一种小分子铁皮石斛多糖制备方法及其用途
阅读说明：本技术 一种小分子铁皮石斛多糖制备方法及其用途 (Preparation method and application of micromolecular dendrobium officinale polysaccharide ) 是由 刘光荣 李莉楠 杨凯业 杜志云 林丽 马诗经 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,以铁皮石斛干制品为起始原料,通过低共熔溶剂与亚临界提取,最终得到小分子铁皮石斛多糖。通过该小分子铁皮石斛多糖的制备方法能制备得到分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖,而且分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖还具有纯度高及提取率的优点。该小分子铁皮石斛多糖分子量小于等于50kDa的铁皮石斛多糖分子量小、纯度高,有利于皮肤吸收,能显著改善皮肤免疫屏障功效且具有良好的抗炎功效。(A preparation method of micromolecule Dendrobium officinale polysaccharide comprises taking Dendrobium officinale dry product as initial raw material, and performing eutectic solvent and subcritical extraction to obtain micromolecule Dendrobium officinale polysaccharide. The preparation method of the micromolecule dendrobium candidum polysaccharide can be used for preparing the dendrobium candidum polysaccharide with the molecular weight of less than or equal to 50kD, and the dendrobium candidum polysaccharide with the molecular weight of less than or equal to 50kD also has the advantages of high purity and extraction rate. The dendrobium officinale polysaccharide with the small molecular weight of less than or equal to 50kDa has small molecular weight and high purity, is beneficial to skin absorption, can obviously improve the skin immune barrier effect, and has good anti-inflammatory effect.)
技术领域
本发明涉及天然产物功效成分提取技术领域，特别涉及一种小分子铁皮石斛多糖制备方法及其用途。
背景技术
铁皮石斛为药食同源-兰科石斛属多年附生草本植物，也是2020版《中国药典》收录的石斛品种之一，被誉为“中华九大仙草之首”，全世界范围内的石斛种类约1000种，我国有74种，我国主要产地为浙江、云南、安徽等地，其中以云南种植面积最多。
传统中医及临床医学研究认为铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、增加免疫力、抗肿瘤等功效，已被开发成具有多种功效的药品、功能食品。铁皮石斛中含有多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物等活性成分，在皮肤外科用药及化妆品领域中，铁皮石斛中多糖活性成分因具有保湿、抗氧化、延缓衰老等功效，已经开发出多种功能化妆品，同时铁皮石斛提取物已被收录在2021版化妆品原料目录中，明确其作为化妆品原料用途。
铁皮石斛多糖传统提取方法包括热水提取、酶法提取、超声波提取、微波提取、碱法提取等。其中热水提取、酶法提取方法成本低，对设备要求较低，应用较为广泛。超声波提取、微波提取等方法对设备要求高，碱法提取对多糖结构破坏较大。由于铁皮石斛具有较厚的植物细胞壁，常规提取方法难以直接穿透细胞壁，以释放更多的胞内石斛多糖。而且因为铁皮石斛多糖中含有较多的蛋白质，形成结构紧密的多糖蛋白结构，目前对铁皮石斛多糖去除蛋白方法包括蛋白酶法、Sevage法、三氯乙酸法和硫酸铵沉淀法，其中后三种方法容易造成多糖降解。
研究证实铁皮石斛多糖分子量范围从几千到百万不等，与其提取、分离纯化工艺密切相关，铁皮石斛多糖分子量大小对活性影响较大。现有技术中的工艺制备的铁皮石斛多糖不能满足分子量小、提取率及纯度要求。
因此针对现有技术不足，提供一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法及应用以解决现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的其中一个目的在于避免现有技术不足之处而提供一种小分子铁皮石斛多糖制备方法，该方法可制备高纯度的、分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖,且该制备方法铁皮石斛多糖的提取率高。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法，采用低共熔溶剂结合亚临界方式提取。
本发明的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，向铁皮石斛药渣中加入低共熔溶剂，进行亚临界提取得到初始滤液，再经酶解、洗脱、浓缩、析出得到成品小分子铁皮石斛多糖。
低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为甘油、丙二醇或者丁二醇，氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1～1:5。
本发明的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、向铁皮石斛干制品中依次通入水蒸气、高温蒸汽，然后加入无水乙醇、过滤，得到铁皮石斛药渣；
步骤二、向铁皮石斛药渣中加入低共熔溶剂，进行亚临界提取，然后经过滤、离心得到初始滤液；
步骤三、对初始滤液进行高压均质处理和酶解处理，酶解处理后加热得到多糖酶解液，然后对多糖酶解液超滤，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过离子交换树脂脱色、脱蛋白吸附处理后，得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩得到浓缩液，加入乙醇至浓缩液中析出多糖絮状物，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
优选的，上述步骤一具体是：将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后的铁皮石斛细粉投入提取罐，使用水蒸气对铁皮石斛细粉蒸制处理，然后连续通入高温蒸汽浸湿，降至常温后，加入无水乙醇搅拌后静置，过滤，得到药渣。
优选的，上述步骤二具体是：对步骤一的药渣进行多次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，每次提取完成后过滤收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液。
优选的，上述步骤三具体是：对步骤二的初始滤液进行多次高压均质处理，在最后一次高压均质处理完毕后加入水解酶至初始滤液中酶解，酶解处理后加热得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
优选的，上述步骤四具体是：将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后加入去离子水对D282型离子交换树脂淋洗，得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
