的那样(Jewett lab,未发表的数据；美国临时专利申请62273124)。最后，我们证明了无细胞生物缀合物合成反应物可以被冻干并且保留了生物缀合物合成能力，证明了CFGpS系统对于新疫苗的按需、便携的和低成本制备或开发工作的潜力。这种用于体外生物缀合物疫苗制备的新方法已经证明了相对于现有方法的快速、模块化和便携式疫苗成型和制备的优势。

针对土拉热弗朗西斯菌的生物缀合物疫苗可以在体外通过CFGpS合成。土拉热弗朗西斯菌是一种导致兔热病的革兰氏阴性菌。土拉热弗朗西斯菌被认为是已知对人的感染性最强的细菌之一：单一的吸入性杆菌导致40-50％的个体感染，死亡率达到30％[81]。最近表征了O-抗原生物合成的基因座[82]并使用它在活大肠杆菌细胞中形成了生物缀合物疫苗[4]。我们决定使用此通路采用CFGpS来制备抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物疫苗。我们假设可以使用CFGpS技术在体外合成抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物疫苗(图3)。

我们假设通过在缺少WaaL O-抗原连接酶的大肠杆菌CFGpS底盘菌株中过表达正交糖基化机制，Und-PP-连接的多糖抗原可以在S30裂解物中富集。为了检验此假设，我们从过表达空肠弯曲杆菌OST，即PglB(CjOST裂解物)和用于产生土拉热弗朗西斯菌Schu S4 O抗原(FtLLO裂解物)的生物合成机制的CLM24细胞制备了裂解物。来自土拉热弗朗西斯菌Schu S4的此17kb基因簇包含15个预测的开放阅读框(ORF)并产生由重复单位GalNAcAN₂QuiNAcQui4NFm(GalNAcAN:2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖酰胺,QuiNAc:2-乙酰氨基-2,6-二脱氧-D-葡萄糖,Qui4NFm:4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-D-葡萄糖)组成的寡糖(图6A)[82]。通过高压匀浆制备裂解物以促进可溶性反相膜囊泡形成为粗制裂解物，该囊泡携带结合膜的组分，诸如FtLLO和CjOST。

我们假设可以使用CFGpS技术在体外合成抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物疫苗。为了制备携带土拉热弗朗西斯菌O多糖(FtO-PS)的生物缀合物，在30℃持续20小时的CFGpS反应中将CjPglB裂解物与FtLLO裂解物混合。这些反应物包含编码下列之一的质粒：i)被改造以包括在残基T216处插入的柔性接头中的DQNAT序列肽段和C-末端His标签的super-folder绿荧光蛋白(sfGFP-21-DQNAT-6xHis)，或ii)改造的麦芽糖结合蛋白构建体，所述构建体具有DQNAT序列肽段的4个C-末端重复单元和C-末端His标签(MBP-4xDQNAT-6xHis)。由缀合到MBP-4xDQNAT-6xHis的大肠杆菌O-抗原构成的生物缀合物最近显示在小鼠中引起体液和细胞免疫[83]。在CFGpS反应的第一个小时内，反应混合物掺入氯化锰(MnCl₂)和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)去污剂(终浓度为25mM MnCl₂,0.1％w/v DDM)，以优化CjPglB活性(Jewett lab,未发表的数据)。在使CFGpS反应在30℃进行总计20小时后，通过利用抗-His抗体和对FtO-PS特异的市售单克隆抗体进行免疫印迹测定糖基化活性。当FtLLO和CjPglB裂解物混合时观察到的梯状图形指示FtLLO连接，并且该梯状图形通过Wzy聚合酶的作用由O-PS链长可变性造成(图4A)[4,11]。这些结果首次证明了将无细胞载体蛋白合成和O-抗原连接协同地整合在一起。此外，我们显示了无细胞生物缀合物合成在仅20小时内发生，使得该无细胞平台成为用于生物缀合物疫苗候选物快速制备和成型的一个有吸引力的选项。

由于CFGpS平台的模块化特性，针对大肠杆菌O78和其他致病菌株的生物缀合物疫 苗可以容易地合成。为了证明CFGpS方式对于生物缀合物制备的通用性和模块化，我们试图制备针对其他致病细菌的生物缀合物。我们决定合成针对产肠毒素的大肠杆菌O78株的生物缀合物，因为以前已经记述了它的生物合成通路[84]并且已有对该菌株特异的市售抗血清。克隆大肠杆菌O78基因簇并将其编码在质粒pMW07-O78中。大肠杆菌O78基因簇的表达导致产生了具有重复单元GlcNAc₂Man₂(GlcNAC:N-乙酰基葡糖胺；Man:甘露糖)的O-抗原(图6B)。

我们使用上面所述的相同方法从表达pMW07-O78的CLM24细胞制备了富含大肠杆菌O78抗原LLO的裂解物(EcO78LLO裂解物)。然后我们将EcO78LLO裂解物与CjOST裂解物在包含编码sfGFP21-DQNAT-6xHis或MBP-4xDQNAT-6xHis的质粒的CFGpS反应物中混合。如上所述运行CFGpS反应。通过利用抗-His抗体和针对大肠杆菌O78株的市售抗血清进行免疫印迹测定糖基化活性。再次，当EcO78LLO裂解物和CjOST裂解物存在于反应物中时观察到梯状图形，表明EcO78-PS的成功缀合(图4B)。所述生物缀合物还与抗-EcO78血清有交叉反应(数据未显示)。这些结果证明体外方式的模块化特性，并且提供了CFGpS平台可以用来制备靶向许多不同的致病细菌菌株的生物缀合物疫苗的证据。有吸引力的候选物包括其表面抗原基因簇已知的致病细菌，包括铜绿假单胞菌[11]、肠道沙门氏菌[9]、痢疾志贺氏菌[7,10]、福氏志贺氏菌[8]、金黄色葡萄球菌[5]、流产布鲁氏菌[3]和类鼻疽伯克霍尔德菌[6]。这些结果证明该体外系统用于快速制备或成型针对各种各样致病细菌的疫苗候选物的潜力。此外，因为可以在仅20小时内利用不同的O-PS抗原实现合成，因此该无细胞平台代表了用于快速制备和成型新生物缀合物疫苗候选物的一个有吸引力的选项。

冻干的CFGpS反应物保留了生物缀合物合成能力。传统缀合物疫苗的一个主要限制是因它们耗时的制备过程而造成的高成本。作为比较，制备生物缀合物疫苗较为廉价，然而从活细胞发酵和纯化蛋白所需的时间决定了制备时间。我们想测试我们的CFGpS反应物是否可以被冻干以用于潜在的室温保存和分配使得能够与体内方式相比更快速地制备和更广泛地开展疫苗接种活动和开发工作。为了测试这种假设是否可行，制备了包含单独CjOST裂解物或FtLLO裂解物、或CjOST和FtLLO裂解物两者的混合物的CFGpS反应物。然后将这些反应物冻干并用15μL无核酸酶水复配。反应物含有编码具有C-末端DQNAT序列肽段接着His标签的短链抗体片段(scFv13-R4-DQNAT-6xHis)或MBP-4xDQNAT-6xHis的质粒。在复配后直接将预混合的反应物(泳道1,2,5,6)电泳，同时在复配后将含有单独CjOST裂解物或FtLLO裂解物的反应物混合(泳道3,4,7)。当合成DQNAT序列肽段时且CjOST裂解物或FtLLO裂解物两者存在于反应物中时，FtO-PS与靶蛋白连接(泳道2,4,6,7)。这些结果证实了CFGpS反应混合物可以被冻干，而不会丧失生物缀合物合成能力，突出了我们的技术用于便携式按需制备疫苗和长期的无需冷藏保存的潜力。

结论

我们在此描述了一种用于协同的体外转录、翻译和将疫苗抗原缀合到载体蛋白的新方法。此体外方式独特地(i)将细胞活力与糖基化活性分开，并能够通过体外复配糖基化组分来减少细胞代谢负担，(ii)允许对单个糖基化组分进行设计-构建-测试(DBT)重复，和(iii)允许在充分限定的实验条件下组装糖基化通路，所述实验条件包括在细胞中不可能的化学和物理操作。此外，该系统具有明显的商业上有吸引力的应用以使用FDA批准的载体蛋白(诸如来自破伤风梭菌和白喉棒状杆菌的毒素)制备生物缀合物。这种体外生物缀合物疫苗制备的新方法已经证明了与现有方法相比快速、模块化和便携的疫苗成型和制备的优势。

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实施例2-无细胞糖蛋白合成平台的广泛应用性

细菌糖工程化的新兴学科使得有可能制备设计出来的聚糖和糖缀合物用作疫苗和治疗剂。在本文中，我们描述了一种新型无细胞糖蛋白合成技术，该技术将蛋白生物合成和天冬酰胺-连接的蛋白糖基化无缝地整合在一起。此技术利用了几种大肠杆菌菌株以获得选择性地富含糖基化组分的来源细胞裂解物，所述糖基化组分包括寡糖转移酶(OST)和脂质-连接的寡糖(LLO)。得到的提取物能够实现一锅法反应方案以有效地和位点特异性地糖基化靶蛋白。该平台是高度模块化的，允许使用多种不同的OST从结构上将各种各样的聚糖(包括几种细菌O-多糖)添加到许多糖蛋白治疗剂和糖缀合物疫苗载体上。下表总结了独特的糖基化组分，即大肠杆菌来源菌株、OST和LLO、以及在本发明所公开的无细胞糖蛋白合成系统中表征的糖蛋白接受体。

总结表：无细胞糖蛋白合成平台的关于OST酶、聚糖结构、接受体蛋白和细菌来源 菌株的通用性。

多种不同的寡糖转移酶(OST)可以富集在大肠杆菌裂解物内以激活无细胞蛋白糖 基化。为了我们的无细胞糖蛋白合成技术的初步开发，我们选择了被充分研究的来自革兰氏阴性细菌空肠弯曲杆菌的细菌蛋白糖基化基因座(protein glycosylation locus，pgl)作为我们的模型糖基化系统[1]。此基因簇编码天冬酰胺-连接的(N-连接的)糖基化通路，该糖基化通路在功能上类似于真核生物和古细菌的糖基化通路[2],涉及单亚基OST，即CjPglB，它催化预组装的GlcGalNAc₅Bac庚糖(其中Bac是bacillosamine)从脂质载体十一碳异戊二烯焦磷酸酯(Und-PP)全部转移到接受体蛋白内的保守基序(D/E-X_-1-N-X₊₁-S/T,其中X_-1和X₊₁是除脯氨酸以外的残基)中的天冬酰胺残基上[3]。

鉴于无细胞系统的开放性质，有可能功能性地互换和成型备选的生物化学反应组分。一种直截了当的方式是：这可以通过将单独制备的裂解物组合起来来实现，每种裂解物选择性地富集指定的酶[4,5]。作为概念验证，将单独制备的CjLLO和CjPglB裂解物混合，然后用编码scFv13-R4^DQNAT(C-末端用单个DQNAT基序修饰的抗-β-半乳糖苷酶(β-gal)单链可变片段(scFv)抗体[6])接受体的DNA激发。得到的混合物促进scFv13-R4^DQNAT的有效糖基化，如在用抗-His抗体和检测空肠弯曲杆菌聚糖的hR6血清探测免疫印迹所观察到的那样(图7a)。除了scFv13-R4^DQNAT以外，我们还表达了不同的模型接受体蛋白，该模型接受体蛋白通过将来自空肠弯曲杆菌糖蛋白AcrA(其用优化的DQNAT糖基化位点进一步修饰)的21-氨基酸序列移植到superfolder GFP的柔性环中来建立(sfGFP^217-DQNAT)。混合的裂解物反应方案能够以100％转化率糖基化sfGFP^217-DQNAT接受体蛋白(图7a)。

