具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明实施例数据处理：试验数据用平均值±标准差表示，通过SPSS软件的两样本均值比较进行t检验分析差异显著性。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

实施例1奶山羊的试验设计与饲养管理

选取同胎次(2胎次)、泌乳天数相近(30±5d)、体重相同或相近，健康状况良好的奶山羊40只，随机分为两组(对照组和试验组)，每组20只羊，对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮的基础上添加5g/d的尼克酰胺(NAM)。试验饲粮设计参考NRC(2007)山羊饲养标准，基础饲粮组成及营养成分如表1、表2所示。整个试验期为60天，其中预试期10天，正试期50天。试验在南阳市西峡县某个体奶山羊养殖场进行。

试验开始前对试验羊进行防疫、驱虫，清扫试验圈舍并消毒，之后将2组试验羊分别饲养在2个独立的圈舍内。每天饲喂两次。所有羊只自由饮水，自由活动。

表1基础饲粮组成(干物质基础)

注：①预混料为每千克日粮提供VA 20000IU，VB₅ 25.74mg，VD 30000IU，VE5000IU，Fe 56mg，Mn 31mg，Zn 92.5mg，Cu 30mg，I 1.25mg，Se 1.00mg。

表2营养成分水平(干物质基础)

注：②营养水平各项中消化能为计算值，其余各项均为实测值。

实施例2 NAM对奶山羊产奶量、乳成分及乳脂肪酸含量的影响

(1)产奶量

试验期内每日早晚挤奶2次，每次挤奶后记录产奶量数据。

实验开始时对照组与试验组的奶山羊产奶量差异不显著，属于正常个体间产奶性状的差异。随着试验的进行，奶山羊由泌乳前期进入泌乳盛期，其产奶量在试验结束时均比实验开始时有所增长。结果显示，日粮添加NAM组奶山羊产奶量显著高于对照组(P<0.05，表3)。说明在日粮中添加尼克酰胺能显著提高奶山羊的产奶量，可提高奶山羊的经济效益。

表3 NAM对奶山羊产奶量的影响

注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无标注表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

(2)乳成分

试验期结束时对所有试验羊采集1次乳样，于早晚各采集20mL制成混合样准备检测，收集全部试验羊样本40个，送至河南省奶牛生产性能测定中心，分析乳糖率、乳脂率、乳蛋白率等乳成分指标。

由表4可知，添加NAM组奶山羊乳成分中乳脂率显著高于对照组(P<0.05)；乳糖、乳蛋白和干物质则没有明显变化(P>0.05)。

表4 NAM对奶山羊乳成分的影响

(3)乳脂肪酸

试验期结束时对所有试验羊采集1次乳样，于早晚各采集20mL制成混合样进行脂肪酸提取和测定。

羊奶中脂肪酸的提取方法为：将采集的奶样放入30℃水浴锅中孵育20分钟，然后在20℃条件下以17800g的离心力离心30分钟，离心后将上层脂肪转移至2mL离心管中，19300g离心20分钟；取10mL玻璃管吸取离心管中80μL的上层油状液体于其中，并加入5mL正己烷，摇匀混合；再向其中加入0.2mL甲酯化试剂(100mL甲醇中溶解11.2g KOH)，密封涡旋震荡1分钟后室温静置30分钟；然后添加0.5g无水硫酸钠，350g离心3分钟；吸取1mL上清液于2mL的色谱瓶中，用于气相色谱测定。气相色谱法确定脂肪酸成分后用面积归一法计算出羊奶中的各种脂肪酸含量。

由表5可知，试验组与对照组相比，羊奶中脂肪酸C4:0、C16:0和C18:1的含量显著提高(P<0.05)，其它脂肪酸的含量无明显变化(P＞0.05)。结果表明，本发明在日粮中添加NAM具有改善羊奶脂肪酸组成的作用，提高了羊奶易于消化吸收脂肪酸的组成及有益脂肪酸的含量。

表5日粮添加NAM对羊奶脂肪酸组成的影响

实施例3不同浓度的NAM对SIRT1和乳脂合成转录因子表达的影响

为研究NAM影响羊奶乳脂率的作用机制及NAM在细胞水平上对脂质代谢的影响，分别用不同浓度的NAM(0,100,300,500μmol/L)处理奶山羊乳腺上皮细胞。