进一步的，本发明的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过40目～100目筛得到铁皮石斛细粉，将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理1min～10min，然后连续通入2m/s～30m/s高温蒸汽处理5min～40min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为1倍～15倍的无水乙醇搅拌后静置1h～10h，过滤，得到药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行2次～5次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:10～1:40g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为30％～90％，提取参数为温度为130℃～200℃、压力为2Mpa～4Mpa、时间为10min～120min；
步骤三、对步骤二得到的初始滤液进行2次～5次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为40Mpa～80Mpa、温度为25℃～50℃，每次高压均质处理5min～20min，在最后一次高压均质处理完毕后加入水解酶，水解酶与初始滤液的重量比为0.2％～5.0％，在温度为45℃～65℃下酶解处理0.5h～2h，酶解处理后加热至90℃～105℃下继续处理0.5h～2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液使用相对截留分子量为50kDa超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:10～1:30，流速为0.3BV/h～3.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.5倍～3倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗，得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为55℃～75℃、真空度为-0.2MP～-0.7MPa条件下浓缩至相对密度为1.20～1.50得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至80％～95％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
更进一步的，本发明的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过50目～80目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理3min～8min，然后连续通入5m/s～20m/s高温蒸汽处理10min～30min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为2倍～10倍的无水乙醇搅拌后静置2h～8h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:12～1:30g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％～85％，提取参数为温度为150℃～190℃、压力为2.5Mpa～3.5Mpa、时间为20min～100min；
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为50Mpa～70Mpa、温度为30℃～40℃，每次高压均质处理8min～12min，在最后一次高压均质处理完毕后加入水解酶，水解酶与初始滤液的重量比为0.3％～2.5％，在温度为50℃～60℃下酶解处理0.8h～1.2h，酶解处理后加热至95℃～102℃下继续处理0.8h～1.2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液使用相对截留分子量为50kDa超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:12～1:25，流速为0.4BV/h～2.5BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.8倍～2.5倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为60℃～70℃、真空度为-0.25MP～-0.6MPa条件下浓缩至相对密度为1.25～1.40得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至85％～92％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
优选的，上述水解酶由胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶组成。
在所述步骤一中，加入无水乙醇搅拌后静置，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
在所述步骤五中，向浓缩液加中的乙醇为所述步骤一的回收乙醇。
优选的，上述干燥为冷冻干燥、35℃真空干燥或者35℃鼓风干燥中的至少一种。
优选的，上述小分子铁皮石斛多糖为分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖的纯度大于等于96％。
本发明的一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法，以铁皮石斛干制品为起始原料，通过低共熔溶剂与亚临界提取，最终得到小分子铁皮石斛多糖。通过该小分子铁皮石斛多糖的制备方法能制备得到分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖，而且所制备的分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖纯度高、提取率高。
本发明的第二个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种小分子铁皮石斛多糖在制备铁皮石斛多糖作为改善皮肤免疫屏障有效成分的产品中的用途。该产品能显著改善皮肤免疫屏障。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种小分子铁皮石斛多糖在制备以铁皮石斛多糖作为改善皮肤免疫屏障有效成分的产品中的用途，所述产品为日用化妆品或皮肤外科用药。
本发明的第三个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种小分子铁皮石斛多糖在制备以铁皮石斛多糖作为抗炎有效成分的产品中的用途，所述产品为日用化妆品或皮肤外科用药。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种小分子铁皮石斛多糖在制备铁皮石斛多糖作为抗炎的有效成分的产品中的用途，产品为日用化妆品或皮肤外科用药。
本发明的分子量小于等于50kDa的铁皮石斛多糖分子量小、纯度高，有利于皮肤吸收，能显著改善皮肤免疫屏障功效且具有良好的抗炎功效。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例所采用的原料试剂均为常规购买的原料试剂。
实施例1。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,以铁皮石斛干制品为起始原料，采用低共熔溶剂结合亚临界方式提取。向铁皮石斛药渣中加入低共熔溶剂，进行亚临界提取得到初始滤液，再经酶解、洗脱、浓缩、析出得到成品小分子铁皮石斛多糖。
其中，低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为甘油、丙二醇或者丁二醇，氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1～1:5。
