一种人参多糖组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种人参多糖组合物及其制备方法和应用 (Ginseng polysaccharide composition and preparation method and application thereof ) 是由 焦丽丽 吴巍 李慧 李波 陈长宝 刘淑莹 李珺铭 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有免疫激活活性的人参多糖组合物及其制备方法。所述人参多糖组合物以摩尔百分比计,由3.0～3.6%鼠李糖、3.5～4.0%半乳糖醛酸、65.0%～70.0%葡萄糖、13.0%～13.5%半乳糖和9.5%～10.0%阿拉伯糖组成。所述人参多糖组合物的分子量大于3000Da且小于5000Da。在所述人参多糖组合物的制备方法中,使用20%、40%、60%、80%不同乙醇浓度的醇沉法。所述人参多糖体内能够促进淋巴细胞转化,增强巨噬细胞的吞噬作用及增强NK细胞的杀伤作用。本发明涉及的人参多糖组合物可用于制备增强机体免疫调节功能保健食品或药品。(The invention discloses a ginseng polysaccharide composition with immune activation activity and a preparation method thereof. The ginseng polysaccharide composition comprises, by mole, 3.0-3.6% of rhamnose, 3.5-4.0% of galacturonic acid, 65.0-70.0% of glucose, 13.0-13.5% of galactose and 9.5-10.0% of arabinose. The ginseng polysaccharide composition has a molecular weight greater than 3000Da and less than 5000 Da. In the preparation method of the ginseng polysaccharide composition, alcohol precipitation methods with different ethanol concentrations of 20%, 40%, 60% and 80% are used. The panaxan can promote lymphocyte transformation, enhance phagocytosis of macrophage and enhance killing effect of NK cell. The ginseng polysaccharide composition can be used for preparing health-care food or medicine for enhancing the immunoregulation function of organisms.)
技术领域
本发明涉及一种人参多糖组合物及其制备方法和应用，所述人参多糖组合物具有免疫激活作用。
背景技术
人参是五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Meyer）的干燥根，自古以来被认为是医食同补的尚佳药用植物。具有大补元气，固脱生津，安神的作用。大量研究表明人参多糖具有良好的免疫调节活性，能诱导淋巴细胞增殖及T淋巴细胞活性。
早在上世纪60年代，前苏联科学家就已将人参中的多糖分为人参淀粉和人参果胶。此后大量研究证实研究表明人参中性糖具有显著的抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力的功效。多糖的结构与其生物学活性密切相关。多糖的分子量、连接键型、支链及支链基团、取代基位点、数量等都直接影响其生物学功能。其中，分子量是影响多糖活性的一个重要因素。另外，不同的提取方式或分级方式对多糖的活性都有一定的影响。并且有人认为多糖也像蛋白质一样，存在活性必需的活性中心。免疫活性是人参多糖的主要活性之一，对其发挥免疫增强活性的必需结构单元进行研究，对于人参多糖构效关系研究至关重要。同时，对于人参多糖的科学开发和利用提供理论依据。
