具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，并且它们都属于本发明保护的范围。

在整个申请中，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明提供了本发明提供了一种具有聚集诱导发光特征的立体异构体，其特征在于，所述立体异构体的结构通式为E异构体：

或R异构体，

其中，X选自甲氧基、烷氧基、羟基、乙基磷酸、烷基磷酸、磷酸、氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡啶、咪唑和巯基中的任意一种；

R和R’是与一种或多种荧光团偶联的具有不同结构的一种或多种荧光发色团，R选自氢、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-N-氯代丁二酰亚胺(NCS)、烷基-叠氮(-N₃)和烷基-氨基(-NH₂)中的任意一种；R’选自氢、卤原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-N-氯代丁二酰亚胺(NCS)、烷基-叠氮(-N₃)和烷基-氨基(-NH₂)中的任意一种；R优选为氢；R’优选为氢，更优选为卤原子；n为1、2、3、4、5、6、7、8或9。

如本文所用，“卤素”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基的例子包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基、己基等。在各种实施方案中，烷基可以具有1至40个碳原子(即C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即C1-30烷基)。在一些实施例中，烷基可以具有1至6个碳原子，并且可以被称为“低级烷基”。低级烷基的例子包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可以如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、烯基或炔基取代。

如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，包括例如氮、氧、硅、硫、磷和硒。

如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环体系或多环体系，其中两个或多个芳族烃环稠合在一起(即具有共同的键)，或者至少一个芳族单环烃环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环上。芳基在其环系统中可以具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可以包括多个稠环。在一些实施方案中，多环芳基可以具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以共价连接到所定义的化学结构上。仅具有芳族碳环的芳基的例子包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、并五苯基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环上的多环环体系的例子包括环戊烷的苯并衍生物(即茚满基，它是5，6-双环环烷基/芳环体系)、环己烷(即四氢萘基，它是6，6-双环环烷基/芳环体系)、咪唑啉(即苯并咪唑基，它是5，6-双环环杂烷基/芳环体系)和吡喃(即芳基的其它例子包括苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可以如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可以具有一个或多个卤素取代基，并且可以被称为“卤代芳基”。全卤代芳基，即所有氢原子被卤素原子(如-C₆F₅)取代的芳基，包括在“卤代芳基”的定义中。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代，并且可以被称为联芳基。联芳基中的每个芳基可以如本文所公开的那样被取代。

如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的环杂原子的芳族单环体系，或其中存在于环体系中的至少一个环是芳族的并且含有至少一个环杂原子的多环体系。多环杂芳基包括具有两个或多个稠合在一起的杂芳基环的那些，以及具有至少一个稠合到一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环上的单环杂芳基环的那些。杂芳基整体上可以具有例如5至24个环原子，并且包含1至5个环杂原子(即，5至20元杂芳基)。杂芳基可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子上连接到所定义的化学结构上。通常，杂芳基环不含氧、硫或硫键。然而，杂芳基中的一个或多个氮或硫原子可以被氧化(例如吡啶氮氧化物噻吩硫氧化物、噻吩硫、二氧化硫)。杂芳基的例子包括，例如，如下所示的5或6元单环和5-6元双环系统:其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH₂、SiH(烷基)、Si(烷基)₂、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)₂或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的例子包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹喔唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基杂芳基的进一步例子包括4，5，6，7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可以如本文所述被取代。

另一方面，本发明提供了一种具有聚集诱导发光特征的立体异构体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：在有机溶剂的存在下，向第一反应原料和NaH的混合物中滴加第二反应原料，并将反应混合物在惰性气体环境下搅拌或加热回流，得到粗产物；其中，所述第一反应原料为4-甲氧基二苯甲酮或4-(二甲基氨基)二苯甲酮所述第二反应原料的化学结构式为：

其中R’选自氢、卤原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-N-氯代丁二酰亚胺(NCS)、烷基-叠氮(-N₃)和烷基-氨基(-NH₂)中的任意一种，优选为氢，更优选为卤原子；