本实施例的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、依次对铁皮石斛干制品通入水蒸气、高温蒸汽，然后加入无水乙醇、过滤，得到铁皮石斛药渣；
步骤二、向铁皮石斛药渣中加入低共熔溶剂，进行亚临界提取，然后经过过滤、离心得到初始滤液；
步骤三、对步骤二得到的初始滤液进行高压均质处理和酶解处理，酶解处理后加热得到多糖酶解液，然后对多糖酶解液超滤，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过离子交换树脂脱色、脱蛋白吸附处理后，得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩得到浓缩液，加入乙醇至浓缩液中析出多糖絮状物，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
与现有技术的单一亚临界提取或者低共熔溶剂提取或者是复合酶辅助低共熔溶剂提取工艺相比，本发明通过亚临界与低共熔溶剂联合提取，得到的铁皮石斛多糖的提取率更高，由于得到的铁皮石斛分子量更小，得到的铁皮石斛多糖溶液粘度降低。
现有技术的汽爆技术在对铁皮石斛细胞破壁过程会产生有毒性物质，而本发明利用高温蒸汽对铁皮石斛细胞破壁，促进细胞内的铁皮石斛多糖溶出及脂溶性成分分散，有助于提高多糖提取率及脂溶性成分脱除。此外，而本发明的制备条件温和，设备简单，因此本发明的工艺更绿色环保。
与现有技术的传统酶提取、强酸水解工艺相比，本发明在高压均质处理下能降低多糖粘度，同时结合酶水解，使大分子量的铁皮石斛多糖水解更加完全，得到的铁皮石斛多糖分子量更小，并且铁皮石斛多糖中蛋白及色素成分的脱除率更高。
本发明的制备方法在步骤一中利用高温蒸汽对铁皮石斛细胞进行破壁，促进细胞内多糖溶出及使脂溶性成分分散，有助于提高多糖提取率及脂溶性成分脱除。本发明在步骤二中通过亚临界与低共熔溶剂联合作用提取铁皮石斛多糖，能够大大提高提取率。本发明在步骤三中使用高压均质降低多糖粘度同时结合酶水解，促进大分子量的铁皮石斛多糖更加完全水解，铁皮石斛多糖溶液粘度降低，从而得到分子量更小的铁皮石斛多糖，使得步骤四中的铁皮石斛多糖中蛋白及色素成分的脱除率更高。
综上所述，本实施例的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，能制得分子量小于等于50kD的小分子铁皮石斛多糖，所得到的小分子铁皮石斛多糖纯度高，而且本发明的方法的提取率高。
实施例2。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后的铁皮石斛细粉投入提取罐，使用水蒸气对铁皮石斛细粉蒸制处理，然后连续通入高温蒸汽浸湿，降至常温后，加入无水乙醇搅拌后静置，过滤，得到药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行多次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，每次提取完成后过滤收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；
步骤三、对步骤二的初始滤液进行多次高压均质处理，在最后一次高压均质处理完毕后加入水解酶至初始滤液中酶解，酶解处理后加热得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后加入去离子水对D282型离子交换树脂淋洗，得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩得到浓缩液，加入乙醇至浓缩液中析出多糖絮状物，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
其中，低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为甘油、丙二醇或者丁二醇。氢键受体和氢键供体的摩尔比优选为1:1～1:5。
本发明的水解酶由胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶组成。按重量份计，水解酶由1份的胰蛋白酶、1份～5份的α-淀粉酶和1份～5份的β-葡聚糖水解酶组成。
干燥可为冷冻干燥、35℃真空干燥或者35℃鼓风干燥中的至少一种。
本实施例的小分子铁皮石斛多糖的制备方法，能制得分子量小于等于50kD的小分子铁皮石斛多糖。且所得到的小分子铁皮石斛多糖纯度大于等于96％，而且本发明的方法的提取率高。
实施例3。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过40目～100目筛得到铁皮石斛细粉，将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理1min～10min，然后连续通入2m/s～30m/s高温蒸汽处理5min～40min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为1倍～15倍的无水乙醇搅拌后静置1h～10h，过滤，得到药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行2次～5次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:10～1:40的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为30％～90％，提取参数为温度为130℃～200℃、压力为2Mpa～4Mpa、时间为10min～120min，料液比单位为g/ml；
步骤三、对步骤二得到的初始滤液进行2次～5次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为40Mpa～80Mpa、温度为25℃～50℃，每次高压均质处理5min～20min，在最后一次高压均质处理完毕后加入水解酶，水解酶与初始滤液的重量比为0.2％～5.0％，在温度为45℃～65℃下酶解处理0.5h～2h，酶解处理后加热至90℃～105℃下继续处理0.5h～2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液使用相对截留分子量为50kDa超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:10～1:30、流速为0.3BV/h～3.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.5倍～3倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗，得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为55℃～75℃、真空度为-0.2MP～-0.7MPa条件下浓缩至相对密度为1.20～1.50得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至80％～95％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
其中在步骤一中，加入无水乙醇搅拌后静置，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。而在步骤五中，向浓缩液加中的乙醇为所述步骤一中的回收乙醇。
本实施例将步骤一回收的回收乙醇作为步骤五的乙醇使用，能降低生产成本。同时通过本实施例得到的小分子铁皮石斛多糖的分子量低且纯度更高，提取率也高。
实施例4。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过50目～80目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理3min～8min，然后连续通入5m/s～20m/s高温蒸汽处理10min～30min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为2倍～10倍的无水乙醇搅拌后静置2h～8h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:12～1:30g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％～85％，提取参数为温度为150℃～190℃、压力为2.5Mpa～3.5Mpa、时间为20min～100min；
