一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石及其制备方法
阅读说明：本技术 一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石及其制备方法 (Selenium-doped hydroxyapatite with bone-like structure and preparation method thereof ) 是由 张胜民 王一帆 周盼 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石及其制备方法。本发明提供的仿骨结构的掺硒羟基磷灰石模拟天然骨的微观层级结构,由一级结构棒状硒掺杂羟基磷灰石纳米晶体单轴取向共组装得到。制备方法：钙盐溶液滴加到含有长链脂肪酸和等长链脂肪胺的混合体系中,随后向其中滴加磷盐和亚硒酸盐溶液,搅拌,然后105-150℃水热反应4-16h即得到有序组装的仿生硒掺杂羟基磷灰石。与非仿生的掺硒羟基磷灰石相比,本发明的仿骨结构掺硒羟基磷灰石,具有更优良的生物活性,更高效的生物利用度,作为一种新型多功能仿生材料,在肿瘤、创伤所致的骨及其他硬组织缺损修复领域中有广阔的应用前景。(The invention relates to a selenium-doped hydroxyapatite with a bone-like structure and a preparation method thereof. The selenium-doped hydroxyapatite with the bone-imitated structure provided by the invention simulates the micro-hierarchical structure of natural bone and is obtained by uniaxial orientation co-assembly of rod-shaped selenium-doped hydroxyapatite nanocrystals with a primary structure. The preparation method comprises the following steps: and dropwise adding the calcium salt solution into a mixed system containing long-chain fatty acid and long-chain fatty amine, dropwise adding a phosphorus salt and selenite solution into the mixed system, stirring, and carrying out hydrothermal reaction at 105-150 ℃ for 4-16h to obtain the orderly-assembled bionic selenium-doped hydroxyapatite. Compared with non-bionic selenium-doped hydroxyapatite, the selenium-doped hydroxyapatite with the bone-like structure has better bioactivity and higher bioavailability, and has wide application prospect in the field of bone and other hard tissue defect repair caused by tumors and wounds as a novel multifunctional bionic material.)
技术领域
本发明涉及一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石及其制备方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
羟基磷灰石是人体骨及其他硬组织的主要无机组成成分，良好的生物相容性和生物活性使其在骨缺损的填充和修复领域中具有广泛且深入的研究和应用基础。在天然骨中，钙磷离子在胶原纤维中重复出现的空隙区和重叠区域沿着胶原长轴的方向矿化生长，形成结晶度较低，含有微量元素掺杂和高度有序层级组装的纳米羟基磷灰石。由此可见，单轴取向组装的层级结构和微量元素掺杂是天然骨中羟基磷灰石的两大特征。
硒元素，作为一种人体必须的微量元素，在骨的形成和发育中具有重要作用。此外硒元素还具备抑制肿瘤，调节免疫和抗菌等多种生物学功能。因此近年来，硒元素掺杂的羟基磷灰石逐渐引起研究者们的关注。我们在2011年首次公开了一种化学沉淀法合成的硒掺杂纳米羟基磷灰石(中国专利CN 102249206 A)，随后惠俊峰等人公开了一种单分散硒掺杂纳米羟基磷灰石及制备方法(中国专利CN 106063947 A)，我们在2017年又申请了一种微米级单晶含硒羟基磷灰石的制备方法(中国专利CN 107902636 A)。但目前尚未见模拟天然骨微观层级结构的硒掺杂羟基磷灰石的报道。
仿生材料往往因为与天然组织的高度相似而具备更好的生物相容性和特殊的生物学功能。制备模拟天然骨的层级结构有望于提升掺硒羟基磷灰石的生物学功效，扩大其在生物医学领域中的应用范围。
发明内容
本发明针对上述技术空白，提供一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石及其制备方法。该方法操作简便，可规模量产，提供的掺硒羟基磷灰石具备与天然骨相似的微观层级结构。
本发明采用以下技术方案实现：
