一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法及其应用 (Preparation method and application of boletus flavomarginatus crude polysaccharide ) 是由 曾念开 吴璐伶 谢惠菁 张玉卓 徐畅 张絮 韩云霄 �田润 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法,包括以下步骤：将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎,过筛,得干粉备用；称取干粉,按料液比1g∶25～40mL加入蒸馏水,在40～60℃下超声15～30min,然后于70～90℃热水下浸提3～5h,离心,得第一沉淀和第一上清液；在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的40～50％水,于70～90℃下浸提2.5～3.5h,将提取液离心；得第二沉淀和第二上清液；第一上清液和第二上清液减压浓缩,得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将乙醇溶液加入浓缩液中,静置过夜；离心,将沉淀冷冻干燥24～28h,即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。本发明提供的黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取方法操作简单,易于产业化推广使用。采用上述超声波协同热水浸提法提取得到的粗多糖具有增重、加强脏器细胞分化等多方面的功效。(The invention provides a preparation method of boletus flavipes crude polysaccharide, which comprises the following steps: pulverizing dried Armillariella tabescens fruiting body, and sieving to obtain dry powder; weighing dry powder, adding distilled water according to the material-liquid ratio of 1 g: 25-40 mL, performing ultrasonic treatment at 40-60 ℃ for 15-30 min, then leaching with hot water at 70-90 ℃ for 3-5 h, and centrifuging to obtain a first precipitate and a first supernatant; adding water with the amount of 40-50% of the first distilled water into the first precipitate, leaching for 2.5-3.5 h at 70-90 ℃, and centrifuging the extracting solution; obtaining a second precipitate and a second supernatant; concentrating the first supernatant and the second supernatant under reduced pressure to obtain concentrated solution; slowly adding the ethanol solution into the concentrated solution under the stirring of a magnetic stirrer, and standing overnight; centrifuging, and freeze-drying the precipitate for 24-28 h to obtain the boletus flavipes crude polysaccharide. The extraction method of the boletus flavipes crude polysaccharide provided by the invention is simple to operate and easy to industrially popularize and use. The crude polysaccharide extracted by the ultrasonic wave and hot water extraction method has the effects of increasing weight, strengthening organ cell differentiation and the like.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法及其应用。
背景技术
牛肝菌科真菌广泛分布在世界范围内，由于分布地区的地理位置、气候条件等方面存在差异，故不同地区的牛肝科真菌的种类之间存在明显差异。据不完全统计，我国牛肝菌科真菌可食用种类已达199种。牛肝菌是“四大名菌”之一，具有低脂肪、高蛋白与碳水化合物，以及合理的氨基酸构成等优点，是一种具有商业潜力和研究价值的食用菌。
牛肝菌还具有很重要的药用价值。牛肝菌药用价值的主要功效是清热解烦、补虚提神、舒筋和血。现研究表明，粉末牛肝菌(Pulveroboletus ravenelii)复合群的一些种类可治疗腰酸腿疼、手足抽搐、麻木等症状；华美牛肝菌(B.speciosus Frost)可治疗腹胀、消化不良等症状；而粉孢牛肝菌(Tylopilus felleus)、撒旦红孔牛肝菌(Rubroboletussatanas)等具毒性的牛肝菌，可提取毒素应用于医药领域。苏璐等的实验表明兰茂牛肝菌(Lanmaoa asiatica G.Wu&Zhu L.Yang)的子实体提取物可提高免疫力。肖艳红等用牛肝菌多糖提取物干预2型糖尿病模型大鼠，发现可使其血糖降低。