(2)将所述粗产物分离纯化得到纯化产物，将所述纯化产物通过高效液相色谱进一步分离所述立体异构体。

根据所述制备方法获得的E/Z-TPAN-OM可以通过进一步加入三溴化硼合成E/Z-TPAN-OH，而在E/Z-TPAN-OH中进一步加入包括三乙胺的二氯甲烷可以得到E/Z-TPAN-POE，最后向E/Z-TPAN-POE中加入三甲基溴硅烷可以得到E/Z-TPAN-POH。通过上述简单的合成方法可以大规模的制备一系列基于三苯基乙烯基元构建的E/Z异构体。

现有的聚集诱导发光分子由于极性差异很小无法通过普通的C18反向柱直接分离E/Z异构体，而在应用中使用直接制备的E/Z异构体的混合物，会导致对这些分子的性质和功能的折衷。本发明中的E/Z异构体则可以通过配有C18反向柱的高效液相色谱法(HPLC)简单地进行分离，将根据上述方法制备的粗产物过滤并蒸发溶剂后，使用正己烷-二氯甲烷M作为洗脱剂通过硅胶柱分离纯化得到纯化产物，将所述纯化产物溶解在乙腈中，通过配置C18反相柱的HPLC，使用乙腈/水＝85:15(体积比)作为洗脱剂便可以进一步分离E/Z异构体。

聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)是指由在无定形或结晶(固体)状态下聚集时表现出发光显著增强的化合物表现出的现象，而在稀溶液中它们表现出微弱或几乎没有发射。AIE材料在固态或者高浓度态下有强发光特性、灵敏度高和抗光漂白强等优势。本发明所述的立体异构体都表现出特异的聚集诱导发光(AIE)性质，并且每对E/Z异构体中的一个异构体显示强荧光发射，而另一个异构体几乎不发射荧光。发明人经研究发现，在一些实施方案中，当取代基X选自甲氧基或烷氧基时，Z异构体不发光，而E异构体发光，如实施例中的结果所示。相对地，在另一些实施方案中，当取代基X选自羟基、乙基磷酸、烷基磷酸、磷酸、氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡啶、咪唑和巯基时，Z异构体发光，而E异构体不发光。这是因为在发光的异构体中，晶体排列都更紧密，分子间的孔隙更小，从而导致分子运动受限，从而发出荧光。反之，在不发光的异构体中，晶体排列都更松散，分子间的孔隙更大，从而导致分子运动受限程度更小，从而不能发出荧光。

进一步地，所述E/Z异构体在紫外线照射下还可以进行相互转化，这种转化是是双向的，即E异构体可以转化为Z异构体，Z异构体也可以转化为E异构体。为了控制转化的方向，起始物就必须是纯E构型或者纯Z构型，因此能够获得稳定的纯E异构体或Z异构体十分重要。

在检测传感方面，利用所述E/Z异构体的上述性质，可以成功实现荧光“点亮”型(“turn-on”或“light-up”)生物和化学传感系统。所述点亮型生物成像的对象包括各种细胞器、细胞(如癌细胞和正常细胞)、微生物(如细菌和真菌)以及组织，并能实现长效追踪。因此，本发明提供的立体异构体可以单独地或与其他成分结合用于多种荧光探针、荧光染料、药物组合物或试剂盒等。

另一方面，所述E/Z异构体还表现出不同的生物医学活性，例如酶促反应和细胞毒性。

由于细胞对E/Z-TPAN-OM和E/Z-TPAN-OH的摄取相对有限，难以验证验证其生物医学活性，因此发明人进一步设计了用磷酸基团修饰的E/Z-TPAN-POH，以改善其水溶性并赋予其酶催化响应性。磷酸基团是碱性磷酸酶(ALP)的底物，在细胞信号通路中起着重要作用，并已成为癌症诊断中的重要生物标志物。在一些实施方案中，通过HPLC检测ALP催化的E/Z-TPAN-POH水解可以发现E型异构体的酶识别和反应更快，与ALP的亲和力也更高。在一些实施方案中，所述E/Z异构体可以与蛋白酶(包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等)反应，从而可以水解多肽链中氨基酸残基之间的肽键、水解酶(磷酸酶、脂肪酶、糖基化酶等)以及生物系统中存在的其他响应性生物分子。