下一步，我们寻求证明混合的裂解物方式可以用来快速地成型四种其他细菌OST的活性。粗制裂解物自异源过表达下列细菌OST之一的大肠杆菌CLM24来源菌株单独制备：大肠弯曲杆菌PglB(CcPglB)，脱硫脱硫弧菌PglB(DdPglB)，巨大脱硫弧菌PglB(DgPglB)或普通脱硫弧菌PglB(DvPglB)。每种OST裂解物与富含CjLLO的裂解物混合，然后补充以编码sfGFP^217-DQNAT或此靶蛋白的修饰形式sfGFP^217-AQNAT的质粒DNA。在完成无细胞糖蛋白合成反应后，两种sfGFP的表达和糖基化状态通过免疫印迹分析追踪，免疫印迹分析揭示了关于这些同源酶的序列肽段偏好性的信息。例如，观察到含有CcPglB的混合的裂解物有效地糖基化sfGFP^217-DQNAT，但不糖基化sfGFP^217-AQNAT(图7b)。CcPglB的此活性谱与对CjPglB所观察到的活性谱相同，基于其与CjPglB的高序列相似性(～81％)，这并不令人奇怪[7]。相反，含有来自脱硫弧菌的OST(其与CjPglB具有低序列同一性(～15-20％))的裂解物混合物显示更宽松的序列肽段偏好性(图7b)。具体来说，富含DgPglB的提取物混合物以几乎相等的效率修饰两个(D/A)QNAT基序，而包含DdOST和DvOST的混合的裂解物偏好地糖基化AQNAT序列肽段。总之，这些结果提示各种各样的寡糖转移酶(OST)可以功能性地富集在我们的无细胞裂解物中以产生被靶向的糖蛋白。我们假设在我们的无细胞系统中使用的OST的范围可以扩大到包括源自诸如原生动物、酵母和哺乳动物的生物体的那些。

最后，我们显示了代表临床相关疫苗抗原的O-抗原多糖可以使用我们的裂解物混合方式利用多种OST酶转移到蛋白。在此，我们致力于缀合大肠杆菌O78多糖抗原(EcO78-PS)来了解抗菌疫苗的开发，因为O78株是发展中国家中旅行者腹泻的主要病因。将上文所述的富含CjPglB或CcPglB的粗制裂解物与从表达合成EcO78-PS的生物合成通路的细胞制备的LLO裂解物混合。这些裂解物混合物然后补充以编码sfGFP^217-DQNAT的质粒DNA。免疫印迹分析揭示了CjPglB和CcPglB两者均可以将EcO78-PS转移到蛋白质(图8)。这些数据指示各种各样的寡糖转移酶(OST)可以用来在我们的无细胞平台合成缀合物疫苗。我们进一步开发了此平台使得能够如下文所述按需和分散式地制备缀合物疫苗。

目前，仅空肠弯曲杆菌糖基化通路在体外被重新构建[8,9]，它仍然存在待解决的问题，即我们的系统是否可以利用不同的LLO再构造。因此，为了扩展除空肠弯曲杆菌庚糖以外的聚糖结构的范围，我们使用从携带备选的聚糖生物合成通路的大肠杆菌细胞提取的脂质-连接的寡糖供体进行了体外糖基化反应。这些包括携带下列聚糖结构的LLO：(i)天然海鸥弯曲杆菌己糖N-聚糖[10]；(ii)基于海鸥弯曲杆菌己糖N-聚糖的工程化GalNAc₅GlcNAc[11]；(iii)天然产琥珀酸沃廉菌己糖N-聚糖[12]；(iv)工程化大肠杆菌O9引物-衔接子O-PS聚糖,Man₃GlcNAc；(v)土拉热弗朗西斯菌O-PS，Qui4NFm-(GalNAcAN)₂-QuiNAc结构[13]，和(vi)真核生物三甘露醇基核心N-聚糖,Man₃GlcNAc₂[6]。观察到利用这些不同的聚糖中的每一种对scFv13-R4^DQNAT的糖基化仅在CjPglB的存在时发生(图9)。总之，这些结果证明结构上相异的聚糖，包括类似真核生物结构和O-抗原多糖的那些聚糖，可以在无细胞糖基化反应中模块化地相互更换。

以将几种聚糖结构成功地引入至无细胞糖蛋白合成平台为基础，我们将兴趣转到了一组特定的聚糖，细菌O-多糖。因为抗菌耐药性是全球不断增长的问题，加速制备新抗生素和疫苗的策略变得很必要。具体来说，由缀合到免疫原性载体蛋白的细菌O-多糖抗原构成的缀合物疫苗在预防细菌感染方面的有效性超过90％，而耐药性的发生率极低。我们假定我们可以使用我们的无细胞糖蛋白合成技术来在病原体特异的多糖的情况下制备生物缀合物疫苗候选物。作为概念验证，我们尝试利用来自革兰氏阴性病原体土拉热弗朗西斯菌土拉热亚种(A型)株Schu S4(一种兼性球杆菌和兔热病的致病因子)的O-PS结构来表达和位点特异性地糖基化sfGFP-^DQNAT。通过利用抗-His抗体和对FtO-PS特异的单克隆抗体进行免疫印迹测定糖基化活性(图10A)。当FtLLO和CjPglB裂解物混合时观察到的梯状图形指示FtLLO连接，并且该梯状图形通过Wzy聚合酶的作用由O-PS链长可变性导致。

为了证明我们的无细胞方式用于制备各种各样的缀合物疫苗的通用性和模块化，我们寻求制备针对大肠杆菌的两个致病株(即，产肠毒素的大肠杆菌O7和O78株)的疫苗。大肠杆菌O7株是尿路感染的首要病因，O78株是低收入国家中旅行者腹泻的首要病因且是腹泻病的主要病因。从表达CjPglB和大肠杆菌O78抗原或O7抗原的生物合成通路的细胞制备一锅法裂解物。通过利用抗-His抗体(图10B,C)和针对大肠杆菌O78和O7抗原的抗血清(数据未显示)的免疫印迹，包含这些裂解物的无细胞反应物对我们的sfGFP变体形成了梯状糖基化。重要的是，这些结果证明我们的整合技术用于协同的载体蛋白合成和病原体特异性O抗原连接的潜力。此外，我们的无细胞平台代表了用于从细菌O-多糖的各种各样结构快速制备和成型新的缀合物疫苗候选物的一个有吸引力的选项。

我们的充分整合的无细胞糖蛋白合成平台已经证明允许一锅法合成各种各样的N-糖蛋白。使用此系统，利用编码scFv13-R4^DQNAT或sfGFP^217-DQNAT的质粒DNA激发的反应，导致产生具有100％蛋白糖基化的被靶向的蛋白(图11a)。重要的是，通过在用于scFv的ELISA格式中结合抗原底物的能力和用于sfGFP的荧光信号测量，体外合成的scFv13-R4^DQNAT和sfGFP^217-DQNAT蛋白保留了生物学活性，其不受N-聚糖添加影响(数据未显示)。更重要的是，我们的一锅法无细胞糖基化系统在利用编码几种人促红细胞生成素(hEPO)糖变体的质粒DNA激发的反应中相似地进行，这些糖变体包括具有在残基N24(22-AENIT-26)、N38(36-NENIT-40)或N83(81-LVNSS-85)处的天然序列肽段被单独地突变为最适细菌序列肽段DQNAT的那些(图11b)。Western印迹分析揭示了每种hEPO糖变体的可清晰检测到的糖基化，对于N24和N38位点的糖基化产物为100％，对于N83位点的糖基化产物为～30–40％(图11b)。所有三种糖基化hEPO变体均保留了生物学活性，与对相应的无糖基化对应物测量的活性无法区分(数据未显示)。总起来说，这些发现证实了一锅法裂解物能够以有效地产生糖基化蛋白(包括人来源的那些蛋白)的方式共同活化蛋白合成和N-糖基化。

下一步，我们寻求将我们的无细胞系统扩展到合成模型靶标(如sfGFP)或小细胞因子糖蛋白(诸如hEPO)以外的真实糖蛋白接受体。具体来说，我们将致力于表达糖缀合物疫苗载体。在大肠杆菌中体内表达缀合物疫苗受限于在缀合物疫苗的情形中使用未得到FDA批准的载体蛋白用作蛋白佐剂。FDA-批准的载体蛋白诸如破伤风毒素或白喉毒素蛋白，还没有证明在活大肠杆菌细胞的细胞周质中与N-连接的糖基化相容。事实上，这些FDA-批准的载体已经证明难以在大肠杆菌中在体内表达，经常需要纯化和再折叠来自包涵体的不溶产物，融合表达伴侣以增加可溶物表达或表达蛋白片段来代替全长蛋白。相反，无细胞蛋白合成方式最近显示了有希望用于难以表达的蛋白[14]。我们在此所关注的载体蛋白包括非酰化的流感嗜血杆菌蛋白D(PD)、脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白(PorA)、以及和白喉棒状杆菌毒素(CRM197)和破伤风梭菌毒素(TT)的基因脱毒变体。我们还测试了TT的片段C(TTc)和轻链(TT轻链)结构域以及大肠杆菌MBP的表达。为了能够进行糖基化，所有载体在其C-末端处用最适细菌糖基化基序DQNAT的4个串联重复区修饰[15]。包含内部DQNAT糖基化位点的superfolder绿色荧光蛋白的变体(sfGFP^217-DQNAT)[16]用作模型蛋白以利于系统开发。所有8个载体在体外合成，可溶物产量为～50-650μg mL^-1，通过¹⁴C-亮氨酸掺入测定(数据未显示)。

我们下一步寻求通过利用一锅法无细胞糖基化来合并它们的体外表达来合成这些载体蛋白的缀合物形式。对于疫苗靶标，我们关注高毒力的土拉热弗朗西斯菌Schu S4株。为了利用FtO-PS糖基化蛋白，我们从表达FtO-PS的生物合成通路和CjPglB酶的糖工程化大肠杆菌细胞制备了一锅法裂解物。此裂解物含有脂质-连接的FtO-PS和有催化活性的CjPglB，其用来催化利用编码sfGFP^217-DQNAT的质粒DNA激发的反应。通过利用抗-His抗体或对FtO-PS特异的单克隆抗体进行免疫印迹观察到有效合成了用FtO-PS修饰的糖基化sfGFP^217-DQNAT(图12a)。仅在包含完整糖基化通路和优选的DQNAT糖基化序列的反应物中观察到sfGFP^217-DQNAT的糖基化(图12a)。

下一步，我们研究了在我们的无细胞反应中FDA-批准的载体是否可以相似地与FtO-PS缀合。在加入编码MBP^4xDQNAT、PD^4xDQNAT、PorA^4xDQNAT、TTc^4xDQNAT、TT轻链^4xDQNAT和CRM197^4xDQNAT的质粒DNA后，对于富含脂质-连接的FtO-PS和CjPglB的反应物观察到了利用FtO-PS对每种的糖基化，但缺少CjPglB的对照反应物观察不到(图12b)。我们观察到高分子量FtO-PS种类(大约～10-20kDa)缀合到所有被测试的蛋白载体，这是很重要的，因为较长的聚糖链长度已经显示会增加针对土拉热弗朗西斯菌的缀合物疫苗的功效[17]。总之，这些数据指示无细胞糖蛋白合成平台可以有效地合成和N-糖基化各种各样的糖蛋白治疗剂和糖缀合物载体，包括被FDA批准的那些载体。