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，多糖是一类结构复杂的生物大分子，分子量对其生物学功能有重要影响，基于此，以人参多糖免疫活性为导向，探究分子量对人参多糖免疫活性的影响，进而获得具有较高免疫活性的人参多糖核心级分。
本发明的目的在于提供一种具有免疫增强活性人参多糖纯化样品的制备方法，所述方法简单，操作简便，易于实施。
用于解决问题的技术手段
本发明的目的通过以下实施方式实现。
1、一种人参多糖组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，由3.0~3.6%鼠李糖、3.5~4.0%半乳糖醛酸、65.0%~70.0%葡萄糖、13.0%~13.5%半乳糖和9.5%~10.0%阿拉伯糖组成，并且所述人参多糖组合物的分子量大于3000Da且小于5000Da。
2、根据权利要求1所述的人参多糖组合物，其中，鼠李糖为3.55%、半乳糖醛酸为3.61%、葡萄糖为69.69%、半乳糖为13.26%，阿拉伯糖9.89%，并且所述分子量为3160Da。
3、权利要求1~2中任一项所述的人参多糖组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
A 将人参粉碎，得人参粉末；
B 对所述人参粉末进行水提取，然后过滤，得滤液；
C 将所述滤液进行浓缩，得人参多糖提取液；
D 对人参多糖提取液采用20%~80%乙醇沉淀，离心，得残渣；
E将所述残渣溶于水中，经凝胶色谱制备后得所述人参多糖组合物。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤D如下进行：
向所述人参多糖提取液中加入95%乙醇使乙醇终浓度为20%，收集沉淀及上清液；
将所述上清液继续加入95%乙醇配制成40%乙醇浓度，分别收集上清液；
将所述上清液继续加入95%乙醇配制成60%乙醇浓度，分别收集上清液；
将所述上清液继续加入95%乙醇配制成80%乙醇浓度，收集沉淀，复溶于水，冻干。
5、权利要求1~2中任一项所述的人参多糖组合物在制备具有免疫增强活性的药物中的应用。
6、根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫增强活性为促进小鼠淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能并增强NK细胞的杀伤能力。
本发明的人参多糖组合物可以通过如下具体方法进行制备。
1.人参粗多糖的提取：将人参粉碎至40-60目，用10倍（w/w）蒸馏水浸泡，放在加热套上装好回流装置。加热，待微沸时计时2小时，当第一次加热提取完毕后将圆底烧瓶中的提取液通过120目尼龙布过滤，将倒出的残渣放回圆底烧瓶中，滤液保存待用，提取三次，合并三次人参提取液，在80℃的水浴下进行浓缩。
2.人参多糖乙醇醇沉分级：将得到的人参提取液进行20%、40%、60%、80%不同乙醇浓度醇沉，最终得不同浓度人参多糖组合物。
3. 人参多糖的分级纯化：取0.5 g人参多糖组合物并将其放入离心管中，加入10mL水，以8000转/分钟离心5分钟，用胶头滴管取上清液并将其加入已经准备好的Sepharose CL-6B制备柱，以生理盐水为流动相，用自动收集器进行收集，洗脱液用苯酚硫酸法测定其糖含量，用软件绘制出相应的洗脱体积与糖含量的曲线图，将曲线图中峰对应的洗脱体积收集，然后用透析袋流动自来水透析24小时以及蒸馏水透析24小时后，倒入冻干容器中并放置超低温冰箱中冷冻，将冷冻好的样品放入冻干机中进行冻干，获得的粉末即为纯化的样品。
发明效果
本发明的人参多糖组合物在体内能促进小鼠淋巴细胞增殖，对巨噬细胞有激活作用，有显著的增强NK细胞毒的效果，因此具有免疫激活作用。
附图说明
图1. 人参多糖组合物的高效凝胶渗透色谱图。
图2. 人参多糖组合物的单糖组成分析图。
具体实施方式
本发明中使用的仪器为：Thermo Fisher Scientific 公司的Ultimate3000 型液相色谱系统，依利特色谱柱，UV-VIS DAD 检测器，TECAN公司的Infinite M200 PRO酶标仪。