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为50Mpa～70Mpa、温度为30℃～40℃，每次高压均质处理8min～12min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为0.3％～2.5％，在温度为50℃～60℃下酶解处理0.8h～1.2h，酶解处理后加热至95℃～102℃下继续处理0.8h～1.2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液使用相对截留分子量为50kDa超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:12～1:25、流速为0.4BV/h～2.5BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.8倍～2.5倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为60℃～70℃、真空度为-0.25MP～-0.6MPa条件下浓缩至相对密度为1.25～1.40得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至85％～92％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
在以实施例1或2的方法所制备得到的小分子铁皮石斛多糖产品样本中，以本实施例的方法制备的出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖的纯度和提取率结果良好。
实施例5。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过60目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理5min，然后连续通入6m/s～18m/s高温蒸汽处理15min～20min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为3倍～8倍的无水乙醇搅拌后静置3h～6h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行5次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为甘油，且两者的摩尔比为1:1。其中，每次按照料液比为1:15～1:25g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为50％～80％，提取参数为温度为160℃～180℃、压力为3.0Mpa、时间为30min～60min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为60Mpa、温度为33℃，每次高压均质处理10min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为0.5％～2.0％，在温度为55℃下酶解处理1h，酶解处理后加热至100℃下继续处理1h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、1份α-淀粉酶和1份的β-葡聚糖水解酶组成。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:15～1:20、流速为0.5BV/h～2.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为1倍～2倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.3MP～-0.5MPa条件下浓缩至相对密度为1.30得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至90％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并冷冻干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
在以实施例1或2的方法所制备得到的小分子铁皮石斛多糖产品样本中，以本实施例的方法制备的出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖的纯度和提取率结果均较佳。
实施例6。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过40目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理1min，然后连续通入30m/s高温蒸汽处理5min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为3倍的无水乙醇搅拌后静置1h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行5次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:10g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为90％，提取参数为温度为130℃、压力为2Mpa、时间为10min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行2次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为40Mpa、温度为25℃，每次高压均质处理5min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为0.2％，在温度为45℃下酶解处理0.5h，酶解处理后加热至90℃下继续处理0.5h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:10，流速为0.3BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.5倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.2MPa条件下浓缩至相对密度为1.50得到浓缩液，向浓缩液加入回收乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至80％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为甘油，且两者的摩尔比为1:3。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、5份α-淀粉酶和5份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为35℃真空干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，甘油购自欧季亚新材料(南京)有限公司，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为95.72％，且铁皮石斛多糖提取率为51.96％。
实施例7。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过100目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理10min，然后连续通入2m/s高温蒸汽处理40min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为15倍的无水乙醇搅拌后静置10h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣；
步骤二、对步骤一的药渣进行3次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:30g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％～30％，提取参数为温度为200℃、压力为4Mpa、时间为120min；