原核生物无细胞蛋白合成已经成为用于重组蛋白制备的有前途的工具[18,19]。其中，基于大肠杆菌的裂解物，即所谓的S30裂解物，是最常用的和充分研究的裂解物来源之一[20]。然而，至今，仅有限数目的大肠杆菌菌株显示支持有效的无细胞蛋白合成，在结合蛋白翻译后修饰的无细胞蛋白合成的情形下甚至更少数目的菌株进行了研究[8,21]。为了确定各种各样的常见的实验室大肠杆菌菌株(包括i)rE.coli 705,ii)BL21(DE3)和iii)CLM24)是否可以用作底盘菌株来支持我们的整合的无细胞蛋白合成和糖基化，我们首先使用基于超声作用的稳定程序从这些菌株制备了粗制S30裂解物[22]。然后，使用这些裂解物使用改良的PANOx-SP系统[23]进行小规模分批模式连续式无细胞蛋白合成和糖基化反应[9]，所述裂解物补充了下列：(i)纯化的CjPglB催化剂；(ii)寡糖供体CjLLO[24]；和(iii)编码模型接受体蛋白scFv13-R4^DQNAT的质粒DNA[6]。在过夜反应后，在所有反应中实现了高效的糖基化，如通过在抗-His免疫印迹中被靶向的蛋白质的迁移率完全转变成单糖基化形式(g1)和通过hR6血清检测与scFv13-R4^DQNAT连接的空肠弯曲杆菌聚糖(图13)得到证明。

在使用基于大肠杆菌的生物治疗剂制备系统中的一个关键性挑战是关于脂质A或内毒素污染的问题。脂质A内毒素被toll-样受体4(TLR4)识别，导致产生促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子α和白介素-1β[25]，对抗感染需要这些促炎细胞因子，但它们在高水平时可以导致致死性感染性休克[26]。因为无细胞糖蛋白合成反应依赖于脂质相关组分，包括OST和LLO，因此涉及去除脂质A的标准脱毒方式[27]可能减弱我们的糖基化组分的活性或浓度。为了解决这个问题，我们采用了通过菌株改造来脱毒脂质A分子的策略[28,29]。具体来说，在大肠杆菌中使酰基转移酶基因lpxM缺失并过表达土拉热弗朗西斯菌磷酸酶LpxE已经显示导致产生几乎均质的五酰化的单磷酸化的脂质A，显著地减弱了毒性但保留了作为佐剂的活性[28]。为了在iVAX的情况下生成脱毒的脂质A结构，我们从共表达FtLpxE和FtO-PS糖基化通路的CLM24的ΔlpxM衍生物制备了裂解物。与表达CjPglB和FtO-PS的野生型CLM24裂解物相比，来源于此菌株的裂解物表现出显著降低的毒性水平(数据未显示)，如通过在HEK-Blue hTLR4报告细胞中的人TLR4激活来测量[29]。为了确定对来源菌株基因组再编码是否会负面地影响蛋白合成和糖基化效率，我们使用从这些改良菌株制备的S30裂解物来制备用FtO-PS修饰的糖基化sfGFP^DQNAT。在所有反应中均观察到有效的蛋白合成和N-糖基化。这些数据表明在我们的无细胞糖基化反应中对来源菌株的基因组改造，尤其是对脂质A的结构编辑不影响膜结合的CjPglB和FtO-PS组分的活性(图14)。总之，本文的结果确定在我们的无细胞系统中，各种各样的原核生物裂解物，包括几种常见的实验室大肠杆菌和基因组改造的大肠杆菌菌株，可以用来功能性地重现蛋白合成和N-糖基化。

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实施例3–床旁按需无细胞生物制造缀合物疫苗

概述

缀合物疫苗是用于预防细菌感染的最有效方法之一，代表了用于对抗耐药病原体的有前途策略。然而，如前所述，现有的制造方式因集中式生产和冷链配送要求而限制了缀合物疫苗的获得。为了解决这些限制的问题，下面描述一种用于体外生物缀合物疫苗表达(in vitro bioconjugate vaccine expression，iVAX)的模块化技术。iVAX包括来自脱毒的非致病性大肠杆菌的可便携的冻干裂解物。在再水化后，iVAX反应物在1小时内合成临床相关剂量的针对各种各样的细菌病原体的生物缀合物疫苗。本实施例显示了与使用工程化细菌制备的疫苗相比，iVAX合成的针对高毒力病原体土拉热弗朗西斯菌土拉热亚种(A型)Schu S4株的疫苗在小鼠中令人惊异地和出人意料地以显著更高的水平引发了病原体特异性抗体。iVAX平台有希望通过不依赖冷藏的配送和床旁制备利用增加的路径加速新生物缀合物疫苗的开发。

引言

耐药细菌预期到2050年每年威胁多达1000万条生命(The Review onAntimicrobial Resistance,2014),使得必须获得开发和配送抗生素和疫苗的新策略。缀合物疫苗典型地由与免疫刺激性蛋白载体连接的病原体特异性荚膜多糖(CPS)或O-抗原多糖(O-PS)组成，是用于预防威胁生命的细菌感染的最安全和最有效方法之一(Jin等人,2017；Trotter等人,2008；Weintraub,2003)。特别地，脑膜炎球菌和肺炎球菌缀合物疫苗的实施已经显著地减少了全球细菌性脑膜炎和肺炎的发生率(Novak等人,2012；Poehling等人,2006),此外还减少了靶菌株的抗生素耐药性(Roush等人,2008)。然而，尽管它们证明了安全性和有效性，缀合物疫苗的全球儿童接种率仍然低至～30％,缺少获得路径或低的免疫接种覆盖度占了剩余疾病负担的绝大多数(Wahl等人,2018)。另外，2018WHO对用于预防伤寒热的Typhbar-的资格预审是近十年来首次批准的缀合物疫苗。为了解决不断出现的耐药病原体问题，需要用于加快缀合物疫苗的开发和全球配送的新技术。

缀合物疫苗开发和配送的缓慢进展是由于下面的事实：这些分子是特别有挑战性的且制造成本昂贵。制备缀合物疫苗的常规工艺涉及载体蛋白与从致病性细菌的大规模培养物纯化的多糖抗原的化学缀合。病原体的大规模发酵因相关的生物安全性风险和工艺开发挑战而导致高的制造成本。另外，化学缀合可以改变多糖的结构，导致保护性表位的丧失(Bhushan等人,1998)。为了解决这些挑战，近年来证明多糖-蛋白质“生物缀合物”可以在大肠杆菌中使用蛋白-聚糖偶联技术(PGCT)制备(Feldman等人,2005)。以此方式，工程化大肠杆菌细胞通过由空肠弯曲杆菌寡糖转移酶PglB(CjPglB)催化的天冬酰胺-连接的糖基化反应将异源表达的CPS或O-PS抗原共价连接到载体蛋白(Cuccui等人,2013；Garcia-Quintanilla等人,2014；Ihssen等人,2010；Ma等人,2014；Marshall等人,2018；Wacker等人,2014；Wetter等人,2013)。尽管有此进展，但化学缀合和PGCT方式依赖于活的细菌细胞，要求集中式生产设施，从该生产设施疫苗通过冷藏供应链进行配送。冷藏对于避免在加热和冷冻过程中病原体特异性多糖的沉淀和大量损失而造成的缀合物疫苗变质是至关重要的(Frasch,2009；WHO,2014)。已知仅有一种缀合物疫苗，MenAfriVac^TM在冷链外保持活性达到4天，在撒哈拉以南的非洲的脑膜炎地带的免疫接种期间它使得疫苗覆盖度增加和估计50％的成本减少(Lydon等人,2014)。然而，这需要在热稳定性疫苗的开发和验证中的大量投资。广泛来说，对冷链冷藏的需求形成了经济和物流工作上的挑战，这些挑战限制了疫苗接种活动的范围并且对疾病的根除设置了障碍，尤其是在发展中国家(Ashok等人,2017；Wahl等人,2018)。

无细胞蛋白合成(CFPS)通过使用细胞裂解物而非活细胞在体外合成蛋白从而对加快疫苗开发和能够进行分散式的不依赖冷链的生物制造提供了机会(Carlson等人,2012)。重要的是，CFPS平台(i)能够进行床旁蛋白生产，因为可以在体外在仅几小时内合成相关量的蛋白，(ii)可以在环境温度进行冻干用于配送并通过仅加入水进行复配(Adiga等人,2018；Pardee等人,2016),和(iii)在受控的实验室环境外规避与使用活细胞相关的生物安全性问题。CFPS近年来已经被用来实现无糖基化蛋白疫苗的按需和便携式制备(Adiga等人,2018；Pardee等人,2016)。此外，我们最近描述了一种无细胞糖蛋白合成技术，该技术能够进行一锅法制备糖基化蛋白，包括人糖蛋白和真核生物聚糖(Jaroentomeechai等人,2018)。尽管存在这些进展，但无细胞系统和甚至分散式制造系统过去受到它们不能合成相关效价的携带各种各样聚糖结构的糖基化蛋白的限制，所述聚糖结构诸如生物缀合物疫苗制备所需要的多糖抗原(Perez等人,2016)。

为了克服这些限制，下面描述了iVAX(体外生物缀合物疫苗表达)平台，该平台能够在无细胞反应中快速开发和不依赖冷链地生物合成缀合物疫苗(图15)。iVAX被设计成具有下列特征。首先，iVAX很快速，具有在一小时内制备多个单剂量的生物缀合物的能力。第二，iVAX很稳健，在一定的操作温度范围内产生相等量的生物缀合物。第三，iVAX是模块化的，提供了快速交换载体蛋白的能力，包括在被许可的缀合物疫苗中使用的那些载体蛋白，以及缀合的多糖抗原。如本实施例中所述，此模块化被利用用来形成靶向针对各种各样细菌病原体的疫苗候选物阵列，包括高毒力土拉热弗朗西斯菌土拉热亚种(A型)Schu S4株,产肠毒素的(ETEC)大肠杆菌O78和尿道致病性(UPEC)大肠杆菌O7。第四，iVAX是保存稳定的，来源于冻干的无细胞反应物，其可以以只需添加水的策略进行操作。第五，iVAX是安全的，利用脂质A重塑，有效地避免了在非工程化大肠杆菌制造平台中存在的高内毒素水平。这些结果证明来源于冻干的、低内毒素iVAX反应的抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物在小鼠中引发病原体特异性抗体应答并且其表现超过使用已建立的PGCT方式在活细胞中制备的生物缀合物。总体来说，iVAX平台提供了一种新方式将重要类型的抗菌疫苗的保护益处传递给发达国家和发展中国家。

结果

被许可的疫苗载体蛋白的体外合成

为了证明无细胞生物缀合物疫苗制备的原理验证，体外表达一组目前在FDA批准的缀合物疫苗中使用的载体蛋白。以可溶性构象在体外制备这些载体蛋白代表了重要的基准点，因为它们在活大肠杆菌中的表达已经证明是有挑战性的，经常需要纯化和再折叠来自包涵体的不溶产物(Haghi等人,2011；Stefan等人,2011),融合表达伴侣诸如麦芽糖结合蛋白(MBP)以增加可溶物表达(Figueiredo等人,1995；Stefan等人,2011)，或表达截短的蛋白变体代替全长蛋白(Figueiredo等人,1995)。相反，无细胞蛋白合成方式最近显示了有希望用于难以表达的蛋白(Perez等人,2016)。在本文所述的体外系统中表达的载体蛋白包括非酰化的流感嗜血杆菌蛋白D(PD)、脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白(PorA)、以及白喉棒状杆菌毒素(CRM197)和破伤风梭菌毒素(TT)的基因脱毒变体。还测试了TT的片段C(TTc)和轻链(TT轻链)结构域以及大肠杆菌MBP的表达。尽管MBP不是被许可的载体，但证明它具有免疫刺激性(Fernandez等人,2007)，并且当它连接到O-PS时发现在小鼠中引起多糖-特异性体液和细胞免疫应答(Ma等人,2014)。类似地，TT结构域、TT轻链和TTc没有在被许可的疫苗中使用，但它们具有免疫刺激性并且各自足以在小鼠中保护免受破伤风梭菌攻毒(Figueiredo等人,1995)。为了能够进行糖基化，所有载体在其C-末端处用最适细菌糖基化基序DQNAT的4个串联重复区修饰(Chen等人,2007)。还包括C-末端6xHis标签使得能够进行纯化和通过Western印迹分析检测。包含内部DQNAT糖基化位点的superfolder绿色荧光蛋白的变体(sfGFP^217-DQNAT)(Jaroentomeechai等人,2018)用作模型蛋白以利于系统开发。