牛肝菌科真菌的化学成分中以多糖类成分最为突出。孙丽平等人研究发现提取的6种云南野生食用牛肝菌的粗多糖中，其水溶性粗多糖的含量较高。针对牛肝菌多糖的提取，已有研究提出相应的提取方法。例如CN105273101A公开了一种从牛肝菌中提取牛肝菌多糖的方法，该方法包括以下步骤：(1)用质量分数为0.25-0.35％的盐酸溶液在30-40℃提取牛肝菌1-3h，得提取液；(2)将所述提取液加碱调节pH值至7.5-8.0，再固液分离除去不溶物，得澄清的水溶液A；(3)在所述水溶液A中加酸调节pH值至4.0-4.5，再固液分离除去不溶物，得澄清的水溶液B；(4)将所述水溶液B加入到大孔吸附树脂柱中，先用水洗涤大孔吸附树脂除去未被吸附的杂质；再用体积分数为15-20％的乙醇溶液洗涤大孔吸附树脂除去极性较高的杂质；再用体积分数为65-70％的乙醇溶液作为解吸液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的解吸液，经减压浓缩、干燥得牛肝菌提取物。该方法提取效率高，但是需要多次调整pH且采用大孔吸附树脂柱在特定条件下洗脱，因此其操作相对复杂且成本相对较高。
目前关于黄柄黄肉牛肝菌的研究甚少，在黄柄黄肉牛肝菌多糖的提取和药理方面的研究更少，对黄柄黄肉牛肝菌多糖的了解不够深入，这大大制约了黄柄黄肉牛肝菌相关产业的发展。故本发明进一步探索黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取方法及其药理作用是非常具有意义的。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法及其应用。
本发明技术方案主要包括以下内容：
一种黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎，过筛，得干粉备用；
(2)称取干粉，按料液比1g∶25～40mL加入蒸馏水，在40～60℃下超声15～30min，然后于70～90℃热水下浸提3～5h，离心，得第一沉淀和第一上清液；
(3)在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的40～50％水，于70～90℃下浸提2.5～3.5h，将提取液离心；得第二沉淀和第二上清液；
(4)第一上清液和第二上清液减压浓缩，得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将乙醇溶液加入浓缩液中，静置过夜；离心，将沉淀冷冻干燥，即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。
优选的，沉淀冷冻干燥时间为24～28h。
优选的，超声功率为500～600W。
优选的，减压浓缩的温度为50～60℃；乙醇溶液的加入量为浓缩液的4倍体积。
优选的，乙醇溶液的体积浓度为80～95％。
另一方面，本发明还提供了所得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖在多种产品中的用途。相关用途包括在制备动物增重的产品中的应用，在制备加强动物脏器细胞分化的产品中的应用，在制备提高动物肠道酸性物质含量的产品中的应用，在制备降低动物肠道氨含量的产品中的应用，在制备降低动物血清二胺氧化酶含量的产品中的应用以及在制备降低动物血清内毒素的产品中的应用。
本发明所取得的效果：
本发明采用超声波协同热水浸提法提取得到具有多种药理作用的黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。经实验证明，该粗多糖具有增重、加强脏器细胞分化、提高动物肠道酸性物质含量、降低动物肠道氨含量、降低动物血清二胺氧化酶含量以及降低动物血清内毒素方面的效果。该黄柄黄肉牛肝菌粗多糖具有重要的药用价值。
本发明的提出可为黄柄黄肉牛肝菌资源的开发利用奠定基础，提高黄柄黄肉牛肝菌的附加值。
本发明提供的黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取方法操作简单，易于产业化推广使用。
附图说明
图1：黄柄黄肉牛肝菌子实体照片
图2：小鼠体重增长情况
图3：氨含量标准曲线
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明所述黄柄黄肉牛肝菌为Butyriboletus pseudospeciosus。Butyriboletuspseudospeciosus Kuan Zhao&Zhu L.Yang,in Wu,Li,Zhu,Zhao,Han,Cui,Li,Xu&Yang,Fungal Diversity 81:69(2016)。本发明使用的药材黄柄黄肉牛肝菌购于云南省西双版纳农贸市场。
本发明中黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取方法概括为：
(1)用粉碎机将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎，过40目筛，得干粉；
(2)称取20g干粉，按料液比1g∶25～40mL加入蒸馏水，在40～60℃下超声15～30min，超声功率为500～600W；然后于70～90℃热水下浸提3～5h，4000rpm离心15min，得第一沉淀和第一上清液；
(3)在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的40～50％水，于70～90℃下浸提2.5～3.5h，将提取液4000rpm离心15min；得第二沉淀和第二上清液；
(4)第一上清液和第二上清液于50～60℃下减压浓缩至原体积的三分之一，得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将80～95vt％乙醇溶液加入浓缩液中，乙醇溶液的加入量为浓缩液的4倍体积，静置过夜；4000rpm离心15min，将沉淀冷冻干燥24～28h，即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。
经实验，在上述参数范围内制得的黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的药理作用效果均与实施例1无显著性差异。