提供一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石，其模拟天然骨的微观层级结构，由一级结构棒状硒掺杂羟基磷灰石纳米晶体单轴取向共组装得到。
进一步地，所述的仿骨结构掺硒羟基磷灰石的一级结构棒状的掺硒羟基磷灰石纳米晶体，直径为5nm-10nm，长度为40nm-200nm。
进一步地，所述的仿骨结构掺硒羟基磷灰石由一级结构棒状的掺硒羟基磷灰石纳米晶体沿着纳米晶体生长的长轴方向单轴取向组装形成，宽度为100nm-700nm，长度为500nm-2μm。
更进一步地，所述仿骨结构掺硒羟基磷灰石为多晶结构，硒对磷的摩尔取代度,为1％～10％。
一种仿骨结构的掺硒羟基磷灰石的制备方法，步骤为：钙盐溶液滴加到含有长链脂肪酸和等长链脂肪胺的混合体系中，随后向其中滴加磷盐和亚硒酸盐溶液，搅拌，然后105-150℃水热反应4-16h即得到有序组装的仿生硒掺杂羟基磷灰石。在此矿化体系中，水溶液相中的钙离子和磷酸根/亚硒酸根离子分别先与油相中的长链脂肪酸和长链脂肪胺碳链末端的羧基和氨基结合，然后在该混合体系的油水相界面处生长组装得到有序排列的仿骨掺硒羟基磷灰石晶体。
按上述方案，长链脂肪酸和长链脂肪胺中碳链长度大于12。分别优选为亚油酸和十八胺。
按上述方案，上述制备方法，包括以下具体步骤：
(1)反应温度10-40℃，一边搅拌，一边将钙盐溶液滴加到长链脂肪酸、等长链脂肪胺和无水乙醇的混合液中，混合均匀后向其中滴加磷盐和亚硒酸盐溶液，搅拌2-10min，得到无定型前驱体混悬液；
(2)将无定型前驱体混悬液转入反应釜中，105-150℃恒温反应4-16h；
(3)用无水乙醇和去离子水交替洗涤离心，除去杂质，得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石。
上述方法中，所述钙元素与磷元素的摩尔比为10：(5.454-5.96)，硒元素与磷元素的摩尔比为(1-15)：100。
按上述方案，所述的长链脂肪酸相对于钙盐中钙离子物质的量过量；所述的等长链脂肪胺相对于磷盐和亚硒酸盐中的磷酸根和亚硒酸根的总物质的量过量。
优选地，所述的钙盐为硝酸钙。
优选地，所述磷盐为磷酸三钠。
优选地，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠。
本发明提供的含有长链脂肪酸和长链脂肪胺的矿化体系中，钙离子和磷酸根/亚硒酸根离子分别先与长链脂肪酸和长链脂肪胺碳链末端的羧基和氨基结合，通过其在混合体系的油水相界面处生长调控，并结合水热反应条件(一定的水热温度和水热时间)的选择，最终可制备得到有序排列的具有仿骨结构的掺硒羟基磷灰石晶体。水热反应温度过低，反应时间过短，材料尚不足以形成有序组装的结构；水热反应温度过高，反应时间过长，有序组装的结构亦可能被破坏，而不能得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石产品。
本发明的优势为：
本发明提供了一种全新的仿天然骨微观层级结构的掺硒羟基磷灰石材料，为棒状的掺硒羟基磷灰石纳米晶体沿纳米晶体生长的长轴方向单轴取向组装形成。优选地，其一级结构为直径5nm-10nm，长度40nm-200nm的棒状的掺硒羟基磷灰石纳米晶体，二级结构尺寸近微米级。
与不具备仿生层级结构的掺硒羟基磷灰石相比，本发明的仿骨结构掺硒羟基磷灰石，具有更优良的生物活性，更高效的生物利用度，作为一种新型多功能仿生材料，在肿瘤、创伤所致的骨及其他硬组织缺损修复领域中有广阔的应用前景。
本发明提供的制备工艺简单易行，原料成本可控，便于量化生产。
附图说明
图1是实施例1中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的透射电镜图。
图2是实施例1中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的高倍场发射透射电镜图。
图3是实施例1中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的X射线衍射谱图。
图4是实施例1中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的红外光谱图。
图5是实施例1中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的选区电子衍射图。
图6是实施例3中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的透射电镜图。
图7是实施例4中仿骨结构掺硒羟基磷灰石的场发射透射电镜图。
图8是实施例5中用于对照的非仿骨结构掺硒羟基磷灰石的场发射透射电镜图。
图9是实施例5中CCK-8检测的不同浓度的两种硒掺杂羟基磷灰石处理骨肿瘤细胞24h和48h后的细胞活力。
图10是对比例1中掺硒羟基磷灰石的透射电镜图。
图11是对比例2中掺硒羟基磷灰石的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的内容作进一步的详细描述，但本发明保护的实施方式不限于下列所述。
实施例1
(1)0.3g十八胺溶解于2.4mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的14.06mM亚硒酸钠和140.6mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌5min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于120℃反应10h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，即得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石。