受E/Z-TPAN-POH在ALP酶促反应方面的巨大差异的启发，发明人对它们在癌细胞毒性方面进行了进一步研究。因为在生化和代谢过程异常的情况下，癌细胞中ALP的表达水平通常被上调。在一些实施方案中，发明人发现E/Z异构体在细胞毒性方面表现出巨大差异，例如一个异构体对癌细胞表现出强烈毒性，而另一个异构体则对这些癌细胞表现出较好的生物相容性，例如，当取代基X选自乙基磷酸、烷基磷酸或磷酸时，Z异构体显示出明显毒性，而E异构体相对地与细胞相容性更高。这一毒性差异在多种类型的癌细胞(包括人宫颈癌细胞(HeLa)、人肾腺癌细胞(ACHN)、人骨肉瘤细胞(HOS、SJSA-1和抗药性U2R)以及人肝癌细胞(HepG2)得到进一步证实，其主要是由于在不同的细胞摄取速度和在癌细胞中的积累造成的。

E/Z异构体在毒性上的差异可以用对比强烈的荧光信号加以区分因此，本发明提供的立体异构体也为药物筛选和治疗评估提供了潜在的工具。

实施例

实验材料

二甲基亚砜(DMSO，99.7％)、碱性磷酸酶(ALP，来源于小牛肠道)、亚乙基二氯亚磷酸酯(97％)、氢化钠(NaH，含量60％分散在矿物油中的分散体)、三甲基溴硅烷(TMSBr，97％)和苯乙腈(98％)购自Sigma-Aldrich。4-溴苯基乙腈(98％)、三乙胺(TEA，99.8％)、二乙醇胺(DEA，98％)、4-甲氧基二苯甲酮(97％)、4-甲基二苯甲酮(97％)、甲苯、4-(二甲氨基)二苯甲酮(98％)、氯仿(CHCl3)、甲苯、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙腈(CH₃CN)、正己烷、三溴化硼(BBr₃，1.0摩尔/升储存于二氯甲烷溶液中)和乙酸乙酯购自J&K。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自Thermo Scientific(HyClone)。其他化合物购自AIEgen Biotech。所有试剂和溶剂均为分析纯级别。二氯甲烷(DCM)、甲苯和四氢呋喃(THF)在内的溶剂均经过蒸馏处理。癌细胞系包括人宫颈癌细胞(HeLa)、人肾腺癌细胞(ACHN)、人骨肉瘤细胞(HOS，SJSA-1和抗药性U2R)和人肝癌细胞(HepG2)从中国典型培养物中心(CCTCC)购买。通过Milli-Q Direct-8净化系统(Millipore公司)制备超纯水(18.2MΩ.cm)。

实验方法

1.1立体异构体的性质表征

使用Horiba FluoroLog-3荧光分光光度计测量荧光(FL)光谱和固体绝对量子产率。时间分辨瞬态发光光谱(TRPL)：使用飞秒(fs)激光激发样品，并使用时间相关单光子计数(TCSPC)模块(PicoHarp300)和SPAD检测器(IDQ，id100)测量TRPL衰减动力学信号，其时间响应在100皮秒(ps)以内。使用FLS-980荧光光谱仪(Edinburgh)记录随温度变化的荧光发射光谱。使用Hamamatsu光谱仪(C11347 Quantaurus)测量绝对荧光量子产率。使用Shimadzu UV-2550分光光度计(Shimadzu Co，Kyoto，Japan)测量紫外—可见光谱。在不同体积比的二甲基亚砜和氯仿混合溶剂中测量TVP-S的聚集诱导发光荧光曲线，其中每组包含10微摩尔/升的AIEgen，并在460nm激发光下收集荧光光谱。用MicroRaman光谱仪(InVia，Renishaw)在632nm激光激发下收集在1平方厘米(cm²)硅片上经干燥处理的细胞提取物的拉曼光谱，其信号采集曝光时间为10秒(s)。将20微升的样品分别分散在覆盖有连续碳膜的3.0毫米尺寸的铜网上，并在室温下干燥后，在80千伏电压下通过Tecnai G2 20(FEI，美国)透射电镜上进行透射电子显微镜(TEM)成像观测。