(1)细胞培养与处理

采用胰酶消化法从奶山羊乳腺组织分离奶山羊乳腺上皮细胞，通过高密度接种法进行传代培养，采用含10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10ng/mL表皮生长因子、5μg/mL氢化可得松和5μg/mL胰岛素的DMEM/F12细胞培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，更换新鲜培养基，倒置显微镜下观察细胞汇合度达90％以上时，即可进行传代培养。将细胞接种于12孔培养板中，培养至细胞汇合度达60％～70％时，分别添加含有0μmol/L(对照)、100μmol/L、300μmol/L、500μmol/L的NAM诱导培养基，培养48h后收集细胞，用于后续实验检测乳脂合成相关基因的表达，从而确定最佳的处理浓度。

(2)细胞总RNA的提取与cDNA的合成

NAM处理48h后，收集细胞，采用北京天根生化科技有限公司细胞/组织总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按照说明书进行操作。RNA样品用紫外分光光度计(NANODROP2000)测定RNA样品A260 nm/A280 nm吸收比率值，检测浓度大于200ng/μL及纯度为1.8～2.0时为合格样品，以提取的RNA为模板，按照Takara公司反转录试剂盒说明书步骤，将所有检测合格的RNA反转录成cDNA。

(3)实时荧光定量PCR

乳脂合成基因及内参基因实时定量引物见表6，根据GenBank已公布的山羊基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件分别设计特异实时荧光定量引物，采用跨内含子的方法，每对定量引物的上、下游引物分布在不同的外显子上，扩增产物长度约200bp大小，各引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

试验以GAPDH和UXT基因作为内参进行实时荧光定量PCR反应。PCR反应体系20μL：荧光定量PCR反应混合物(2×SYBR Premix Ex Taq Mix)10.0μL，cDNA模板1.0μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，加无RNA酶的H₂O补足体系。于ABI 7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环；添加熔解曲线。采用2^－△△Ct法对数据进行分析，其中△Ct＝Ct_目的基因-Ct_内参；△△Ct＝△Ct_试验组-△Ct_对照组。每个样品设置3个重复。

表6实时定量引物序列

结果发现，300μmol/L的NAM下调了沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)和FoxO1的mRNA表达，而100μmol/L的NAM对SIRT1和FOXO1表达没有影响，500μmol/L的NAM对FOXO1表达无显著影响(图1A)；100μmol/L和300μmol/L的NAM对乳脂关键调控因子PPARγ显著上调(P<0.05)(图1B)，从而判断300μmol/L为最适浓度。用300μmol/L的NAM处理细胞，发现脂肪酸合酶FASN和脂肪酸去饱和酶SCD1表达量显著上调(P<0.05)，脂解基因ATGL表达显著下调(P<0.05)(图2)。

实施例4 NAM对乳腺细胞甘油三酯和脂肪酸合成的影响

(1)甘油三酯(TAG)含量测定

用300μmol/L的NAM处理奶山羊乳腺上皮细胞48h，用0.25％胰蛋白酶/EDTA混合液消化并收集细胞沉淀，用PBS清洗沉淀2遍，再将细胞转移至1.5mL离心管中，每管加入200μL的PBS后将细胞超声破碎，按照细胞甘油三酯酶法检测试剂盒给出的操作方法检测细胞内甘油三酯的含量，取适量裂解液70℃水浴加热10min，室温下2000r/min离心5min，保留上清用于酶学测定，将10μL上清液与190μL工作液37℃反应10min，用全自动酶标仪于550nm波长处测吸光度(D_550nm)。

(2)油红O染色

细胞用NAM处理48h后，弃去培养基，用PBS清洗两遍；10％中性甲醛加入到培养板上，固定细胞45min；每孔细胞加入1mL油红O染色30min；最后用PBS清洗3遍，于倒置显微镜下进行观察拍照。