图1为该硒掺杂的羟基磷灰石的透射电镜图，图2为该硒掺杂的羟基磷灰石的高倍场发射透射电镜图，从图中可以看出制备的材料具备与骨磷灰石相似的层级组装结构：仿骨结构掺硒羟基磷灰石的初级结构为棒状的掺硒羟基磷灰石纳米晶体，直径约为5nm-10nm，长度约为100nm-200nm；仿骨结构掺硒羟基磷灰石的二级结构由其初级结构沿着纳米晶体生长的长轴方向单轴取向组装形成，宽度约为200-400nm,长度约为500nm-1μm。图3为该硒掺杂的羟基磷灰石的X射线衍射谱图，从图中可以看出反应产物显示出典型的羟基磷灰石特征峰，表明本发明所制备的反应产物的物相为羟基磷灰石。图4为该硒掺杂的羟基磷灰石的红外光谱图，图中显示出明显的硒氧键、羟基、磷酸根，表明本发明的材料中存在硒元素掺杂，结合X射线衍射结果可以充分证明本发明所得产物为硒掺杂的羟基磷灰石。表1为X射线荧光探针检测的该产物中钙,磷,硒元素的原子百分含量及硒对磷取代的摩尔百分比，产物中的硒对磷取代度略低于反应原料的硒磷比。图5为该产物的选区电子衍射图，从图中可以看出所得产物为多晶，与天然骨中的磷灰石相似。
表1
实施例2
(1)0.3g十八胺溶解于2.4mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的11.39mM亚硒酸钠和142.41mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌8min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于110℃反应12h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，即得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石。
实施例3
(1)0.3g十八胺溶解于2.4mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的7.26mM亚硒酸钠和145.16mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌4min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于120℃反应5h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，即得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石。
图6为该硒掺杂的羟基磷灰石的透射电镜图，从图中可以看出制备的材料具备与骨磷灰石相似的层级组装结构。
实施例4
(1)0.5g十八胺溶解于3.0mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的14.06mM亚硒酸钠和140.6mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌4min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于140℃反应5h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，即得到仿骨结构的掺硒羟基磷灰石。
图7为该硒掺杂的羟基磷灰石的场发射透射电镜图，从图中可以看出制备的材料具备与骨磷灰石相似的层级组装结构。
实施例5生物活性功能分析
仿生材料往往因为与天然组织的高度相似而具备更优异的生物学功能，为证实本专利所述仿骨结构的掺硒羟基磷灰石，具有更良好的生物利用度和抗肿瘤功能。本实验利用不具备仿骨磷灰石层级结构的硒掺杂羟基磷灰石作为对照，在体外条件对骨肿瘤细胞HOS/MNNG进行培养。图8是通过常见的化学沉淀法制备的典型不具备仿骨磷灰石层级结构的硒掺杂纳米羟基磷灰石。图9给出的是CCK-8检测的不同浓度的两种硒掺杂羟基磷灰石处理骨肿瘤细胞24h和48h后的细胞活力。仿骨结构的硒掺杂羟基磷灰石对骨肿瘤细胞的抑制作用显著高于对照，值得注意的是仿骨结构硒掺杂羟基磷灰石在较低的浓度(20μg/mL)，其肿瘤抑制效果仍高于较高浓度(50μg/mL)的对照组，说明该仿生材料具有更为高效的生物利用度。
对比例1
(1)0.3g十八胺溶解于2.4mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的14.06mM亚硒酸钠和140.6mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌5min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于95℃反应5h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，得到掺硒羟基磷灰石。
图10为该掺硒羟基磷灰石的透射电镜图，可以看到，区别于与天然骨磷灰石的有序层级结构，该材料的组装结构杂乱无序。
对比例2
(1)0.3g十八胺溶解于2.4mL亚油酸和9.6mL无水乙醇中，边搅拌边向其中滴加5mL的200mM的硝酸钙水溶液，随后向其中逐滴加入4mL的7.26mM亚硒酸钠和145.16mM磷酸三钠的混合水溶液，室温下搅拌5min；
(2)将上述反应液转入反应釜中，密封后于180℃反应24h；
(3)反应釜冷却至室温后打开，交替使用无水乙醇，水洗涤反应沉淀数次，得到掺硒羟基磷灰石。
图11为该掺硒羟基磷灰石的透射电镜图，可以看到，该材料没有显著的有序层次结构。
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