1.2 Z/E-TPAN-POH在ALP催化下的水解反应

在二乙醇胺缓冲液(DEA，10毫摩尔/升，pH 9.8，含0.1毫摩尔/升的氯化镁)中用ALP(1.05nM)水解100微摩尔/升的Z/E-TPAN-POH，将混合物于37℃孵育不同的时间。水解过程通过配备C18反相柱的半制备型高效液相色谱(HPLC)(Agilent 1260infinite II)实时监测，洗脱速率＝10毫升/分钟，乙腈/水＝85:15(体积比)。

1.3癌细胞的培养

在带有通风口盖(Corning)的25平方厘米(cm²)细胞培养板上，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基来培养癌细胞。所有细胞均在37℃并且含二氧化碳(CO₂，5％浓度)的潮湿培养箱中生长。使用0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)溶液将细胞从培养皿底部解离。然后将等份细胞接种在96孔板中，并在含胎牛血清的细胞培养基中继续生长所需的时间。

1.4细菌培养，成像和实时跟踪

在细胞的荧光成像中，将100微升的癌细胞(每孔1.0×10⁴个细胞)接种在96孔板(Corning)中。于37℃并且含5％CO₂的条件下孵育过夜后，将细胞用1倍的磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)洗涤一次。将100微升含有不同量化合物的DMEM培养基添加到每个孔中，并在37℃并且含二氧化碳(CO₂，5％浓度)的潮湿培养箱中孵育所需的时间。用1×PBS洗涤两次后，在具有40倍(40×)物镜的Olympus IX 71倒置荧光显微镜上拍摄荧光图像。

1.5体外抗菌测定

通过溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)测定法测量细胞活性。将癌细胞以5.0×10³细胞/孔的密度接种到96孔板中，并与不同浓度的E/Z-TPAN-POH和E/Z-TPAN-OH孵育指定的时间。然后加入MTT(5.0mg/mL，20μL)，将细胞于37℃和5％的CO₂的条件下再孵育4小时。然后加入150μL DMSO，轻轻摇动10分钟以溶解沉淀物。用酶标仪(Bio-Rad)在570nm的波长处测量吸光度。通过将样品孔的吸光度相对于对照孔的吸光度标准化来获得细胞活性，并表示为百分比，将未处理的细胞的活性指定为100％。与不同的异构体孵育后，在具有20倍物镜的Olympus IX 71倒置荧光显微镜上拍摄细胞的明场图片。为了对异构体的细胞摄取进行HPLC定量，收集了4×10⁶个细胞，并用2.0mL浓度为10％的硝酸消化4小时。然后用5.0mL氯仿提取细胞内容物。蒸发后，通过溶解在乙腈/水混合溶剂中(体积比为50/50)将样品校准至500μL。在洗脱比＝10mL/min，乙腈/水＝85/15(体积比)的条件下进行HPLC洗脱，并在310nm处检测到信号。

实施例1.立体异构体的合成

1.Z/E-TPAN-M的合成

向4-甲基二苯甲酮(500mg，2.55mmol)和NaH(122.4mg，5.1mmol)的混合物中加入甲苯(60mL)。然后用冰水浴将混合物冷却至0℃。于0℃逐滴加入溶于THF(20mL)中的苯乙腈(320μL，2.78mmol)。将反应混合物恢复至室温，并在氮气环境下搅拌2小时。通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。将溶剂蒸发产生的残余物溶解在乙醚中。过滤并蒸发溶剂后，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，使用正己烷-二氯甲烷混合溶剂作为洗脱剂，得到白色粉末。尝试通过改变洗脱条件通过高效液相色谱分离产物。但是，使用配置C18反相色谱柱的HPLC无法分离异构体。对于混合物：¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.46-7.43(m，5H)，7.38-7.36(m，2H)，7.30-7.17(m，16H)，7.03-6.99(m，4H)，6.91-6.89(m，2H)，2.42(m，3H)，2.31(m，3H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：140.7，140.2，139.2，137.6，136.1，135.1，135.0，130.9，130.0，129.9，129.8，129.7，129.2，128.9，128.5，128.4，128.2，120.4，120.3，111.0，110.9，21.5，21.3。