所有8个载体在体外合成，可溶物产量为～50-650μg mL^-1，通过¹⁴C-亮氨酸掺入测定(图16a)。具体来说，MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT变体几乎为100％可溶，产量分别为500μg mL^-1和200μg mL^-1，并且根据Western印迹分析专一地表达为全长产物(图16b)。对于所有载体在25℃、30℃和37℃观察到相似的可溶物产量，CRM197^4xDQNAT例外(图21a),后者已知是热敏感的(WHO,2014)。这些结果表明所述的无细胞载体生物合成方法在13℃的温度范围内是稳定的，并且可以在不能进行精确温度控制的场所使用。

这些无细胞反应的开放反应环境使得能够容易的操作化学品和反应环境以改善更复杂的载体的制备。例如，在膜蛋白PorA^4xDQNAT的情况下，加入脂质纳米盘以增加可溶物表达(图21b)。纳米盘提供了细胞膜拟似物从而以共同翻译的方式稳定膜蛋白的疏水区(Bayburt和Sligar,2010)。对于TT(它包含分子间二硫键)的表达，在氧化条件下表达2小时(Knapp等人,2007),改善了重链和轻链组装成全长产物并使全长TT的蛋白酶降解最小化(图21c)。体外合成的CRM197^4xDQNAT和TT^4xDQNAT在长度上与市售的纯化的白喉毒素(DT)和TT蛋白标准品相当，并且分别与α-DT和α-TT抗体反应(图21d,e)，指示两者均以免疫相关的构象产生。这是引入注目的，因为当CRM197和TT不含缀合的多糖被施用时，它们分别是FDA-批准的用于白喉和破伤风的疫苗抗原。总之，这些结果突出了CFPS在一定的温度范围内以可溶构象表达被许可的缀合物疫苗载体蛋白的能力。

生物缀合物疫苗的按需合成

下一步，这些载体蛋白的多糖-缀合形式通过利用一锅法无细胞糖基化合并它们的体外表达来合成。作为模型疫苗靶标，使用高毒力土拉热弗朗西斯菌土拉热亚种(A型)Schu S4株，其为一种革兰氏阴性兼性球菌和兔热病的致病因子。这种细菌因其高死亡率、低感染剂量和被雾化的能力而被归类为A类生物恐怖主义战剂(Oyston等人,2004)。尽管目前还没有被许可的针对土拉热弗朗西斯菌的疫苗，但几个研究已经独立地确认了针对土拉热弗朗西斯菌LPS、尤其是O-PS重复单元的抗体在提供针对Schu S4株的保护作用中的重要地位(Fulop等人,2001；Lu等人,2012)。最近，使用PGCT制备的包含与铜绿假单胞菌外毒素A(EPA^DNNNS-DQNRT)载体蛋白缀合的土拉热弗朗西斯菌Schu S4 O-PS(FtO-PS)的生物缀合物疫苗(Cuccui等人,2013；Marshall等人,2018)显示在兔热病的大鼠吸入模型中保护免受SchuS4株的攻毒(Marshall等人,2018)。鉴于这些早期发现，通过将FtO-PS结构缀合到各种各样载体蛋白测试iVAX平台按需制备抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物疫苗候选物的能力。

FtO-PS由826-Da重复四糖单元Qui4NFm-(GalNAcAN)₂-QuiNAc(Qui4NFm:4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-D-葡萄糖；GalNAcAN:2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖酰胺；QuiNAc:2-乙酰氨基-2,6-二脱氧-D-葡萄糖)构成(Prior等人,2003)。为了利用FtO-PS糖基化蛋白，从表达FtO-PS生物合成通路和寡糖转移酶CjPglB的糖工程化大肠杆菌细胞制备iVAX裂解物(图17a)。此裂解物包含脂质-连接的FtO-PS和活性CjPglB，它用来催化用编码sfGFP^217-DQNAT的质粒DNA激发的iVAX反应。利用来自缺少FtO-PS通路或CjPglB酶的细胞的裂解物进行不期望连接FtO-PS的对照反应。还测试缺少编码靶蛋白sfGFP^217-DQNAT的质粒或用编码sfGFP^{217 -ADQNAT}的质粒(其包含未被CjPglB修饰的突变的糖基化位点(AQNAT))激发的反应(Kowarik等人,2006)。在包含iVAX裂解物和用编码sfGFP^217-DQNAT的质粒激发的反应中，用抗-His抗体或对FtO-PS特异的市售单克隆抗体进行免疫印迹显示了梯状条带图形(图17b)。此梯形是FtO-PS连接的特征，通过Wzy聚合酶的作用由O-PS链长可变性造成(Cuccui等人,2013；Feldman等人,2005；Prior等人,2003)。仅在包含完整糖基化通路和优选的DQNAT糖基化序列的反应中观察到sfGFP^217-DQNAT的糖基化(图17b)。在来自同批次裂解物的生物学重复(图17c,左)和使用不同批次裂解物(图17c,右)之间此糖基化谱是可再现的。在1小时后观察到体外蛋白合成和糖基化，缀合的多糖的量在0.75-1.25小时达到最大(图22)。在37℃、30℃、25℃和室温(～21℃)观察到相似的糖基化反应动力学，表明iVAX反应在一定的温度范围内是稳健的(图22)。

下一步，确定在iVAX反应中FDA-批准的载体是否可以类似地与FtO-PS缀合。在加入编码MBP^4xDQNAT、PD^4xDQNAT、PorA^4xDQNAT、TTc^4xDQNAT、TT轻链^4xDQNAT和CRM197^4xDQNAT的质粒后，对于富含脂质-连接的FtO-PS和CjPglB的iVAX反应观察到FtO-PS对每个的糖基化，但缺少CjPglB的对照反应则观察不到(图18)。观察到高分子量FtO-PS种类(大约～10-20kDa)缀合到所有被测试的蛋白载体，这是很重要的，因为较长的聚糖链长已经显示增加针对土拉热弗朗西斯菌的缀合物疫苗的功效(Stefanetti等人,2019)。值得注意的是，使用已建立的PGCT方式在活大肠杆菌中合成相同组的生物缀合物的尝试得到了不太满意的结果。具体来说，观察到与其iVAX-衍生的对应物相比，对于所有PGCT-衍生的生物缀合物，FtO-PS糖基化水平较低，且缀合的FtO-PS种类的分子量较低(图23)。对于涉及最常见的PGCT载体蛋白EPA^DNNNS-DQNRT的PGCT-相比iVAX-衍生的生物缀合物观察到相同的趋势(Cuccui等人,2013；Ihssen等人,2010；Marshall等人,2018；Wacker等人,2014；Wetter等人,2013)(图18；图23)。另外，在体内仅实现PorA膜蛋白的有限表达(图23)。总的来说，这些数据显示对于生物缀合物疫苗候选物的制备，相对于PGCT，iVAX提供了的优势，其将高分子量O-PS抗原有效地缀合到各种各样的潜在膜结合的载体蛋白。

下一步，确定使用iVAX制备的生物缀合物的产量是否足以允许产生相关的疫苗剂量。近年来的临床数据显示1-10μg剂量的生物缀合物疫苗候选物是可充分耐受的且有效地刺激产生抗菌IgG(Hatz等人,2015；Huttner等人,2017；Riddle等人,2016)。为了评估表达效价和用于进一步实验，测试MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT，因为这些载体在体外以很高的可溶性效价表达，并且没有截短产物(图16)。发现持续～1小时的反应产生～20μg mL^-1的糖基化MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT，通过¹⁴C-亮氨酸掺入和密度测定分析测定(图24a)。应当注意的是疫苗目前在包含1-20剂疫苗的小瓶中配送以使损耗最小化(Humphreys,2011)。因此，这些产量结果表明可以在1小时内使用iVAX平台合成每mL多个剂量。

为了证明iVAX方式用于生物缀合物制备的模块化，制备携带来自其他病原体的O-PS抗原的生物缀合物，所述病原体包括ETEC大肠杆菌O78株和UPEC大肠杆菌O7株。大肠杆菌O78株是发展中国家中腹泻病的主要病因，尤其是在儿童中，是旅行者腹泻的首要病因(Qadri等人,2005),而O7株是尿路感染的常见病因(Johnson,1991)。像FtO-PS一样，以前已经记载了EcO78-PS和EcO7-PS的生物合成通路并且确认这些生物合成通路分别产生具有重复单元GlcNAc₂Man₂(Jansson等人,1987)和Qui4NAcMan(Rha)GalGlcNAc(L’vov等人,1984)(GlcNAc:N-乙酰葡糖胺；Man:甘露糖；Qui4NAc:4-乙酰氨基-4,6-二脱氧-D-吡喃葡萄糖；Rha:鼠李糖；Gal:半乳糖)的O-PS抗原。在用PD^4xDQNAT或sfGFP^217-DQNAT质粒激发的反应中使用来自表达CjPglB以及EcO78-PS和EcO7-PS通路中任一个的细胞的iVAX裂解物，仅当脂质-连接的O-PS和CjPglB两者存在于反应中时观察到载体糖基化(图24b,c)。这些结果证明了通过多个异源O-PS通路与体外载体蛋白合成和糖基化的相容性使得能够模块化地制备针对多种细菌病原体的生物缀合物。

内毒素编辑和冻干产生安全和便携的iVAX反应

在使用任何基于大肠杆菌的系统用于生物药品制备时固有的一个关键性挑战是脂质A或内毒素的存在，已知它们污染蛋白产物并且可以在高水平时导致致死性感染性休克(Russell,2006)。因此，在配制的生物药品中内毒素的含量受到美国药典(USP)、美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMEA)的规定约束(Brito和Singh,2011)。因为iVAX反应依赖于脂质缔合的组分，诸如CjPglB和FtO-PS，涉及去除脂质A的标准脱毒方式(Petsch和Anspach,2000)可能减弱糖基化组分的活性或浓度，此外还增加成本和工艺复杂性。

为了解决此问题，测试了先前报道的通过菌株改造脱毒脂质A分子的策略(Chen等人,2016；Needham等人,2013)。具体地，在大肠杆菌中使酰基转移酶基因lpxM缺失并过表达土拉热弗朗西斯菌磷酸酶LpxE已经显示导致产生几乎均质的五酰化的单磷酸化的脂质A，显著地减弱了毒性但保留了作为佐剂的活性(Chen等人,2016)。此五酰化的单磷酸化的脂质A在结构上与来自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595的单磷酰脂质A(MPL)的基本组分相同，MPL是一种由单磷酸化脂质的混合物构成的批准的佐剂(Casella和Mitchell,2008)。为了在iVAX的情况下生成脱毒的脂质A结构，从共表达FtLpxE和FtO-PS糖基化通路的CLM24的ΔlpxM衍生物制备了裂解物(图19a)。与表达CjPglB和FtO-PS的野生型CLM24裂解物相比，来源于此菌株的裂解物表现出显著降低的毒性水平(图19b)，如通过在HEK-Blue hTLR4报告细胞中的人TLR4激活来测量的(Needham等人,2013)。重要的是，在iVAX反应中脂质A的结构重塑不影响膜结合的CjPglB和FtO-PS组分的活性(图25a)。通过改造用于裂解物制备的底盘菌株，制备的iVAX裂解物的内毒素水平<1,000EU mL^-1，在市售的基于蛋白质的疫苗产品的报道值范围内(0.288-180,000EU mL^-1)(Brito和Singh,2011)。

传统缀合物疫苗的一个主要限制在于它们必须被冷藏(WHO,2014)，使得难以将这些疫苗配送到偏远或资源受限的场所。冻干的iVAX反应物的环境温度储存和配送的能力可以减轻与现有疫苗所要求的与冷藏供应链相关的物流工作挑战。为了研究这种可能性，使用脱毒的iVAX裂解物以两种方式制备FtO-PS生物缀合物：在用编码sfGFP^217-DQNAT靶蛋白的质粒激发后立即运行反应或在相同的反应混合物被冻干和再水化后运行(图19c)。在两种情况下，当存在CjPglB时观察到FtO-PS与sfGFP^217-DQNAT的缀合，修饰水平几乎相同(图19d)。另外，脱毒的冻干的iVAX反应物放大到5mL以批次间可再现的方式制备FtO-PS-缀合的MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT，与没有冻干的产量无差别(图25b,c)。无需专门设备冻干iVAX反应物和制造生物缀合物的能力突出了便携式按需制备疫苗的潜力。