步骤三、对步骤二的初始滤液进行5次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为80Mpa、温度为50℃，每次高压均质处理20min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为5.0％，在温度为65℃下酶解处理2h，酶解处理后加热至105℃下继续处理2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液；
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:30，流速为3.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为3倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液；
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为75℃、真空度为-0.7MPa条件下浓缩至相对密度为1.20得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至95％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丙二醇，且两者的摩尔比为1:5。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、3份α-淀粉酶和2份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为35℃鼓风干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丙二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例纯度为97.29％，且铁皮石斛多糖提取率为54.87％。
实施例8。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过50目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气进行3min蒸制浸湿处理，然后连续通入5m/s高温蒸汽处理10min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为1倍的无水乙醇搅拌后静置2h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集得到初始滤液；其中，每次按照料液比为1:12g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％，其中每次低共熔溶剂的加入量按料液比为1:12，且低共熔溶剂的含水量体积占比40％，提取参数为温度为150℃、压力为2.5Mpa、时间为20min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为50Mpa、温度为30℃，每次高压均质处理8min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为0.3％，在温度为50℃下酶解处理0.8h，酶解处理后加热至95℃下继续处理0.8h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:12，流速为0.4BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为0.8倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为60℃、真空度为-0.25MP条件下浓缩至相对密度为1.25得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至85％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:1。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、3份α-淀粉酶和4份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为35℃鼓风干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例到的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为98.02％，且铁皮石斛多糖提取率为53.65％。
实施例9。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括如下步骤：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过80目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气进行8min蒸制浸湿处理，然后连续通入20m/s高温蒸汽处理30min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为10倍的无水乙醇搅拌后静置8h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:40g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为85％，提取参数为温度为190℃、压力为3.5Mpa、时间为100min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为70Mpa、温度为40℃，每次高压均质处理12min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为2.5％，在温度为60℃下酶解处理1.2h，酶解处理后加热至102℃下继续处理1.2h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:25，流速为2.5BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为2.5倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为55℃、真空度为-0.6MPa条件下浓缩至相对密度为1.40得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至92％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:2。
按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、3份α-淀粉酶和4份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为先进行35℃鼓风干燥后，再进行冷冻干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为96.63％，且铁皮石斛多糖提取率为52.69％。