2.Z/E-TPAN-OM的合成

真空处理30分钟后，向4-甲氧基二苯甲酮(500mg，2.36mmol)和NaH(114mg，4.44mmol)的混合物中添加THF(60mL)。然后在0℃下滴加溶于THF(20mL)的苯乙腈(300μL，2.61mmol)。将反应混合物升至室温，并在氮气环境下加热至回流12小时。通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。过滤并蒸发溶剂后，将获得的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，使用1:1正己烷-二氯甲烷作为洗脱剂，得到黄色粗产物。最后将粗产物溶解在乙腈中，在洗脱速率＝10mL/min和乙腈/水＝85:15(体积比)的条件下，通过配置C18反相柱的HPLC进一步分离Z/E-TPAN-OM异构体。Z-TPAN-OM和E-TPAN-OM的收集时间分别设置为10.15分钟至10.60分钟和9.50分钟至9.90分钟。对于Z-TPAN-OM，通过单晶测量确定结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.41-7.38(m，2H)，7.24-7.19(m，3H)，7.15-7.12(m，5H)，6.99-6.98(m，2H)，6.91-6.88(m，2H)，3.78(s，3H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：161.1，157.6，139.4，135.2，132.7，131.8，131.0，129.8，129.1，128.5，128.3，128.2，120.8，113.9，110.0，55.4；HRMS(EI)：对于C₂₂H₁₇NO[M+H]⁺计算值：312.1383；实测值：312.1383。然后通过单晶测量确定E-TPAN-OM的结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.44-7.43(m，5H)，7.31-7.29(m，2H)，7.26-7.23(m，2H)，6.94-6.91(m，2H)，6.71-6.69(m，2H)，3.77(s，3H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：160.2，157.5，140.7，135.2，132.6，131.2，130.1，129.8，129.7，128.6，128.4，128.2，120.5，113.6，110.3，55.2；HRMS(EI)：对于C₂₂H₁₇NO[M+H]⁺计算值：312.1383；实测值：312.1383。

3.Z-TPAN-OH的合成

在冰浴中，于0℃向化合物Z-TPAN-OM(300mg，0.96mmol)的干燥二氯甲烷溶液(40mL)中缓慢加入三溴化硼(1.92mL，1.92mmol)。将混合物于室温搅拌12小时。用甲醇淬灭反应，并将混合物用二氯甲烷萃取。将收集的有机层经无水硫酸钠干燥。然后浓缩粗产物，并在硅胶柱上使用二氯甲烷作为洗脱剂纯化。获得的Z-TPAN-OH为灰色固体(248mg，0.83mmol)，产率为86.5％，并且通过单晶测量确定其结构。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：7.30-7.24(m，3H)，7.21-7.18(m，7H)，7.02-6.99(m，2H)，6.84-6.82(m，2H)；¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：159.3，158.7，139.4，135.4，131.4，131.3，130.7，129.4，128.6，128.1，127.8，120.2，114.8，108.9；HRMS(EI，Bruker Apex IV FTMS)：对于C₂₁H₁₅NO[M+H]⁺计算值：298.1226；实测值：298.1226。

4.E-TPAN-OH的合成，

将起始原料更改为E-TPAN-OM，合成方法和反应条件与上述Z-TPAN-OH的合成的相同。获得浅黄色的E-TPAN-OH固体(260mg，0.87mmol)，产率为90.6％，并且通过单晶测量确定E-TPAN-OH的结构。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：7.43-7.42(m，5H)，7.30-7.26(m，5H)；6.82-6.79(m，2H)，6.60-6.57(m，2H)；¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：158.6，140.9，135.5，132.4，129.7，129.6，129.4，129.3，128.3，128.1，127.9，120.0，114.6，109.2；HRMS(EI，Bruker Apex IV FTMS)：对于C₂₁H₁₅NO[M+H]⁺计算值：298.1226；实测值：298.1226