体外合成的生物缀合物在小鼠中产生病原体特异性抗体

为了验证使用iVAX平台制备的生物缀合物的功效，测试了iVAX-衍生的生物缀合物在小鼠中产生抗-FtLPS抗体的能力(图20a)。发现接受iVAX-衍生的FtO-PS-缀合的MBP^4xDQNAT或PD^4xDQNAT的BALB/c小鼠产生较高效价的FtLPS-特异性IgG抗体，与在接受PBS或每种载体蛋白的无糖基化形式的对照小鼠的血清中测量的效价相比显著增加(图20b,图26)。在来自接受来源于PGCT的糖基化MBP^4xDQNAT的小鼠的血清中测量的IgG效价与在对照组中观察到的效价相似(图20b,图26),与此候选物相对于其来源于iVAX的对应物显著较弱的糖基化一致(图23)。使用iVAX制备的两种MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT生物缀合物引起相似水平的IgG产生，并且没有一个在小鼠中导致任何可观察到的不良事件，证实了该技术用于制备生物缀合物疫苗候选物的模块化和安全性。

IgG效价通过分析IgG1和IgG2a亚型来表征，发现相对于所有对照组以及衍生自PGCT的糖基化MBP^4xDQNAT，两种iVAX-衍生的FtO-PS-缀合的MBP^4xDQNAT和PD^4xDQNAT将IgG1抗体的产生强化了>2个数量级(图20c)。此分析还揭示了两种iVAX-衍生的生物缀合物引发了强烈的Th2-偏向的(IgG1>>IgG2a)应答，这是大多数缀合物疫苗的特征(Bogaert等人,2004)。总之，这些结果提供证据表明iVAX平台供应了能够引发强烈的病原体特异性体液免疫应答并且再现了Th2偏向性(这是被许可的缀合物疫苗的特征)的疫苗候选物。

讨论

在本实施例中，已经确定iVAX是一种用于便携式的按需制备生物缀合物疫苗的无细胞平台。显示iVAX反应物可以被脱毒以确保生物缀合物疫苗产品的安全性，被冻干用于不依赖冷链的配送，和通过简单地添加水再活化用于高产量的生物缀合物制备。作为模型疫苗候选物，显示从冻干的内毒素编辑的iVAX反应物衍生的抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物在小鼠中产生病原体特异性IgG抗体作为Th2-偏向的免疫应答(是被许可的缀合物疫苗的特征)的一部分。

iVAX平台包括几个新特征。首先，iVAX是模块化的，这在本文中通过下列物质的互换证明：(i)载体蛋白，包括在被许可的缀合物疫苗中使用的那些，和(ii)来自土拉热弗朗西斯菌土拉热亚种(A型)Schu S4、ETEC大肠杆菌O78和UPEC大肠杆菌O7的细菌O-PS抗原。这代表寡糖转移酶-介导的O-PS缀合至真实的FDA-批准的载体蛋白的首次证明，可能是由于与被许可的载体在活大肠杆菌中的表达相关的历史性挑战(Figueiredo等人,1995；Haghi等人,2011；Stefan等人,2011)。鉴于在致病性细菌的基因组中常常观察到的多糖生物合成基因的簇集，在iVAX中使用的O-PS通路的进一步扩增应该是可能的(Raetz和Whitfield,2002)。此特征可以使iVAX成为响应于疾病爆发或针对不断出现的耐药细菌快速地从头开发生物缀合物疫苗候选物的一个有吸引力的选项。

第二，iVAX反应物是廉价的，成本为～$12mL^-1(图27,表1)，具有在1个小时内合成～20μg生物缀合物mL^-1的能力(图24a)。假设10μg的剂量大小，iVAX反应物可以产生～$6的疫苗剂量。作为对比，缀合物疫苗的每剂CDC成本为流感嗜血杆菌疫苗的～$9.50到脑膜炎球菌疫苗和肺炎球菌疫苗Prevnar 的分别～$75和～$118(CDC,2019)。

第三，显示了iVAX-衍生的生物缀合物在引发FtLPS-特异性IgG方面比使用PGCT从活大肠杆菌细胞得到的生物缀合物显著更有效(图20)。不希望受理论限制，对此增加的有效性的一种可能解释是与PGCT衍生的其对应物相比，对体外表达的生物缀合物观察到的更广泛的糖基化，具有更大的碳水化合物载量和被更高分子量FtO-PS种类修饰。在使用PGCT制备的生物缀合物上观察到的高分子量O-PS种类的存在减少可能是因在体内O-抗原聚合酶Wzy和PglB之间的竞争所致。相反，本公开的体外方式将O-PS合成(在体内这在裂解物产生之前发生)与糖基化(这在体外作为iVAX反应的一部分发生)分开。这些结果与之前对PGCT-衍生的抗-土拉热弗朗西斯菌生物缀合物的报道一致，该报道显示增加生物缀合物中缀合的FtO-PS与蛋白的比率在兔热病的大鼠吸入模型中导致针对土拉热弗朗西斯菌SchuS4的保护作用增强(Marshall等人,2018)。另外，最近的研究显示与利用低分子量(25kDa)多糖制备的缀合物相比，利用与TT偶联的高分子量(80kDa)FtO-PS制备的缀合物疫苗赋予了针对利用土拉热弗朗西斯菌活疫苗株的鼻内攻毒的更好保护作用(Stefanetti等人,2019)。

通过实现生物缀合物疫苗的便携式制备，iVAX解决了无细胞和分散式生物制造技术中的关键缺陷。糖基化产品的制备在基于细胞的分散式生物制造平台和使用大肠杆菌裂解物的现有无细胞平台中还没有得到证明(Crowell等人,2018；Perez-Pinera等人,2016)，它们缺少合成糖蛋白的能力(Boles等人,2017；Murphy等人,2019；Pardee等人,2016；Salehi等人,2016)。尽管已经在基于冻干的中国仓鼠卵巢细胞裂解物的无细胞生物制造平台中制备了糖基化人促红细胞生成素(Adiga等人,2018)，但这种和绝大多数其他真核生物无细胞和基于细胞的系统依赖于内源性蛋白糖基化机制。因此，这些表达平台对产生的聚糖结构或基础的糖基化反应提供很少的控制，经常需要大量的优化来实现可接受的糖基化谱(Adiga等人,2018)。相反，通过来源于缺少内源性蛋白糖基化通路的大肠杆菌的裂解物实现了iVAX平台，允许自下而上地改造期望的糖基化活性(Jaroentomeechai等人,2018)。在iVAX中改造期望的糖基化活性的能力独特地使得能够床旁制备重要类型的抗菌疫苗。

iVAX提供了一种用于快速开发和便携的按需生物制造生物缀合物疫苗的新方式。iVAX平台减轻了冷链要求，可以提高药物向具有有限基础设施的区域的投送并且尽量减小因变质引起的疫苗损失。另外，快速地在体外制备疫苗候选物的能力提供了一种用于快速响应病原体爆发和紧急威胁的独特手段。

实验模型和受试者详情

细菌

大肠杆菌菌株在Luria Bertani(LB)、LB-Lennox或2xYTP培养基中在摇床中在30-37℃生长，如在下面方法细节章节中所规定的那样。大肠杆菌NEB 5-α(NEB)用于质粒克隆和纯化。大肠杆菌CLM24或CLM24ΔlpxM菌株用于制备无细胞裂解物。大肠杆菌CLM24用作使用PGCT在体内表达生物缀合物的底盘菌。CLM24是W3110的糖优化衍生物，其携带有编码WaaL连接酶的基因中的缺失，有助于预组装的聚糖在十一碳异戊二烯二磷酸盐上的积累(Feldman等人,2005)。CLM24ΔlpxM具有内源性酰基转移酶缺失并且充当制备脱毒的无细胞裂解物的底盘菌株。

人细胞培养

根据生产厂商的说明书，HEK-Blue hTLR4细胞(Invivogen)在补充有10％胎牛血清、50U mL^-1青霉素、50mg mL^-1链霉素和100μg mL^-1Normacin^TM的高葡萄糖/L-谷氨酰胺的DMEM培养基中在湿化的孵箱中利用5％CO₂在37℃培养。

小鼠

获自Harlan Sprague Dawley的6周龄雌性BALB/c小鼠随机分配到实验组。将小鼠按照3-5只动物的组圈养，每周更换笼子一次。每天观察所有动物的行为和体格健康，诸如损伤的可见体征和异常的理毛习惯。在每次注射后还观察小鼠24和48小时，没有报告的异常反应。在康奈尔大学在由国际实验动物评估和认可委员会认可的设施中进行此研究。所有程序遵循相关的大学、州和联邦宪章(包括动物福利法案，美国公共卫生署人道管理和使用实验动物政策，纽约州卫生法第5条、第504节和康奈尔大学政策1.4)根据康奈尔大学实验动物使用和护理委员会批准的实验方案2012-0132完成。

方法详情

构建CLM24ΔlpxM菌株

使用Datsenko-Wanner基因敲除法生成大肠杆菌CLM24ΔlpxM(Datsenko和Wanner,2000)。简言之，利用编码λred系统的pKD46质粒转化CLM24细胞。转化体在含有50μgmL^-1羧苄青霉素的25mL LB-Lennox培养基(10g L^-1胰蛋白胨,5g L^-1酵母提取物和5g L^{- 1}NaCl)中在30℃生长到OD₆₀₀为0.5-0.7，收获并用25mL冰冷的10％甘油洗涤三次以使它们成为电感受态，并重新悬浮在终体积为100μL的10％甘油中。平行地，利用与lpxM同源的正向和反向引物通过PCR扩增来自pKD4的卡那霉素抗性盒生成lpxM敲除盒。用400ng lpxM敲除盒转化电感受态细胞并接种在含30μg mL^-1卡那霉素的LB琼脂平板上用于选择抗性菌落。平板在37℃生长以使pKD46质粒的细胞恢复。在卡那霉素上生长的集落通过菌落pCR和DNA测序确认已获得了所述敲除盒。然后用pCP20转化这些经确认的菌落通过Flp-FRT重组以去除卡那霉素抗性基因。将转化体接种在含50μg mL^-1羧苄青霉素的LB琼脂平板上。在选择后，菌落在液体培养中在42℃生长以使pCP20质粒的细胞恢复。通过菌落PCR和DNA测序确认菌落已经丧失了lpxM和敲除盒两者并通过在含50μg mL^-1羧苄青霉素或卡那霉素的LB琼脂平板上的影印接种确认已经丧失了卡那霉素和羧苄青霉素两种抗性。用于构建和验证此菌株的所有引物在图28，表2中列举。