实施例1
取粉碎后的人参准确称量500 g放入10 L的圆底烧瓶中，加入5 L水后放在加热套上装好回流装置。加热，待微沸时计时2 小时，当第一次加热提取完毕后将圆底烧瓶中的提取液通过120目尼龙布过滤，将倒出的残渣放回圆底烧瓶中，滤液保存待用，提取三次，合并三次人参提取液，在80℃的水浴下进行浓缩。
将上述的人参提取液加入95%乙醇使乙醇终浓度为20%，静置24小时后，以8000转/分钟离心10分钟，取出上清液继续加入95%乙醇乙醇，使乙醇终浓度为配制成40%乙醇浓度，静置24小时，离心，收集上清液；上清液继续加入95%乙醇，使其终浓度为80%，静置24小时后，以8000转/分钟离心10分钟，获得沉淀复溶于水，冻干后得人参多糖级分。
取上述人参多糖500 mg 溶解于蒸馏水中（10 ml），以10000转 /分钟离心5分钟，收集上清液，所得上清液经Sepharose CL-6B 凝胶柱 (3.0 cm × 90 cm)进一步纯化，蒸馏水为洗脱液，流速为0.5 ml/min, 20 min/管，苯酚硫酸法跟踪检测，收集相应多糖级分，冷冻干燥，得到分子量均一的人参多糖组合物。
本发明得到的人参多糖组合物利用HPLC在下述测定条件下进行分析，得一个单一狭窄对称洗脱峰，洗脱时间为16.557分钟，由此可知，该人参多糖组合物分子量均一，根据已知分子量葡聚糖绘制分子量曲线计算得所述人参多糖组合物的分子量为3160 Da
HPLC测定条件如下：
色谱柱：TSK-G3000 PWXL (7.8 mm ID × 30.0 cm L)
检测器：RID-10A
流动相：去离子水
流速：1.0 mL/min
进样量：10 μL
本发明得到的人参多糖组合物经完全酸水解及PMP衍生，利用HPLC在下述测定条件下进行分析，根据标准单糖的相对保留时间可知，该人参多糖中所含单糖由鼠李糖、半乳糖醛、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔百分含量分别为3.55%，3.61%，69.69%，13.26%和9.89%。
HPLC测定条件如下：
色谱柱：DIKMA Inertsil ODS-3（4.6mm × 150 mm）
检测器：UV-VIS DAD
检测波长：245 nm
流动相：PBS（0.1 M , p小时 7.0）：乙腈=82:18（v/v）, p小时 7.0
流速：1.0 mL/min
进样量：10 μL
药效试验
利用实施例1制备得到的人参多糖组合物进行免疫活性检测
1. 人参多糖组合物的体内免疫活性研究
1.1 人参多糖组合物对小鼠体重及免疫器官得影响
将雄性鼠ICR小鼠随机分为正常组、生理盐水对照组,人参多糖组合物给药组（50 mg/kg）,共3组,每组只12。阴性对照组给予生理盐水，0.2 ml/只，采用灌胃给药的方式给药,连续给药30天。试验结束后，采用颈椎脱臼处死小鼠，称重，记录体重，用酒精消毒后移入超净台，无菌条件下取出小鼠脾脏及胸腺称重，计算脾指数及胸腺指数。
表1 人参多糖组合物对小鼠体重、脾指数及胸腺指数的影响
注： *表示实验组与阴性对照组相比p<0.05
结果显示，与阴性对照组相比，人参多糖组合物50mg/kg给药组小鼠的体重有所提高，但是并未呈现显著差异；给药组小鼠脾指数和胸腺指数相对于阴性对照组有明显提高，且具有显著差异（P<0.05）。并且人参多糖组合物给药组小鼠的食欲、活力及皮毛的光泽都要比阴性对照组的好。
1.2. 人参多糖组合物对小鼠淋巴细胞转化的影响
脾淋巴细胞单细胞悬液制备：连续30天以灌胃方式向正常小鼠给予人参多糖组合物。末次给药后次日，脱颈处死小鼠，无菌条件下剖取脾脏，剔除结缔组织和脂肪后置于盛有冰浴的D-Hanks平衡盐溶液的平皿中，用镊子将脾研磨碎，并用200目筛过滤细胞悬液以除去组织块，移至离心管内，以1000 转/分离心5分钟。缓慢加入淋巴细胞分离液，除去红细胞。再用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。用DMEM培养液重悬细胞。台盼兰染色计数，活细胞大于95%。用DMEM培养液将细胞稀释成1×106 个/mL，制成单细胞悬液。结果显示在本次实验中，人参多糖组合物单独作用时（表2），能够显著刺激淋巴细胞转化，并与阴性对照相比能达到显著差异（P<0.01）；并且，人参多糖组合物在50 mg/kg能诱导ConA诱导T淋巴细胞的增殖（表2），与阴性对照组比，其作用效果均极显著（P<0.01）。