实施例10。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过90目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理9min，然后连续通入24m/s高温蒸汽处理28min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为4倍的无水乙醇搅拌后静置6h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:11g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为67％，提取参数为温度为187℃、压力为3.3Mpa、时间为52min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行4次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为70Mpa、温度为41℃，每次高压均质处理13min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为1.8％，在温度为58℃下酶解处理1.6h，酶解处理后加热至99℃下继续处理1.8h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:21，流速为2.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为1.3倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.5MPa条件下浓缩至相对密度为1.40得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至84％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:2。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、3份α-淀粉酶和4份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为先进行35℃真空干燥后，再进行冷冻干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为97.11％，且铁皮石斛多糖提取率为53.22％。
实施例11。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过60目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理5.5min，然后连续通入17m/s高温蒸汽处理27min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为7倍的无水乙醇搅拌后静置6h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:21g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为75％，提取参数为温度为182℃、压力为3.1Mpa、时间为50min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为61Mpa、温度为37℃，每次高压均质处理9min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为1.1％，在温度为53℃下酶解处理1h，酶解处理后加热至98℃下继续处理1h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:19，流速为0.9BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为1.2倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为68℃、真空度为-0.4MPa条件下浓缩至相对密度为1.33得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至87％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并35℃真空干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:2。
按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、3份α-淀粉酶和4份的β-葡聚糖水解酶组成。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例得到的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为96.45％，且铁皮石斛多糖提取率为52.31％。
实施例12。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过60目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理5min，然后连续通入12m/s高温蒸汽处理18min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为5倍的无水乙醇搅拌后静置4h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:20g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为60％，提取参数为温度为180℃、压力为3.0Mpa、时间为45min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为60Mpa、温度为35℃，每次高压均质处理10min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为1.0％，在温度为55℃下酶解处理1h，酶解处理后加热至100℃下继续处理1h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:15，流速为1.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为2倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.5MPa条件下浓缩至相对密度为1.30得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至90％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并35℃真空干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丙二醇，且两者的摩尔比为1:4。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、2份α-淀粉酶和1份的β-葡聚糖水解酶组成。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丙二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例得到的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为98.21％，且铁皮石斛多糖提取率为54.26％。且与其他实施例相比，本实施例的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为最高。
实施例13。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过60目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理5min，然后连续通入10m/s高温蒸汽处理20min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为8倍的无水乙醇搅拌后静置3h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:18的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％～65％，提取参数为温度为160℃、压力为3.0Mpa、时间为60min，且料液比单位为g/ml。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为60Mpa、温度为35℃，每次高压均质处理10min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为1.5％，在温度为55℃下酶解处理1h，酶解处理后加热至100℃下继续处理1h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:15，流速为1.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为2倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.5MPa条件下浓缩至相对密度为1.30得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至90％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并冷冻干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:5。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、1份α-淀粉酶和5份的β-葡聚糖水解酶组成。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为98.00％，且铁皮石斛多糖提取率为52.17％。