实施例1-黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取
(1)用粉碎机将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎，过40目筛，得干粉；
(2)称取20g干粉，按料液比1g∶25mL加入蒸馏水，在50℃下超声15min，超声功率为500W；然后于85℃热水下浸提3h，4000rpm离心15min，得第一沉淀和第一上清液；
(3)在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的50％水，于85℃下浸提2.5h，将提取液4000rpm离心15min；得第二沉淀和第二上清液；
(4)第一上清液和第二上清液于50℃下减压浓缩至原体积的三分之一，得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将95vt％乙醇溶液加入浓缩液中，乙醇溶液的加入量为浓缩液的4倍体积，静置过夜；4000rpm离心15min，将沉淀冷冻干燥24h，即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。
实施例2黄柄黄肉牛肝菌粗多糖药理作用研究-动物实验
动物：健康雄性昆明小鼠(由河南斯克贝斯生物科技公司提供)，体重20～30g，6至8周龄，实验动物生产许可证：SCXK(豫)2020—0005。
2.1动物分组与喂养
每组7只小鼠，将雄性昆明小鼠随机分为6组，分别为空白对照组(K)、黄柄黄肉牛肝菌多糖低剂量组(PL)、黄柄黄肉牛肝菌多糖高剂量组(PH)、灵芝孢子粉组(G)、低剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组(PLG)、高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组(PHG)。实验动物分组情况见表1。
小鼠喂养条件及处理：20-25℃，适应性喂养7d。每天投放相同量的饲料，实验期间自由进食进水。药物为粉末，采用去离子水溶解稀释。每组每日每个上午同时间段灌胃一次，连续灌胃时间为14d，每次灌胃体积均为0.3mL。小鼠灌胃第7d时每组随机选取3只小鼠处死，第14d余下全部处死。每组小鼠处死前的末次灌胃后禁食不禁水8-12h，称量每只雄性昆明小鼠的体重；次日进行CO2处死、解剖，眼球取血。收集血清和结肠内粪便。
表1实验动物分组
注：PB为黄柄黄肉牛肝菌粗多糖，GLCP为灵芝孢子粉。
2.2指标测定
(1)小鼠生命体征
①小鼠体重变化适应性喂养第4d、第7d喂食前测每只雄性昆明小鼠体重，实验期间每周的第7d喂食前和灌胃前记录每组昆明小鼠的体重及只数，每周详细记录一次，共3次。实验期间计算每组雄性昆明小鼠每个阶段(7d为一个阶段)体重的平均值。观察实验期14d中每组小鼠体重之间的变化，比较其差异性。
②小鼠脏器指数
CO2处死每只雄性昆明小鼠后，解剖时分离出小鼠的脏器(肝、脾脏、胸腺、结肠、盲肠)，精确称量其质量，单位为g。
脏器指数的计算方法如下：盲肠指数＝盲肠重量/小鼠重量×100％
(2)小鼠粪便
①pH值
在实验第14d每只小鼠平均取4颗总重量为0.1g的粪便。采用1mL去离子水溶解，置研磨仪中混匀，于4℃下离心8min(4000r/min)，用pH计测量上清液的pH值。
②氨含量
在实验第14d每只小鼠平均取4颗重量约为0.1g的粪便，放-80℃冰箱中备用。
检测粪便内氨含量是采用纳氏试剂分光光度法。根据公共场所空气中氨测定方法(GB T 18204.25-2000)测昆明小鼠的粪便内氨含量和制作氨含量的标准曲线。
(3)小鼠血清指标
在实验第14d，每组5个平行，小鼠均眼球取血约1mL，离心8min(4000r/min)后取上清液。按照ELISA试剂盒中二胺氧化酶(DAO)和内毒素(ET)的说明书测定小鼠血清中二胺氧化酶、内毒素的含量。
2.3结果与分析
(1)小鼠生命体征指标
体重：小鼠体重增长情况如图2所示，可分析得出在第二阶段(第7-14d)高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组与黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组对比对照组均有明显的体重升高，这表明小鼠给药高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖或联合给药有较好的吸收。
脏器指数：小鼠脏器指数情况如表2所示。在肝指数方面，其他给药组与空白对照组相比，肝指数均有升高，但只有高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉有显著性差异。在脾脏指数方面，其他给药组与空白对照组相比，脾脏指数均有明显升高，其中灵芝孢子粉组、高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组与高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组具显著性差异。在胸腺指数方面，与空白对照组相比，其他给药组的的胸腺指数均有显著升高，其中灵芝孢子粉组、低剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组与高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组有显著性差异，此项结果可能和低剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组小鼠的体重在第二阶段(第7-14d)增加较少有关。总观脏器指数结果，高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组与高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉使用均能使各脏器指数具有显著性升高，起到增强小鼠体质，加强小鼠脏器细胞分化的作用。
表2小鼠脏器指数
注：与空白对照组相比，*代表有显著性差异(P＜0.05)，**代表有极显著性差异(P＜0.01)。
(2)粪便pH值、氨含量结果