表2 人参多糖组合物对淋巴细胞增殖的影响
注： *表示实验组与阴性对照组相比p<0.05, **表示实验组与阴性对照组相比p<0.01
1.3人参多糖组合物刺激腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
腹腔巨噬细胞的制备：连续30天以灌胃方式向正常小鼠给予人参多糖组合物(50 mg/kg)。末次给药后次日，脱颈处死小鼠，无菌条件下用预冷的PBS (10 mL)清洗腹腔，收集腹腔液于50 mL离心管中，4℃下，以1000转/分离心10 分钟。重复离心两次，弃去上清后用DMEM培养基重悬细胞。将调整细胞浓度调整至5×106 cells/mL加入12孔板中，100 μl/孔。将培养板置于5%CO2、37℃培养箱中培养3 小时，然用37℃预温的PBS液清洗培养板2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。
巨噬细胞吞噬中性红：首先用EDTA孵育30 min收集脱落下来的巨噬细胞，调整细胞浓度为1×106 cells/mL加入96孔板中,培养24小时后，向每孔加入中性红溶液 (浓度为0.075%，100 μL/孔)，培养1小时。最后，用PBS清洗培养板，加入100 μL细胞裂解液（乙醇：乙酸=1:1，v/v）裂解2小时后用酶标仪检测波长550 nm的OD值。
表3 人参多糖组合物对巨噬细胞吞噬中性红实验
注： *表示实验组与阴性对照组相比p<0.05, **表示实验组与阴性对照组相比p<0.01.
为了观察人参多糖对腹腔巨噬细胞的调节作用，首先检测了人参多糖组合物对小鼠巨噬细胞的吞噬功能进行了检测。结果显示，人参多糖组合物（50 mg/kg）能显著的增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬中性红的能力。提示人参多糖组合物对巨噬细胞有显著的免疫刺激活性。
1.4人参多糖组合物对腹腔巨噬细胞产生NO的影响
由于NO在细胞外极不稳定，半衰期短，因此直接检测NO的产量很困难。目前常用的方法是用Griess试剂检测巨噬细胞培养液上清中的亚硝酸盐的浓度，以间接地反应巨噬细胞产生的NO的水平。
腹腔巨噬细胞制备同上。细胞以2×106 个/mL的浓度加入24孔板中。加入待测糖样培养24小时后，吸取细胞培养液上清（100 μl）加入另一培养板中，并加入等体积的Griess 试剂，10分钟后用酶标仪检测，检测波长为540 nm，并用NaNO2溶液绘制标准曲线，并计算出不同浓度样品刺激巨噬细胞后NO的产量。结果显示，人参多糖能够促进巨噬细胞分泌NO，进一步证明，人参多糖组合物能够激活巨噬细胞。
3、人参多糖对NK细胞毒活性的影响实验
NK细胞作为淋巴细胞的另一亚群，能够裂解或杀伤被感染的肿瘤细胞。为了研究人参多糖在体内对于NK细胞杀伤能力的影响，将小鼠灌胃给予人参多糖组合物（50 mg/kg）10天。同时设置了阴性对照组和空白对照组。人参多糖组合物连续给药30天后，按照2.1方法制备淋巴细胞，在体外培养48小时，以YAC-1作为靶细胞进行了活力检测(效靶比分别为20:1)。结果如表4所示，人参多糖组合物对于NK细胞的细胞毒活性均具有一定的调节作用。提示人参多糖组合物有显著的增强NK细胞毒的效果。以YAC-1细胞作为检测NK细胞毒活性的靶细胞。按照效靶比例20:1加入96孔板，即脾细胞5×106 个/孔，而YAC-1细胞分别为2.5×105 个/孔，37 ℃于CO2培养箱共同培养24小时之后，加入MTT溶液（5 mg/ml）,继续培养4小时，弃去上清加入100 μl DMSO,用酶标仪检测490 nm的光吸收值。细胞毒活性计算公式如下：
NK细胞活力 (%) =
表4 人参多糖组合物对NK细胞毒活性的影响实验
<i></i> NK细胞活力（%） 空白组 11.978±5.65 阴性组 9.333±4.70 人参多糖组合物 20.88±10.42<sup>*</sup>
注： *表示实验组与阴性对照组相比p<0.05。
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