(3)细胞中脂肪酸测定

将乳腺上皮细胞培养于60mm的细胞培养皿，NAM处理48h后，弃去培养基，PBS冲洗后，用0.25％的胰蛋白酶/EDTA混合液消化并收集细胞沉淀于8mL的玻璃管内，加入2mL体积比为0.25％硫酸/甲醇溶液，超声处理10min后，80℃孵育1h，温度降至室温后，加入0.1mol/L的盐酸溶液2mL及正己烷800μL后，漩涡震荡30s，900g离心5min后，收集上清至2mL硅化玻璃管内，加入0.5g无水硫酸钠吸收多余的水分，放置12～14h，震荡后13800g离心3min，吸取上清，用GC-MS气质联用色谱仪分析测定细胞中脂肪酸成分，C19:0脂肪酸作为测定标准品。各种脂肪酸的相对比例以该种脂肪酸峰面积所占的百分比来计算，每个处理设置3个生物学重复。

结果发现，尼克酰胺处理细胞后，细胞中甘油三酯含量显著增加(P<0.05)(图3A)，油红O染色显示脂滴积累增加(图3B)，细胞中脂肪酸C16:0和C18:1比例显著增多(P<0.05，图4B,4D)，而细胞中C14:0和C18:0的比例没有显著变化(图4A,4C)。综合以上结果表明，尼克酰胺可促进奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成，改变乳腺细胞中有益脂肪酸含量，这些数据为进一步改善羊奶脂肪酸组成及营养价值和风味提供基础资料。

实施例5 SIRT1介导NAM对FASN基因转录调控

(1)FASN基因启动子的克隆与结构分析

前面的研究发现NAM在细胞水平改变乳脂合成和乳脂肪酸组成，为深入研究SIRT1介导的NAM对细胞中脂肪酸组成的调控机制，我们对脂肪酸合成关键酶FASN启动子进行克隆，研究NAM对FASN的转录调控机制。

利用PCR方法得到奶山羊FASN启动子序列。经NCBI中核酸序列比对发现，FASN基因启动子序列与牛、人、小鼠同源性达到90％以上。经转录因子在线软件预测分析发现，FASN启动子核心区域有多个特征性启动子元件和潜在的转录因子结合位点，如:CAAT box、TATAbox、GC-box、E-box，转录因子AP2、sp1、NF-Y及两个SREBP1的结合位点(SRE)(图5)。结合前期的研究发现，SREBP1调控FASN启动子的转录。

(2)SIRT1介导NAM对FASN启动子活性的影响

用SIRT1抑制剂(NAM)处理细胞，同时转染FASN启动子荧光素酶报告基因载体，采用双荧光素酶系统检测FASN启动子活性。

荧光素酶活性检测：细胞转染FASN启动子重组质粒48h后，收集细胞，按照Promega双报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定，弃去培养液，PBS洗涤两次，每孔加20μL细胞裂解液，室温孵育20min。吸取20μL裂解液于96孔白板中，加入LARⅡ100μL，快速混匀后立即在多功能微孔板发光仪上进行pGL3荧光素酶活性检测(F值)；再加入100μL 1×Stop&Glo溶液检测pRL-TK荧光素酶活性(R值)。计算F值/R值，即相对荧光素酶活性，用来表示启动子的相对转录活性。

实验结果表明：NAM处理后FASN启动子活性显著上升(P＜0.05)(图6)。

(3)SREBP1介导NAM对FASN启动子活性的影响

为研究SREBP1在SIRT1介导的NAM调控FASN转录中的作用，分别对FASN启动子上的SRE1、SRE2位点进行定点突变，构建重组载体转染细胞，检测突变前后FASN启动子活性的变化情况。采用重叠延伸PCR法进行定点突变，定点突变引物信息如表7：

表7定点突变引物

注：其中斜体为酶切位点，粗体为突变位点。

突变片段连接荧光素酶报告基因载体，并进行测序确认突变成功(图7)。

结果发现，SRE位点突变后FASN启动子活性明显下降(P＜0.05)(图8)。然而，用NAM处理细胞发现，NAM显著增加FASN野生型启动子活性(P＜0.05)，而对SRE1和SRE2突变型启动子活性则没有影响(图9)。

这些结果可明确SIRT1介导NAM通过调控SREBP1，进而调节奶山羊FASN基因启动子活性，为改善羊奶脂肪酸组成和羊奶风味提供理论依据。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南牧业经济学院

<120> 尼克酰胺在改善泌乳期奶山羊乳成分中的应用

<130> 基因转录调控

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

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