实施例14。
一种小分子铁皮石斛多糖的制备方法,包括：
步骤一、将铁皮石斛干制品粉碎，粉碎后过60目筛得到铁皮石斛细粉，然后将铁皮石斛细粉投入提取罐，用水蒸气蒸制浸湿处理5min，然后连续通入18m/s高温蒸汽处理15min，降至常温后，加入与铁皮石斛粉质量比为8倍的无水乙醇搅拌后静置3h，过滤，分别得到回收乙醇和药渣。
步骤二、对步骤一的药渣进行2次亚临界提取，每次提取均加入低共熔溶剂，按照亚临界提取参数提取，且每次提取完成后进行过滤并收集提取液，最后合并所有提取液，提取液再通过管式离心机离心收集初始滤液；其中，每次按照料液比为1:25g/ml的比例加入低共熔溶剂，且满足低共熔溶剂的含水量体积占比为40％～80％，提取参数为温度为160℃、压力为3.0Mpa、时间为30min。
步骤三、对步骤二的初始滤液进行3次高压均质处理，其中每次高压均质处理压力为60Mpa、温度为35℃，每次高压均质处理10min，在最后一次高压均质处理完毕后加入为初始滤液的重量比为2.0％，在温度为55℃下酶解处理1h，酶解处理后加热至100℃下继续处理1h得到多糖酶解液，然后将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
步骤四、将步骤三得到的滤过液通过D282型离子交换树脂，以树脂上样径高比为1:20，流速为2.0BV/h的条件进行脱色、脱蛋白吸附处理得到脱色多蛋白液，然后再使用与滤过液体积比为2倍量的去离水对D282型离子交换树脂淋洗得到淋洗液，合并脱色多蛋白液及淋洗液得到洗脱液。
步骤五、对步骤四得到的洗脱液浓缩，在浓缩温度为65℃、真空度为-0.5MPa条件下浓缩至相对密度为1.30得到浓缩液，向浓缩液加入乙醇，将浓缩液中的乙醇浓度调节至90％，然后搅拌至多糖絮状物析出，将多糖絮状物过滤并干燥，得到的小分子铁皮石斛多糖。
其中，本实施例的低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为丁二醇，且两者的摩尔比为1:2。按重量份计，本实施例的水解酶由1份的胰蛋白酶、2份α-淀粉酶和2份的β-葡聚糖水解酶组成。本实施例的干燥具体为冷冻干燥。
本施例的铁皮石斛干制品购自昆明植物研究所，丁二醇购自陶氏化学，D282型离子交换树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司，甜菜碱、胰蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡聚糖水解酶均购自佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。
采用本实施例的方法制备出分子量小于50kDa的小分子铁皮石斛多糖，其中本实施例的分子量小于50kDa铁皮石斛多糖的纯度为96.57％，且铁皮石斛多糖提取率为51.68％。
对比例1
步骤一、取铁皮石斛细粉，直接加入6倍量无水乙醇，充分搅拌后静置4h，加入无水乙醇搅拌后静置，过滤，得到药渣；
步骤二至步骤五与实施例12的步骤二至步骤五相同。
对比例2
步骤一、步骤三、步骤四和步骤五与实施例12相同，其中步骤二为将步骤一的铁皮石斛药渣投入亚临界提取罐中，加入按料液比为1:20g/ml的水，提取温度为180℃、压力为3Mpa、时间为4min，过滤，重复提取1次，弃去滤渣，提取液用管式离心机过滤，收集滤液。
对比例3
步骤一、步骤三、步骤四和步骤五与实施例12相同，步骤二为将步骤一的铁皮石斛药渣投入提取罐中，加入按料液比为1:20g/ml含水量体积占比60％的低共熔溶剂(由甜菜碱、丙二醇按摩尔比1:4组成)，提取温度为100℃，提取60min，过滤，重复提取1次，弃去滤渣，提取液用管式离心机过滤，收集滤液。
对比例4
步骤一、步骤二、步骤四和步骤五与实施例12相同，步骤三为取步骤二的滤液，在60Mpa、35℃条件下高压均质处理10min，循环3次，将多糖溶液使用相对截留分子量为50kDa超滤膜滤过，收集滤过液，备用。
对比例5
步骤一、步骤二、步骤四和步骤五与实施例12相同，步骤三为取步骤二的滤液，加入1.0％水解酶(胰蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖水解酶按重量比为1:2:1)，温度为55℃，酶解处理1h后将温度升至100℃处理1h，将多糖酶解液通过相对截留分子量为50kDa的超滤膜滤过，收集滤过液。
对本发明的实施例6至实施例14得到的铁皮石斛多糖、对比例1至5得到的铁皮石斛多糖进行相关制备过程或者产品脱色率、黏度、脱蛋白率、多糖保留率、多糖提取率、分子纯度测试。
本发明的脱色率测试及计算方法具体如下：
将铁皮石斛多糖溶液在波长为323nm作为检测波长测定铁皮石斛多糖溶液脱色前、后的吸光度。脱色率计算：脱色率(％)＝(脱色前吸光度－脱色后吸光度)/脱色前吸光度×100％。
本发明的黏度测试方法具体是：
采用乌氏粘度计对铁皮石斛多糖进行直接测试，测试操作方案按乌氏粘度操作方法，其中当黏度值越大时，分子量越大。
本发明的脱蛋白率测试及计算方法具体如下：
本发明的蛋白质测试为采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白作标准品，得到标准曲线：y2＝0.0007x2+0.0057，R2＝0.9996。式中：x2为蛋白质含量，y2为吸光度。线性范围为0mg～1.0mg。脱蛋白率计算为：脱蛋白率(％)＝(脱蛋白前蛋白质含量－脱蛋白后蛋白质含量)/脱蛋白前蛋白质含量×100％。
本发明铁皮石斛多糖含量、铁皮石斛多糖提取率及铁皮石斛多糖保留度的测定方法如下：
葡萄糖溶液配制：称取适量葡萄糖标准品，置于105℃烘箱中烘至恒重后，称取100mg葡萄糖标准品，在100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置于4℃冰箱保存备用。
标准曲线绘制：精密移取葡萄糖标准储备液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL置10mL容量瓶，加蒸馏水定容，配制成含葡萄糖0mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL的系列葡萄糖标准溶液。分别移取上述系列葡萄糖标准溶液各1mL，置1mL具塞玻璃试管中，依次加入0.5mL 5wt％苯酚溶液，2.5mL浓硫酸，充分涡旋，冷却至室温，另取1mL蒸馏水，按照上述操作，作为空白对照。将上述溶液分别在490nm波长处测定吸光度值；得回归方程y＝10.25X-0.013，R2＝0.9997，表明葡萄糖标准品在0.00mg/m～0.10mg/mL内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。
将各实施例及对比例的铁皮石斛多糖溶于蒸馏水中，并稀释至一定质量浓度，吸取1mL于具塞试管中，按照标准曲线制作步骤操作，测定吸光度，由标准曲线计算出粗多糖的质量分数，按以下计算公式，多糖提取率(％)＝(CV×稀释倍数)×0.9/M×100。其中C为测得吸光度对应的浓度，V为提取液的体积，0.9为葡萄糖换算成铁皮石斛多糖的正交系数，M为原料质量。
铁皮石斛多糖含量以葡萄糖为标准品，按苯酚硫酸法测试，多糖保留率(％)＝脱除后多糖吸光度值/脱除前多糖吸光度值×100。
本发明的多糖分子量测定方法如下：
