发明内容

本发明目的在于提供一种利用纳米磁珠提取核酸的试剂盒。

本发明的再一目的在于：提供一种上述试剂盒提取核酸的方法，通过提取核酸以达成应用于下游的扩增测序等后续研究的目的。

本发明目的通过以下方案实现：一种用纳米磁珠法提取DNA的试剂盒，包括了裂解液，去抑制剂，洗涤液，洗脱液及生物纳米磁珠，其中：

溶液Ⅰ：由10mM～100mM的Tris-Cl缓冲液,5mM～20mM的乙二胺四乙酸（EDTA）溶剂,0.5%～3.5%的去垢剂，200mM～300mM的胍盐组成；

溶液Ⅱ：由10mM～100mM的Tris-Cl，5mM～10mM的EDTA组成；

溶液Ⅲ：由质量浓度不低于75%的高纯度乙醇组成；

溶液Ⅳ：超纯水/去离子水；

所述的生物纳米磁珠为储存于NaCl缓冲溶液中的硅羟基纳米磁珠悬浮液。

其中，优选的，所述的Tris-Cl,EDTA溶剂为pH值≈7.4。

优选的，所述羟基纳米磁珠悬浮液为硅羟基超顺磁性纳米磁珠，四氧化三铁磁核，平均粒径1μm，储存于NaCl缓冲溶液中。

进一步的，所述的纳米磁珠悬浮液的浓度为25mg/ml。

所述的溶液Ⅰ中，所述胍盐为盐酸胍，所述去抑制剂为蛋白酶k，所述去垢剂为十二烷基硫酸钠（SDS）和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton x-100）。

所述的溶液Ⅲ中，质量浓度不低于75%乙醇可选用无水乙醇代替，乙醇与磁珠悬浮混合溶液的体积比应为3:1。

本发明提供了一种利用上述试剂盒提取DNA的方法，包含以下步骤：

1）将起裂解作用的溶液Ⅰ与去抑制剂，核糖核酸载体Carrier RNA和生物纳米磁珠悬浮液、待提取样品反应，在加热并得到充分裂解之后使磁珠与核酸吸附结合；

2）使用溶液Ⅱ、Ⅲ清洗混合吸附溶液，分离需要洗脱的蛋白，多糖杂质；

3）使用溶液Ⅳ清洗并使核酸脱离吸附，得到纯化后的样品。

进一步的，本发明提取方法中，搭配生物纳米磁珠使用磁力装置，以促使磁珠与液体吸附悬浮。

优选的，所使用的磁力装置为简易磁力架，用来放置样本与磁珠结合的缓冲溶液，辅助吸附分离清洗过程。

使用上述试剂盒提取DNA，配套溶液包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ和硅羟基纳米磁珠悬浮液和搭配磁珠使用的磁力装置，按如下步骤：

步骤一.在1.5ml离心管中加入20-500μL的样本以及100-500μL的溶液Ⅰ，20-100μL去抑制剂，1-5μL Carrier RNA和10-30μL硅羟基纳米磁珠悬浮液，轻微震荡混匀后，置于55-60℃温浴10-30分钟；

步骤二. 往离心管加入250-500μL溶液Ⅱ，充分混匀，将试管静置于磁力架上，放置2-3分钟，待磁珠与核酸吸附，吸弃上清液；

步骤三. 往离心管加入150-500μL溶液Ⅲ，轻微震荡混匀，静置于磁力架上2-3分钟，吸弃上清液； 和/或者，

步骤四：加入溶液Ⅲ，并重复上述步骤三；

步骤五：加入50-150μL溶液Ⅳ，混匀并简易离心后，于55-60℃温浴10-20分钟，再置于磁力架上，静置2-3分钟，吸取溶液，弃磁珠，得成品，妥善储存成品核酸。

本发明原理：溶液Ⅰ中，裂解液含有：Tris-Cl的缓冲体系可以为破膜后较为脆弱的核酸基础结构提供一个稳定的溶液环境，以确保成品核酸的纯度及完整性；EDTA为二价离子螯合剂，螯合二价金属阳离子如Mg²⁺、Ca²⁺等，以防止激发或促进RNA酶的活性，通过抑制这些裂解酶从而达到最大化保护核酸的效果；Triton X-100及SDS这些常见的非离子与阴离子型去垢剂，盐酸胍，配合蛋白酶K，能有效强力的破坏蛋白质结构使其变性，让核酸与其充分的分离开来，使核酸脱离蛋白质结构包裹被释放出，再在浓盐环境中配合表面硅基氧化的生物纳米磁珠吸附保留核酸的方法，将其他多余杂质如多糖、脂质等一步步沉淀洗脱。

本发明包含的试剂均为常规条件下可以购买、制备并储存的化学试剂，无剧烈毒性会对人体形成危害或含有潜在泄露风险，包含纳米磁珠在内均易于运输，并储存于2-8℃的环境中；通过简易步骤可以大量提取细胞/细菌中的DNA，可直接应用于下游的多种后续实验，包括但不限于PCR/q-RTPCR/LAMP/测序/构建文库等等，为核酸提取步骤的简化提供了一种新思路。

本发明利用磁珠法具有操作简便、且适用范围广的优点，用处理过的生物纳米磁珠在特定溶液环境中对核酸进行高特异性的吸附与结合，以便于裂解和分离蛋白质、多糖等生物大分子结构的杂质，从而提升结果核酸产物的产出及纯度。本发明的试剂盒适用于短片段DNA ，且具有简易，安全，成本廉价等优点。