在研究中使用的所有质粒在图29，表3中列举。通过PCR扩增生成质粒pJL1-MBP^4xDQNAT、pJL1-PD^4xDQNAT、pJL1-PorA^4xDQNAT、pJL1-TTc4xDQNAT、pJL1-TTlight4xDQNAT、pJL1-CRM1974xDQNAT和pJL1-TT^4xDQNAT，随后在pJL1载体的NdeI和SalI限制性位点之间对购自IDT的经密码子优化的基因构建体与C-末端4xDQNAT-6xHis标签进行Gibson组装(Fisher等人,2011)。使用相同的方式构建质粒pJL1-EPA^DNNNS-DQNRT，但不加入C-末端4xDQNAT-6xHis标签。通过对每个载体蛋白基因的PCR扩增形成质粒pTrc99s-ssDsbA-MBP^4xDQNAT、pTrc99s-ssDsbA-PD^4xDQNAT、pTrc99s-ssDsbA-PorA^4xDQNAT、pTrc99s-ssDsbA-TTc^4xDQNAT、pTrc99s-ssDsbA-TT轻链^4xDQNAT和pTrc99s-ssDsbA-EPA^DNNNS-DQNRT，并通过Gibson组装插入到pTrc99s载体的NcoI和HindIII限制性位点之间。使用类似的方式构建质粒pSF-CjPglB-LpxE，但将来自pE的lpxE基因(Needham等人,2013)插入在pSF载体中的NdeI和NsiI限制性位点之间。使用高保真DNA聚合酶(NEB)利用使用Assembly Tool(nebuilder.neb.com)设计并购自IDT的正向引物和反向引物通过PCR扩增插入物。使用限制性酶NdeI和(NEB)消化pJL1载体(Addgene 69496)。使用NdeI和NotI(NEB)限制性酶消化pSF载体。使用EZNA凝胶提取试剂盒(Omega Bio-Tek)凝胶提取PCR产物，与Gibson组装试剂混合并在50℃孵育1小时。将来自Gibson组装反应的质粒DNA转化到大肠杆菌NEB 5-α细胞中并使用50μg ml^-1卡那霉素(Sigma)选择环化的构建体。使用EZNA质粒Midi试剂盒(Omega Bio-Tek)纯化经序列验证的菌落用于CFPS和iVAX反应。

无细胞裂解物制备

大肠杆菌CLM24来源菌株在2xYTP培养基(10g/L酵母提取物,16g/L胰蛋白胨,5g/LNaCl,7g/L K₂HPO₄,3g/L KH₂PO₄,pH 7.2)在摇瓶(1L规模)或Sartorius Stedim BIOSTATCplus生物反应器(10L规模)在37℃生长。在小规模和大规模两种规模下在不同批次的裂解物间蛋白合成产量和糖基化活性是可再现的。为了生成富含CjPglB的裂解物，携带质粒pSF-CjPglB的CLM24细胞(Ollis等人,2015)用作来源菌株。为了生成富含FtO-PS的裂解物，携带质粒pGAB2的CLM24(Cuccui等人,2013)用作来源菌株。为了生成含有CjPglB和FtO-PS、EcO78-PS或EcO7-PS两者的一锅法裂解物，携带pSF-CjPglB和下列细菌O-PS生物合成通路质粒之一的CLM24用作来源菌株：pGAB2(FtO-PS)，pMW07-O78(EcO78-PS)和pJHCV32(EcO7-PS)。在0.8-1.0的OD₆₀₀利用0.02％(w/v)L-阿拉伯糖诱导CjPglB表达，并将培养物移到30℃。细胞生长至～3.0的最终OD₆₀₀，在该点通过在4℃以5,000xg离心15min将细胞沉淀。然后用冷S30缓冲液(10mM Tris-乙酸盐pH 8.2,14mM乙酸镁,60mM乙酸钾)洗涤细胞沉淀物，并在4℃以5000xg离心10min沉淀。在最后一次洗涤后，细胞在4℃以7000xg离心10min沉淀，称重，在液氮中速冻，并保存在-80℃。为了制备细胞裂解物，以1mL S30缓冲液/1g湿细胞质量将细胞沉淀物重悬至均质。通过Avestin EmulsiFlex-B15(1L规模)或EmulsiFlex-C3(10L规模)高压匀浆器在20,000-25,000psi经过单通道将细胞破坏。然后将裂解物在30,000×g离心30min两次以去除细胞碎片。将上清液转移到清洁的微量离心管并在37℃以250rpm振摇60min。在4℃离心(15,000xg)15min后，收集上清液，等分分装，在液氮中速冻，并保存在-80℃。约3次冷冻-解冻循环后S30裂解物是有活性的，并且通过Bradford测定包含～40g/L总蛋白。

无细胞蛋白合成

CFPS反应在1.5mL微量离心管(15μL规模)、15mL锥形管(1mL规模)或50mL锥形管(5mL规模)中利用改良的PANOx-SP系统(Jewett和Swartz,2004)进行。CFPS反应混合物由下列组分组成：1.2mM ATP；0.85mM GTP、UTP和CTP中的每种；34.0μg mL^-1L-5-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸(亚叶酸)；170.0μg mL^-1的大肠杆菌tRNA混合物；130mM谷氨酸钾；10mM谷氨酸铵；12mM谷氨酸镁；2mM 20种氨基酸中的每种；0.4mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；0.27mM辅酶-A(CoA)；1.5mM亚精胺；1mM腐胺；4mM草酸钠；33mM磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)；57mMHEPES；13.3μg mL^-1质粒；和27％v/v的细胞裂解物。对于≥1mL的反应体积，以6.67μg mL^-1加入质粒，因为此较低的质粒浓度节省了试剂，对蛋白合成产量或动力学没有影响。为了表达PorA，向反应物补充1μg mL^-1的纳米盘，纳米盘如前所述制备(Schoborg等人,2017)或购买(Cube Biotech)。对于CRM197^4xDQNAT的表达，CFPS在25℃进行20小时，除非另外说明。对于所有其他载体蛋白，CFPS在30℃运行20小时，除非另外说明。

对于TT^4xDQNAT(其含有分子间二硫键)的表达，CFPS在氧化条件下进行。对于氧化条件，用750μM碘乙酰胺在室温预先平衡裂解物30min以共价结合游离的巯基(-SH)，反应混合物补充以4:1比率的氧化和还原形式的200mM谷胱甘肽和10μM重组大肠杆菌DsbC(Knapp等人,2007)。

体外生物缀合物疫苗表达(iVAX)

为了在粗制裂解物中体外表达和糖基化载体蛋白，实施两阶段方案。在第一阶段中，如上所述CFPS在25-30℃进行15min。在第二阶段，通过加入分别为25mM和0.1％(w/v)的终浓度的MnCl₂和DDM启动蛋白糖基化，并在30℃继续进行1小时的总反应时间。在小规模和大规模两种规模下在iVAX反应的生物学重复间蛋白合成产量和糖基化活性是可再现的。然后反应物在20,000xg离心10min以去除不溶的或聚集的蛋白产物，通过SDS-PAGE和Western分析上清液。

根据生产厂商的实验方案使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化来自iVAX反应的无糖基化和糖基化载体。简言之，0.5mL Ni-NTA琼脂糖/1mL无细胞反应混合物在含有10mM咪唑的缓冲液1(300mM NaCl 50mM NaH₂PO₄)中平衡。将来自iVAX反应的可溶性级分上样至Ni-NTA琼脂糖并在4℃孵育2-4小时以结合带6xHis-标签的蛋白。在孵育后，将无细胞反应物/琼脂糖混合物上样至聚丙烯柱(BioRad)并用6柱体积的含20mM咪唑的缓冲液1洗涤2次。蛋白在4个级分中洗脱，各个级分用0.3mL含300mM咪唑的缓冲液1/mL无细胞反应混合物洗脱。所有缓冲液在4℃使用并保存在4℃。蛋白以1-2mg mL^-1的终浓度在4℃保存在无菌1xPBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,1.8mM KH₂PO₄,pH 7.4)中。

使用蛋白聚糖偶联技术(PGCT)体内表达生物缀合物

将编码前面有用于易位至细胞周质的DsbA前导序列的生物缀合物载体蛋白基因的质粒转化到携带pGAB2和pSF-CjPglB的CLM24细胞中。仅携带pGAB2的CLM24用作阴性对照。经转化的细胞在5mL LB培养基(10g L^-1酵母提取物,5g L^-1胰蛋白胨,5g L^-1NaCl)中在37℃生长过夜。第二天，将细胞传代至100mL LB中并使其在37℃生长6小时，之后向培养物中补充0.2％阿拉伯糖和0.5mM IPTG以分别诱导CjPglB和生物缀合物载体蛋白的表达。然后在30℃进行蛋白表达16小时，在该点收获细胞。将细胞沉淀物重悬于1mL无菌PBS(137mMNaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,1.8mM KH₂PO₄,pH 7.4)并使用Q125超声波均质器(Qsonica,Newtown,CT)以40％幅度以10秒开/10秒关的周期裂解总计5min。在4℃以15,000rpm离心30min后分离可溶性级分。根据生产厂商的实验方案使用Ni-NTA离心柱(Qiagen)从可溶性级分纯化蛋白。

Western印迹分析

样品在4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上泳动。在电泳分离后，根据生产厂商的实验方案将蛋白从凝胶上转移至Immobilon-P聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45μm)上。用PBS(80g L^-1NaCl,0.2g L^-1KCl,1.44g L^-1Na₂HPO₄,0.24g L^-1KH₂PO₄,pH 7.4)洗涤膜，接着在封闭缓冲液(LI-COR)中孵育1小时。封闭后，用PBST(80g L^-1NaCl,0.2gL^-1KCl,1.44g L^-1Na₂HPO₄,0.24g L^-1KH₂PO₄,1mL L^-1Tween-20,pH 7.4)洗涤膜6次，每次洗涤之间孵育5分钟。对于iVAX样品，用抗-6xHis标签抗体和抗-O-PS抗体或对目的O抗原特异的抗血清(如果能商购的话)两者探测膜。对膜的探测进行至少1小时，并在室温震荡，之后以如上所述的相同方式用PBST洗涤膜，并用荧光标记的二抗探测。使用Fc成像系统(LI-COR)对膜成像。CRM197和TT产量与市售的DT和TT标准品(Sigma)相比较，并通过相同的SDS-PAGE程序进行正交检测，接着分别利用识别白喉毒素或破伤风毒素的多克隆抗体进行Western印迹分析。使用的所有抗体和稀释度列举在图30，表4中。

TLR4活化测定

HEK-Blue hTLR4细胞(Invivogen)在补充了10％胎牛血清、50U mL^-1青霉素、50mgmL^-1链霉素和100μg mL^-1Normacin^TM的高葡萄糖/L-谷氨酰胺DMEM培养基中在37℃在含有5％CO₂的湿化孵箱中维持。在达到～50-80％汇合后，将细胞以1.4×10⁵个细胞/mL的密度接种在96孔板中的HEK-Blue检测培养基(Invivogen)中。以下列的浓度加入抗原：100ngμL^-1纯化的蛋白；和100ngμL^-1裂解物中的总蛋白。将纯化的大肠杆菌O55:B5 LPS(Sigma-Aldrich)和脱毒的大肠杆菌O55:B5(Sigma-Aldrich)以1.0ng mL^-1加入并分别充当阳性对照和阴性对照。将平板在37℃,5％CO₂孵育10–16h，然后测量在620nm的吸光度。使用配对t-检验确定统计学显著性。

小鼠免疫

向6组6周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley)皮下注射单独100μL PBS(pH 7.4)或含纯化的无糖基化MBP、FtO-PS-缀合的MBP、无糖基化PD或FtO-PS-缀合的PD的100μL PBS(pH 7.4),如前所述(Chen等人,2010)。各组由6只小鼠组成，PBS对照组除外，该组由5只小鼠组成。每个制剂中抗原的量标准化为7.5μg以确保在每种情况下施用等量的无糖基化蛋白或生物缀合物。在PBS中配制的纯化蛋白组与等体积的不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)在注射前混合。在免疫前，用于每组的材料(5μL)一条条涂到LB琼脂平板上，并在37℃生长过夜以确认无菌性并通过TLR4活化测定测量内毒素活性。用相同剂量的抗原在初次免疫后21天和42天对每组小鼠进行加强免疫。在第-1、21、35、49和63天通过下颌下采集获得血液，在研究结束时在第70天通过心脏穿刺获得血液。在每次注射后观察小鼠24和48小时以观察行为和体格健康变化，没有报告的异常反应。此研究和所有程序均根据由康奈尔大学实验动物使用和护理委员会批准的实验方案2012-0132完成。