采用高效液相色谱联用多角度激光散射对铁皮石斛多糖进行分子量测定。以葡聚糖(dextran)为标准品，色谱条件如下：TSK-GELG5000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm)；流动相为超纯水；进样量为20μL；流速0.6mL/min；柱温30℃。采用2414示差折光检测器和8角度激光散射仪进行检测，检测小于等于50kDa分子量铁皮石斛多糖纯度。
本发明的铁皮石斛多糖对SDS诱导细胞损伤修复作用的测试方法具体如下：
使用到的细胞具体为HaCaT细胞。HaCaT细胞采用完全培养基培养，配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，铺于96孔板内，每孔100μL。置于培养箱37℃、5％CO2条件下培养24h之后，每孔加入浓度50μg.mL-1的SDS溶液，继续培养24h。用移液枪吸除SDS溶液，用完全培养基将残液清洗干净洗净后以200μL/孔分别加入完全培养基(空白对照组)和浓度1000.0μg.mL-1、250.0μg.mL-1、62.5μg.mL-1的铁皮石斛多糖溶液。继续培养24h之后，用完全培养基清洗干净，洗净后每孔加入MTT溶液100μL，置于培养箱培养4h。然后用移液枪吸除MTT溶液后，每孔加入DMSO溶液150μL，将96孔板置于振荡器上中速振荡5min。使用酶联免疫检测仪测量490nm处的吸光度，细胞存活率(X，％)的计算公式为X＝(S-CK)/(YCK-CK)×100％，其中S为试验组吸光度；CK为空白对照组吸光度；YCK为阴性对照组吸光度。
本发明的铁皮石斛多糖对LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)诱导RAW264.7细胞炎症作用测试方法如下：
采用RAW264.7细胞LPS模型进行NO测试，样品为各实施例及对照样品，具体方法如下：
(1)细胞培养：完全培养基培养，加入2mL完全培养基，用细胞刮刀将细胞刮打下来。吹打均匀收集至离心管，1200r/min离心3min。
(2)铺板：按照上述步骤对细胞进行消化重悬，细胞悬液的密度约为5*104个/mL。6孔板每孔加入2mL细胞悬液，即细胞的铺板密度为105个/孔。
(3)加入样品：细胞铺板后约24小时，加入5μg/mL的LPS溶液。吸走6孔板上每个孔的培养基。留1孔作为阴性对照组，其他每孔加入2mL已配置完成的LPS溶液。将6孔板放入培养箱，继续培养24小时。
(4)给药：吸走6孔板每个孔的培养基。除了阴性对照组，留1孔作为模型组，其他孔可按药物数量和给药浓度进行分组，每加入2mL含药的完全培养基。将6孔板放入培养箱，继续培养24小时。吸取50μL上清于96板中，加入格里斯试剂检测NO含量。
(5)测试吸光度：酶标仪540nm波长测吸光值(OD)。
(6)数据处理与计算：将实验所测得吸光值用Excel软件处理，计算不同浓度待测样品处理后细胞的OD值，并以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，计算NO含量。
本发明的实施例6至实施例14得到的铁皮石斛多糖，与对比例1至5得到的铁皮石斛多糖的技术效果对比如表一所示：
表一、铁皮石斛多糖的技术效果对比
从表一可知，本发明的制备方法，如实施例6至实施例14较对比例1至5，在步骤一药渣脱色率、铁皮石斛多糖提取率、步骤四脱色率、脱色脱蛋白、骤四铁皮石斛多糖保留率和分子量方面有明显的优势。
铁皮石斛经过步骤一的处理能将铁皮石斛细胞壁破碎，从而细胞内水溶性的铁皮石斛多糖和脂溶性的色素溶出，而脂溶性的色素又会溶于乙醇中，因此当步骤一药渣的脱色率越高，证明胞壁破碎度越高，水溶性的铁皮石斛多糖和脂溶性的色素的提取率越高，而脂溶性的色素会溶于乙醇，也就是说，药渣的脱色率越高，间接反映了铁皮石斛多糖的提取率。表一中显示，本发明的工艺的脱色率均高于对比例1至5，与未处理的铁皮石斛粉末(对比例1的工艺)脱色率相比，本发明的脱色率最高可以相差1.39倍。
而本发明采用联合亚临界与低共熔溶剂提取工艺及其参数所得的铁皮石斛多糖提取率，明显高于单一亚临界(即对比例2的工艺)或者低共熔溶剂工艺(即对比例3的工艺)，同时也高于采用低共熔溶剂辅助酶法提取工艺(即对比例5的工艺)。表一中，本发明的步骤三的铁皮石斛多糖黏度均在3ηw以下，而对比例的均大于3ηw，铁皮石斛多糖黏度与分子量相关，当铁皮石斛多糖黏度越大时，分子量则越大，因此步骤三的高压均质处理和酶水解结合下，明显能使铁皮石斛多糖的分子量降低。因为本发明步骤三得到的铁皮石斛多糖分子量更小，更有利于从离子交换树脂洗脱下来，所以表一的实施例6至14的步骤四的脱色、脱蛋白、多糖保留率效果均明显高于对比例1至5。
而且表一中，本发明实施例6至14得到的分子量小于等于50kDa的铁皮石斛多糖均在96％以上，其中最高可达98.21％，而对比例最高仅为93.24％，因此本发明的小分子铁皮石斛多糖的制备方法的效果明显更优。
对本发明实施例6至实施例14得到的铁皮石斛多糖、对比例1至5得到的铁皮石斛多糖进行对SDS诱导细胞损伤及LPS诱导NO含量的性能测试。
本发明的实施例6至实施例14得到的铁皮石斛多糖，与对比例1至5得到的铁皮石斛多糖对SDS诱导细胞损伤及LPS诱导NO含量结果对比如表二所示。
表二、铁皮石斛多糖对SDS诱导细胞损伤及LPS诱导NO含量结果对比
实验组
SDS损伤细胞存活率(％)
NO含量(μmol/L)
空白组
101.00±0.12
15.32±1.01
模型组
78.29±1.12<sup>###</sup>
48.45±1.06<sup>###</sup>
实施例6
93.86±1.15<sup>**</sup>
28.12±0.39<sup>**</sup>
实施例7
98.24±0.96<sup>**</sup>
23.96±1.04<sup>***</sup>
实施例8
95.47±0.86<sup>**</sup>
27.37±1.11<sup>***</sup>
实施例9
94.52±1.02<sup>**</sup>
26.58±0.74<sup>***</sup>
实施例10
97.01±1.33<sup>**</sup>
25.62±0.42<sup>***</sup>
实施例11
96.38±0.62<sup>**</sup>
25.33±0.55<sup>***</sup>
实施例12
96.44±0.56<sup>**</sup>
25.76±1.00<sup>***</sup>
实施例13
97.17±1.08<sup>**</sup>
27.33±0.82<sup>***</sup>
实施例14
95.68±0.87<sup>**</sup>
26.57±0.98<sup>***</sup>
对比例1
90.82±1.42<sup>*</sup>
30.36±1.12<sup>*</sup>
对比例2
90.45±1.06<sup>*</sup>
34.98±1.22
对比例3
88.63±1.06
32.71±0.94<sup>*</sup>
对比例4
90.12±0.88<sup>*</sup>
32.39±0.61<sup>*</sup>
对比例5
87.92±1.61
34.52±1.38
注：与空白组相比，模型组#为p＜0.05、##为p＜0.01、###为p＜0.001；与模型组相比，样品组*为p＜0.05、**为p＜0.01、***为p＜0.001。
从表二可知，通过本发明制备方法得到的分子量小于等于50kDa小分子铁皮石斛多糖，相比对比例1至5得到的铁皮石斛多糖能更显著(p＜0.01或p＜0.001)提高SDS诱导细胞的存活率，抑制LPS诱导细胞产生NO分泌，进而有效修复SDS诱导细胞损伤程度以及缓解炎症反应，说明本发明制备的铁皮石斛多糖分子量小，更容易进入细胞，进而调控细胞因子，发挥生物活性功效。
实施例15。
通过实施例6至14制备得到得的小分子铁皮石斛多糖在制备铁皮石斛多糖作为改善皮肤免疫屏障有效成分的产品中的用途，其中产品为日用化妆品或皮肤外科用药。
通过表二可以知，本发明的小分子铁皮石斛多糖可以显著提高SDS诱导细胞的存活率，从而有效修复SDS诱导细胞损伤程度，可用于作为改善皮肤免疫屏障类日用化妆品或皮肤外科用药的有效成分。
实施例16。
通过实施例6至14制备得到得的小分子铁皮石斛多糖在制备铁皮石斛多糖作为抗炎的有效成分的产品中的用途，其中产品为日用化妆品或皮肤外科用药。
通过表二可以知，本发明的分子铁皮石斛多糖制备铁皮石斛多糖作为抗炎的有效成分的产品中可以抑制LPS诱导细胞产生NO分泌，从而缓解炎症反应。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：硒化阳春砂仁多糖及其制备方法和应用