pH值：通过比较表3的数据可分析得，在给小鼠灌胃14d后，给药组小鼠粪便的pH值均下降。相较于空白对照组，高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖、低剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组、高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组对降低小鼠粪便中pH值极显著，低剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖组和灵芝孢子粉组降低pH值显著。高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖和两者联合均能降低粪便pH值，比灵芝孢子粉独用的效果好。同时，黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉比单用黄柄黄肉牛肝菌多糖或单用灵芝孢子粉效果都好，粪便pH值与单用黄柄黄肉牛肝菌多糖时的剂量有关。这表明使用黄柄黄肉牛肝菌多糖或者黄柄黄肉牛肝菌多糖联合孢子粉后均可使小鼠肠道中短链脂肪酸等酸性物质增多。
氨含量：氨含量标准曲线如图3所示，通过比较表3中的氨含量数据可知，灌胃14d后，给药组的雄性昆明小鼠粪便的氨含量均下降。与空白对照组相比较，灵芝孢子粉组极显著下降，黄柄黄肉牛肝菌多糖独用组和高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组显著下降。这说明单用黄柄黄肉牛肝菌多糖或高剂量黄柄黄肉牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉均能使肠道内的蛋白质或其他物质转化为氨的含量减少，其中联合使用的效果较好。
表3小鼠粪便pH值、氨含量
注：与空白对照组相比：*代表有显著性差异(P＜0.05)，**代表有极显著性差异(P＜0.01)。
(3)小鼠血清测量结果分析
小鼠血清的二胺氧化酶和内毒素的测量结果如表4所示。在DAO方面，从表中可以看出，与对照组相比，给药组DAO的浓度均有极显著性的下降，其中高剂量牛肝菌多糖联合灵芝孢子粉组的DAO浓度最低，联合使用的效果比使用单一的牛肝菌多糖效果好。在正常生理条件下，体内血液DAO含量极少。当肠黏膜屏障功能发生异常时，DAO会大量入血后进入肠道，导致肠道与外周血中的DAO水平异常升高表达。DAO的活性与循环水平这一指标常用于评价临床上肠道黏膜的受损情况。在ET方面，从表4中分析结果得出低剂量牛肝菌多糖相比于对照组，极显著降低了ET含量，而高剂量牛肝菌多糖未表现出显著性，这表明低剂量有可能已经达到了降低ET的有效浓度。牛肝菌与灵芝孢子粉联合使用却显著性提高ET的含量，这与联合使用可能起到抑制作用有关，但其抑制机制有待进一步明确。正常人体肠道内含有大量内毒素，正常情况下内毒素对人体没有危险性的影响，只有当肠道屏障功能异常时，大量的内毒素才会进入血液循环中，从而出现内毒素血症。
表4小鼠血清中DAO与ET的含量
注：与空白对照组相比：*代表有显著性差异(P＜0.05)，**代表有极显著性差异(P＜0.01)。
从小鼠的体重增长情况、脏器指数、粪便的pH值与氨含量、血清中DAO与ET的含量、肠道菌群测序综合分析表明，各项指标均指证最优给药方式为单用高剂量黄柄黄肉牛肝菌粗多糖，低剂量黄柄黄肉牛肝菌粗多糖联合灵芝孢子粉次之。
对比例1-黄柄黄肉牛肝菌粗多糖的提取
本对比例与实施例1的主要区别是：热水提取的条件不同。
(1)用粉碎机将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎，过40目筛，得干粉；
(2)称取20g干粉，按料液比1g∶25mL加入蒸馏水，在50℃下超声15min，超声功率为500W；然后于50℃热水下浸提3h，4000rpm离心15min，得第一沉淀和第一上清液；
(3)在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的50％水，于50℃下浸提2.5h，将提取液4000rpm离心15min；得第二沉淀和第二上清液；
(4)第一上清液和第二上清液于50℃下减压浓缩至原体积的三分之一，得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将95vt％乙醇溶液加入浓缩液中，乙醇溶液的加入量为浓缩液的4倍体积，静置过夜；4000rpm离心15min，将沉淀冷冻干燥，即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。
对比例2
本例与实施例1的主要区别是：超声条件不同。
(1)用粉碎机将干燥的黄柄黄肉牛肝菌子实体粉碎，过40目筛，得干粉；
(2)称取20g干粉，按料液比1g∶25mL加入蒸馏水，在80℃下超声15min，超声功率为300W；然后于85℃热水下浸提3h，4000rpm离心15min，得第一沉淀和第一上清液；
(3)在第一沉淀中加入第一次蒸馏水量的50％水，于85℃下浸提2.5h，将提取液4000rpm离心15min；得第二沉淀和第二上清液；
(4)第一上清液和第二上清液于50℃下减压浓缩至原体积的三分之一，得浓缩液；在磁力搅拌器搅拌情况下缓缓将95vt％乙醇溶液加入浓缩液中，乙醇溶液的加入量为浓缩液的4倍体积，静置过夜；4000rpm离心15min，将沉淀冷冻干燥，即得黄柄黄肉牛肝菌粗多糖。
将对比例1和对比例2提取的粗多糖进行上述实施例2的动物实验，并将其结果与实施例1相比。结果主要差异表现在：低剂量组脏器指数均明显低于实施例1(P＜0.05)，低剂量组氨含量均明显高于实施例1(P＜0.05)，对比例1低剂量组的内毒素含量高于实施例1(P＜0.05)。导致以上差异的主要原因可能是不同提取条件下所得粗多糖中多糖含量、结构以及蛋白、黄酮类等其他成分的含量有关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但并不构成对本发明的限定，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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