酶联免疫吸附测定

通过间接ELISA使用以前记载的实验方案(Chen等人,2010)的改良版本测量由免疫小鼠产生的土拉热弗朗西斯菌LPS-特异性抗体。简言之，在以5000xg离心10min后从采集的抽血中分离血清并保存于-20℃；96孔板(Maxisorp；Nunc Nalgene)用在PBS中的5μg mL^-1浓度的土拉热弗朗西斯菌LPS(BEI resources)包被并在4℃孵育过夜。第二天，用PBST(PBS,0.05％Tween-20,0.3％BSA)洗涤平板三次，并用在PBS中的5％脱脂奶粉(Carnation)在4℃封闭平板过夜。将样品一式三份地在封闭缓冲液中以1:100-1:12,800,000连续地两倍稀释并加入至平板中在37℃持续2小时。用PBST洗涤平板三次，并在下列HRP-缀合的抗体(均获自Abcam并以1:25,000稀释度使用)之一的存在下在37℃孵育1小时：山羊抗小鼠IgG,抗小鼠IgG1和抗小鼠IgG2a。在利用PBST另外洗涤三次后，加入3,3’-5,5’-四甲基联苯胺底物(1-步Ultra TMB-ELISA；Thermo-Fisher)，平板在室温在暗处孵育30min。用2MH₂SO₄终止反应，通过微量滴定板分光光度计(Tecan)以450nm的波长定量吸光度。通过测量产生在无血清背景对照以上3SD信号的最低稀释度确定血清抗体效价。使用单因素ANOVA和Tukey–Kramer事后真实显著性差异检验在RStudio 1.1.463中确定统计学显著性。

定量和统计学分析

无细胞蛋白合成产量的定量

为了定量在iVAX反应中合成的蛋白的量，使用了两种方式。使用先前报道的标准曲线(Hong等人,2014)将sfGFP的荧光单位转换成浓度。所有其他蛋白的产量通过向CFPS混合物中添加10μM L-¹⁴C-亮氨酸(11.1GBq mmol^-1,PerkinElmer)以产生三氯乙酸-可沉淀物放射性(如前所述使用液体闪烁计数仪测量放射性(Kim和Swartz,2001))来评估。

统计学分析

在附图和相应的图例中报告了各种统计学参数，包括n、p-值、标准差和标准误的定义和数值。在对应的方法详情章节描述了分析技术。

数据和软件可用性

在本研究中使用的所有质粒构建体(包括完整的DNA序列)均保藏于Addgene(构建体128389-128404)。

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实施例3-iVAX-衍生的疫苗保护免受致死性土拉热弗朗西斯菌攻毒

几组5只BALB/c小鼠用PBS或7.5μg纯化的无细胞合成的无糖基化MBP^4xDQNAT、PD^4xDQNAT、或EPA^DNNNS-DQNRT、或FtO-PS-缀合的MBP^4xDQNAT、PD^4xDQNAT、或EPA^DNNNS-DQNRT经腹膜内免疫。在活大肠杆菌细胞中使用PCGT制备的FtO-PS-缀合的MBP^4xDQNAT、PD^4xDQNAT和EPA^DNNNS-DQNRT用作阳性对照。小鼠在第21天和第42天用相同剂量的抗原加强免疫。在第66天，小鼠用6000cfu(鼻内LD₅₀的50倍)土拉热弗朗西斯菌holarctica亚种活疫苗株Rocky MountainLaboratories经鼻内攻毒，并另外监测存活率25天(图31a)。显示了用(图31b)MBP^4xDQNAT(图31c)PD^4xDQNAT和(图31d)EPA^DNNNS-DQNRT作为载体蛋白免疫的Kaplan-Meier曲线。这些结果显示iVAX-衍生的疫苗保护小鼠免受致死性病原体攻毒，与使用现有技术PGCT方式合成的疫苗一样有效。(*p＝0.0476；**p＝0.0079,费希尔精确检验；ns:不显著)。

在前面的描述中，对于本领域技术人员来说很明显的是在不背离本发明的范围和精神的前提下，可以对本文公开的发明做出各种替代和修改。本文中举例说明的发明可以在缺少在本文中没有具体公开的任一个或多个要素、任一种或多种限制的情况下合适地实施。已经采用的术语和表述用作描述性的术语而非限制，不意欲在此类术语和表述的使用中排除所显示和描述的特征或其部分的任何等效形式，而是要认识到各种修改方式均可能包括在本发明的范围内。因此，应当理解尽管本发明通过具体的实施方案和任选的特征进行了举例说明，但本文公开的概念的修改和/或变化形式可以由本领域技术人员做出，并且此类修改和变化形式被认为在本发明的范围内。

本文中引用了许多专利和非专利参考文献。被引用的参考文献的全部内容通过引用并入本文。在说明书中术语的定义与引用的参考文献中的该术语定义不一致的情况下，该术语应当基于本说明书中的定义进行解释。

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atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser

1 5 10 15

Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile

20 25 30

Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp

50 55 60

Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro

65 70 75 80

Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe

85 90 95

Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg

100 105 110

Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe

115 120 125

Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro

130 135 140

Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala

145 150 155 160

Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly

165 170 175

Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile

195 200 205

Ala Gln Gly Leu Glu Ser Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Met Asp Ser Leu

210 215 220

Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met

225 230 235 240

Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln

245 250 255

Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile

260 265 270

Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Ile Val Val

275 280 285

Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile

290 295 300

Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu

305 310 315 320

Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu

325 330 335

Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu

340 345 350

Ala Ala Lys Lys His Ser Leu Leu Lys Ser His Gly Tyr Asp Val Ala

355 360 365

Ile Ala Leu Glu Ser

370

<210> 3

<211> 1260

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgctaacat cctttaaact tcattcattg aaaccttaca ctctgaaatc atcaatgatt 60

ttagagataa taacttatat attatgtttt ttttcaatga taattgcatt cgtcgataat 120

actttcagca taaaaatata taatatcact gctatagttt gcttattgtc actaatttta 180

cgtggcagac aagaaaatta taatataaaa aaccttattc ttcccctttc tatattttta 240

ataggcttgc ttgatttaat ttggtattct gcgtttaaag tagataattc gccatttcgt 300

gctacttacc atagttattt aaatactgcc aaaatattta tatttggttc ttttattgtt 360

ttcttgacac taactagcca gctaaaatca aaaaaagaga gtgtattata cactttgtat 420

tctctgtcat ttctaattgc tggatatgca atgtatatta atagcattca tgaaaatgac 480

cgcatttctt ttggtgtagg aacggcaaca ggagcagcat attcaacaat gctaataggg 540

atagttagtg gcgttgcgat tctttatact aagaaaaatc atcctttttt atttttatta 600

aatagttgcg cggtacttta tgttctggcg ctaacacaaa ccagagcaac cctactcctg 660

ttccctataa tttgtgttgc tgcattaata gcttattata ataaatcacc caagaaattc 720

acttcctcta ttgttctact aattgctata ttagctagca ttgttattat atttaataaa 780

ccaatacaga atcgctataa tgaagcatta aatgacttaa acagttatac caatgctaat 840

agtgttactt ccctaggtgc aagactggca atgtacgaaa ttggtttaaa tatattcata 900

aagtcacctt tttcatttag atcagcagag tcacgcgctg aaagtatgaa tttgttagtt 960

gcagaacaca ataggctaag aggggcattg gagttttcta acgtacatct acataatgag 1020

ataattgaag cagggtcact gaaaggtctg atgggaattt tttccacact tttcctctat 1080

ttttcactat tttatatagc atataaaaaa cgagctttgg gtttgttgat attaacgctt 1140

ggcattgtgg ggattggact cagtgatgtg atcatatggg cacgcagcat tccaattatc 1200

attatatccg ctatagtcct cttactcgtc attaataatc gtaacaatac aattaattaa 1260

<210> 4

<211> 419

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Leu Thr Ser Phe Lys Leu His Ser Leu Lys Pro Tyr Thr Leu Lys

1 5 10 15

Ser Ser Met Ile Leu Glu Ile Ile Thr Tyr Ile Leu Cys Phe Phe Ser

20 25 30

Met Ile Ile Ala Phe Val Asp Asn Thr Phe Ser Ile Lys Ile Tyr Asn

35 40 45

Ile Thr Ala Ile Val Cys Leu Leu Ser Leu Ile Leu Arg Gly Arg Gln

50 55 60

Glu Asn Tyr Asn Ile Lys Asn Leu Ile Leu Pro Leu Ser Ile Phe Leu

65 70 75 80

Ile Gly Leu Leu Asp Leu Ile Trp Tyr Ser Ala Phe Lys Val Asp Asn

85 90 95

Ser Pro Phe Arg Ala Thr Tyr His Ser Tyr Leu Asn Thr Ala Lys Ile

100 105 110

Phe Ile Phe Gly Ser Phe Ile Val Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Lys Lys Glu Ser Val Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ser Phe

130 135 140

Leu Ile Ala Gly Tyr Ala Met Tyr Ile Asn Ser Ile His Glu Asn Asp

145 150 155 160

Arg Ile Ser Phe Gly Val Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Tyr Ser Thr

165 170 175

Met Leu Ile Gly Ile Val Ser Gly Val Ala Ile Leu Tyr Thr Lys Lys

180 185 190

Asn His Pro Phe Leu Phe Leu Leu Asn Ser Cys Ala Val Leu Tyr Val

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Gln Thr Arg Ala Thr Leu Leu Leu Phe Pro Ile Ile

210 215 220

Cys Val Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Tyr Asn Lys Ser Pro Lys Lys Phe

225 230 235 240

Thr Ser Ser Ile Val Leu Leu Ile Ala Ile Leu Ala Ser Ile Val Ile

245 250 255

Ile Phe Asn Lys Pro Ile Gln Asn Arg Tyr Asn Glu Ala Leu Asn Asp

260 265 270

Leu Asn Ser Tyr Thr Asn Ala Asn Ser Val Thr Ser Leu Gly Ala Arg

275 280 285

Leu Ala Met Tyr Glu Ile Gly Leu Asn Ile Phe Ile Lys Ser Pro Phe

290 295 300

Ser Phe Arg Ser Ala Glu Ser Arg Ala Glu Ser Met Asn Leu Leu Val

305 310 315 320

Ala Glu His Asn Arg Leu Arg Gly Ala Leu Glu Phe Ser Asn Val His

325 330 335

Leu His Asn Glu Ile Ile Glu Ala Gly Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly

340 345 350

Ile Phe Ser Thr Leu Phe Leu Tyr Phe Ser Leu Phe Tyr Ile Ala Tyr

355 360 365

Lys Lys Arg Ala Leu Gly Leu Leu Ile Leu Thr Leu Gly Ile Val Gly

370 375 380

Ile Gly Leu Ser Asp Val Ile Ile Trp Ala Arg Ser Ile Pro Ile Ile

385 390 395 400

Ile Ile Ser Ala Ile Val Leu Leu Leu Val Ile Asn Asn Arg Asn Asn

405 410 415

Thr Ile Asn

<210> 5

<211> 2142

<212> DNA

<213> 空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）

<400> 5

atgttgaaaa aagagtattt aaaaaaccct tatttagttt tgtttgcgat gattgtatta 60

gcttatgttt ttagtgtatt ttgcaggttt tattgggttt ggtgggcaag tgagtttaac 120

gagtattttt tcaataatca attaatgatc atttcaaacg atggctatgc ttttgctgag 180

ggcgcaagag atatgatagc aggttttcat cagcctaatg atttgagtta ttatggatct 240

tctttatcta cgcttactta ttggctttat aaaatcacac ctttttcttt tgaaagtatc 300

attttatata tgagtacttt tttatcttct ttggtggtga ttcctattat tttactagct 360

aatgaataca aacgcccttt aatgggcttt gtagctgctc ttttagcaag tgtagcaaac 420

agttattata atcgcactat gagtgggtat tatgatacgg atatgctggt aattgtttta 480

cctatgttta ttttattttt tatggtaaga atgattttaa aaaaagactt tttttcattg 540

attgccttgc cattatttat aggaatttat ctttggtggt atccttcaag ttatacttta 600

aatgtagctt taattggact ttttttaatt tatacactta tttttcatag aaaagaaaag 660

attttttata tagctgtgat tttgtcttct cttactcttt caaatatagc atggttttat 720

caaagtgcca ttatagtaat actttttgct ttatttgctt tagagcaaaa acgcttaaat 780

tttatgatta taggaatttt aggtagtgca actttgatat ttttgatttt aagtggtggg 840

gttgatccca tactttatca gcttaaattt tatattttta gaagcgatga aagtgcgaat 900

ttaacacagg gctttatgta ttttaatgtt aatcaaacca tacaagaagt tgaaaatgta 960

gattttagcg aatttatgcg aagaattagt ggtagtgaaa ttgttttctt gttttctttg 1020

tttggttttg tatggctttt gagaaaacat aaaagtatga ttatggcttt acctatattg 1080

gtgcttgggt ttttagcctt aaaaggagga cttagattta ccatttattc tgtacctgta 1140

atggctttag gatttggttt tttattgagc gagtttaagg ctatattggt taaaaaatat 1200

agccaattaa cttcaaatgt ttgtattgtt tttgcaacta ttttgacttt ggctccagta 1260

tttatccata tttacaacta taaagcgcca acagtttttt ctcaaaatga agcatcatta 1320

ttaaatcaat taaaaaatat agccaataga gaagattatg tggtaacttg gtgggattat 1380

ggttatcctg tgcgttatta tagcgatgtg aaaactttag tagatggtgg aaagcattta 1440

ggtaaggata attttttccc ttctttttct ttaagtaaag atgaacaagc tgcagctaat 1500

atggcaagac ttagtgtaga atatacagaa aaaagctttt atgctccgca aaatgatatt 1560

ttaaaatcag acattttaca agccatgatg aaagattata atcaaagcaa tgtggattta 1620

tttctagctt cattatcaaa acctgatttt aaaatcgata caccaaaaac tcgtgatatt 1680

tatctttata tgcccgctag aatgtctttg attttttcta cggtggctag tttttctttt 1740

attaatttag atacaggagt tttggataaa ccttttacct ttagcacagc ttatccactt 1800

gatgttaaaa atggagaaat ttatcttagc aacggagtgg ttttaagcga tgattttaga 1860

agttttaaaa taggtgataa tgtggtttct gtaaatagta tcgtagagat taattctatt 1920

aaacaaggtg aatacaaaat cactccaatc gatgataagg ctcagtttta tattttttat 1980

ttaaaggata gtgctattcc ttacgcacaa tttattttaa tggataaaac catgtttaat 2040

agtgcttatg tgcaaatgtt ttttttggga aattatgata agaatttatt tgacttggtg 2100

attaattcta gagatgctaa agtttttaaa cttaaaattt aa 2142

<210> 6

<211> 713

<212> PRT

<213> 空肠弯曲杆菌

<400> 6

Met Leu Lys Lys Glu Tyr Leu Lys Asn Pro Tyr Leu Val Leu Phe Ala

1 5 10 15

Met Ile Val Leu Ala Tyr Val Phe Ser Val Phe Cys Arg Phe Tyr Trp

20 25 30

Val Trp Trp Ala Ser Glu Phe Asn Glu Tyr Phe Phe Asn Asn Gln Leu

35 40 45

Met Ile Ile Ser Asn Asp Gly Tyr Ala Phe Ala Glu Gly Ala Arg Asp

50 55 60

Met Ile Ala Gly Phe His Gln Pro Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Ser Leu Ser Thr Leu Thr Tyr Trp Leu Tyr Lys Ile Thr Pro Phe Ser

85 90 95

Phe Glu Ser Ile Ile Leu Tyr Met Ser Thr Phe Leu Ser Ser Leu Val

100 105 110

Val Ile Pro Ile Ile Leu Leu Ala Asn Glu Tyr Lys Arg Pro Leu Met

115 120 125

Gly Phe Val Ala Ala Leu Leu Ala Ser Val Ala Asn Ser Tyr Tyr Asn

130 135 140

Arg Thr Met Ser Gly Tyr Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Ile Val Leu

145 150 155 160

Pro Met Phe Ile Leu Phe Phe Met Val Arg Met Ile Leu Lys Lys Asp

165 170 175

Phe Phe Ser Leu Ile Ala Leu Pro Leu Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Trp

180 185 190

Trp Tyr Pro Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Leu Phe

195 200 205

Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Phe His Arg Lys Glu Lys Ile Phe Tyr Ile

210 215 220

Ala Val Ile Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Asn Ile Ala Trp Phe Tyr

225 230 235 240

Gln Ser Ala Ile Ile Val Ile Leu Phe Ala Leu Phe Ala Leu Glu Gln

245 250 255

Lys Arg Leu Asn Phe Met Ile Ile Gly Ile Leu Gly Ser Ala Thr Leu

260 265 270

Ile Phe Leu Ile Leu Ser Gly Gly Val Asp Pro Ile Leu Tyr Gln Leu

275 280 285

Lys Phe Tyr Ile Phe Arg Ser Asp Glu Ser Ala Asn Leu Thr Gln Gly

290 295 300

Phe Met Tyr Phe Asn Val Asn Gln Thr Ile Gln Glu Val Glu Asn Val

305 310 315 320

Asp Phe Ser Glu Phe Met Arg Arg Ile Ser Gly Ser Glu Ile Val Phe

325 330 335

Leu Phe Ser Leu Phe Gly Phe Val Trp Leu Leu Arg Lys His Lys Ser

340 345 350

Met Ile Met Ala Leu Pro Ile Leu Val Leu Gly Phe Leu Ala Leu Lys

355 360 365

Gly Gly Leu Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Val Pro Val Met Ala Leu Gly

370 375 380

Phe Gly Phe Leu Leu Ser Glu Phe Lys Ala Ile Leu Val Lys Lys Tyr

385 390 395 400

Ser Gln Leu Thr Ser Asn Val Cys Ile Val Phe Ala Thr Ile Leu Thr

405 410 415

Leu Ala Pro Val Phe Ile His Ile Tyr Asn Tyr Lys Ala Pro Thr Val

420 425 430

Phe Ser Gln Asn Glu Ala Ser Leu Leu Asn Gln Leu Lys Asn Ile Ala

435 440 445

Asn Arg Glu Asp Tyr Val Val Thr Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Pro Val

450 455 460

Arg Tyr Tyr Ser Asp Val Lys Thr Leu Val Asp Gly Gly Lys His Leu

465 470 475 480

Gly Lys Asp Asn Phe Phe Pro Ser Phe Ser Leu Ser Lys Asp Glu Gln

485 490 495

Ala Ala Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Val Glu Tyr Thr Glu Lys Ser

500 505 510

Phe Tyr Ala Pro Gln Asn Asp Ile Leu Lys Ser Asp Ile Leu Gln Ala

515 520 525

Met Met Lys Asp Tyr Asn Gln Ser Asn Val Asp Leu Phe Leu Ala Ser

530 535 540

Leu Ser Lys Pro Asp Phe Lys Ile Asp Thr Pro Lys Thr Arg Asp Ile

545 550 555 560

Tyr Leu Tyr Met Pro Ala Arg Met Ser Leu Ile Phe Ser Thr Val Ala

565 570 575

Ser Phe Ser Phe Ile Asn Leu Asp Thr Gly Val Leu Asp Lys Pro Phe

580 585 590

Thr Phe Ser Thr Ala Tyr Pro Leu Asp Val Lys Asn Gly Glu Ile Tyr

595 600 605

Leu Ser Asn Gly Val Val Leu Ser Asp Asp Phe Arg Ser Phe Lys Ile

610 615 620

Gly Asp Asn Val Val Ser Val Asn Ser Ile Val Glu Ile Asn Ser Ile

625 630 635 640

Lys Gln Gly Glu Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Asp Asp Lys Ala Gln Phe

645 650 655

Tyr Ile Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Gln Phe Ile

660 665 670

Leu Met Asp Lys Thr Met Phe Asn Ser Ala Tyr Val Gln Met Phe Phe

675 680 685

Leu Gly Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Phe Asp Leu Val Ile Asn Ser Arg

690 695 700

Asp Ala Lys Val Phe Lys Leu Lys Ile

705 710

<210> 7

<211> 364

<212> PRT

<213> 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）

<400> 7

Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu

1 5 10 15

Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys

20 25 30

Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro

35 40 45

Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp

50 55 60

Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val

65 70 75 80

Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe

85 90 95

Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr

100 105 110

Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys

115 120 125

Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys

130 135 140

Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln

145 150 155 160

Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile

165 170 175

Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu

180 185 190

Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met

195 200 205

Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr

210 215 220

Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile

225 230 235 240

Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr

245 250 255

Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala

260 265 270

Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu

275 280 285

Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu

290 295 300

Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val

305 310 315 320

Arg Lys Asp Ala Leu Pro Ala Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr

325 330 335

Asp Val Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe

340 345 350

Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys

355 360

<210> 8

<211> 386

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）

<400> 8

Met Arg Lys Lys Leu Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu Pro Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Asp Val Ser Leu Tyr Gly Glu Ile Lys Ala Gly Val Glu

20 25 30

Gly Arg Asn Ile Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Lys Ala Gln

35 40 45

Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile

50 55 60

Arg Thr Lys Ile Ser Asp Phe Gly Ser Phe Ile Gly Phe Lys Gly Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Glu Gly Leu Lys Ala Val Trp Gln Leu Glu Gln Asp

85 90 95

Val Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Thr Gln Trp Gly Asn Arg Glu Ser

100 105 110

Phe Ile Gly Leu Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val

115 120 125

Ala Asn Gln Phe Asp Asp Ala Ser Gln Ala Ile Asp Pro Trp Asp Ser

130 135 140

Asn Asn Asp Val Ala Ser Gln Leu Gly Ile Phe Lys Arg His Asp Asp

145 150 155 160

Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Ser Gly Phe Ser

165 170 175

Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr

180 185 190

Pro Ala Tyr Val Asp Glu Lys Gln Val Ser His Ala Ala Val Val Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Ser Asp Val Tyr Tyr Ala Gly Leu Asn Tyr Lys Asn Gly

210 215 220

Gly Phe Ala Gly Ser Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Glu

225 230 235 240

Gly Arg Asp Ala Phe Phe Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu

245 250 255

Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His Gln Val His Arg Leu Thr

260 265 270

Gly Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Leu Asn Leu Ala Leu Ala Ala Gln Leu

275 280 285

Asp Leu Ser Glu Asn Ala Asp Lys Thr Lys Asn Ser Thr Thr Glu Ile

290 295 300

Ala Ala Thr Ala Ser Tyr Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser

305 310 315 320

Tyr Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn

325 330 335

Thr Ser Tyr Asp Gln Ile Ile Ala Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys

340 345 350

Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly

355 360 365

Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg His

370 375 380

Lys Phe

385

<210> 9

<211> 560

<212> PRT

<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）

<400> 9

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr

35 40 45

Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

130 135 140

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser

245 250 255

Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu

260 265 270

Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

290 295 300

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly

325 330 335

Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu

340 345 350

Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala

355 360 365

Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

370 375 380

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His

405 410 415

Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg

420 425 430

Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu

435 440 445

Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

450 455 460

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg

465 470 475 480

Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys

485 490 495

Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu

500 505 510

His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu

515 520 525

Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

530 535 540

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

545 550 555 560

<210> 10

<211> 451

<212> PRT

<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）

<400> 10

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

1 5 10 15

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

20 25 30

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

35 40 45

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

50 55 60

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

85 90 95

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

100 105 110

Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

115 120 125

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

130 135 140

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn

145 150 155 160

Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg

165 170 175

Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala

180 185 190

Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu

195 200 205

Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys

210 215 220

Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu

225 230 235 240

Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn

245 250 255

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr

275 280 285

Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg

290 295 300

Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn

305 310 315 320

Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val

325 330 335

Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn

340 345 350

Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

370 375 380

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser

385 390 395 400

Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn

405 410 415

Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp

420 425 430

Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp

435 440 445

Thr Asn Asp

450