5.Z-TPAN-POE的合成

向Z-TPAN-OH(200mg，0.67mmol)的混合物中加入无水二氯甲烷(15mL)，其中包括三乙胺(TEA，150μL)。然后用冰水浴将混合物冷却至0℃。然后逐滴加入氯代亚磷酸二乙酯(138mg，0.80mmol)。将反应混合物升至室温，并在氮气环境下搅拌2小时。通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。过滤并蒸发溶剂后，将获得的粗产物通过硅胶柱分离纯化，使用正己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，得到灰色粉末，产率为67.2％(196mg，0.45mmol)，通过单晶测量确定获得的Z-TPAN-POE结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.7.46-7.43(m，2H)，7.28-7.19(m，10H)，7.00-6.98(m，2H)，4.29-4.21(m，4H)，1.40-1.36(m，6H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：156.0，151.3，151.1，138.2，136.4，134.1，131.0，130.2，129.0，128.5，127.9，127.8，127.7，119.4，119.3，110.9，64.2，64.1，15.5，15.4；³¹P NMR(200MHz，CDCl₃)：δ＝-6.80；HRMS(EI，Bruker Apex IV FTMS)：对于C₂₅H₂₄NO₄P[M+H]⁺计算值：434.1516；实测值：434.1516。

6.E-TPAN-POE的合成

将起始原料改为E-TPAN-OH，合成方法和反应条件与上述Z-TPAN-POE的合成相同。获得白色固体(178mg，0.41mmol)形式的E-TPAN-POE，产率为61.2％，并且通过单晶测量确定其结构。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.45-7.43(m，5H)，7.28-7.22(m，5H)；7.06-7.04(m，2H)，6.99-6.97(m，2H)，4.23-4.15(m，4H)，1.35-1.31(m，6H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：156.0，150.5，139.5，135.0，134.1，131.8，129.4，129.3，129.0，128.0，127.9，119.4，119.2，119.1，111.1，64.1，15.5，15.4；³¹P NMR(200MHz，CDCl₃)：δ＝-6.81；HRMS(EI，Bruker Apex IV FTMS)：对于C₂₅H₂₄NO₄P[M^±]计算值：433.1443；实测值：433.1443。

7.Z-TPAN-POH的合成

在室温下，向Z-TPAN-POE(100mg，0.23mmol)的无水二氯甲烷(10mL)溶液中滴加三甲基溴硅烷(80μL，0.61mmol)。将反应混合物于室温在氮气环境中搅拌24小时，并用甲醇(2mL)淬灭反应。将反应混合物于室温搅拌30分钟后，减压蒸馏除去溶剂。将反应混合物分散在乙酸乙酯(1mL)中。将沉淀出的产物过滤并收集，得到灰色固体，产率为78.3％(67.9mg，0.18mmol)，并且通过单晶测量确定Z-TPAN-POH的结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：7.45-7.43(m，2H)，7.32-7.19(m，10H)，7.02-7.00(m，2H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：157.0，130.4，129.8，128.7，128.2，127.6，127.5，127.3，119.3，118.9，110.3；³¹P NMR(200MHz，CD₃OD)：δ＝-5.37；HRMS(EI，BrukerApex IV FTMS)：对于C₂₁H₁₆NO₄P[M+Na]⁺计算值：400.0709；实测值：400.0709。

8.E-TPAN-POH的合成

将起始原料改为E-TPAN-POE，合成方法和反应条件与上述Z-TPAN-POH的合成相同。获得的E-TPAN-POH为灰色固体(60.4mg，0.16mmol)，产率为69.6％，并且通过单晶测量确定其结构。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：7.47-7.45(m，5H)，7.28-7.24(m，5H)，7.06-6.97(m，4H)；¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)，δ(ppm)：159.1，142.0，136.4，135.9，133.4，131.0，130.8，129.8，129.6，121.1，112.5；³¹P NMR(200MHz，CD₃OD)：δ＝-6.01；HRMS(EI，BrukerApex IV FTMS)：对于C₂₁H₁₆NO₄P[M+Na]⁺计算值：400.0709；实测值：400.0709。

9.Z/E-TPAN-NM的合成

真空处理30分钟后，向4-(二甲基氨基)二苯甲酮(500mg，2.22mmol)和NaH(107mg，4.44mmol)的混合物中加入甲苯(60mL)。然后于0℃滴加溶于甲苯(20mL)的苯乙腈(280μL，2.44mmol)。将反应混合物升至室温，并在氮气环境中加热至回流12小时。通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。过滤并蒸发溶剂后，将获得的粗产物通过硅胶柱分离纯化，使用1：1正己烷—二氯甲烷M作为洗脱剂，得到黄色粗产物。最后将粗产物溶解在乙腈中，并在洗脱速率＝10mL/min和乙腈/水＝85∶15的条件下，通过配置C18反相柱的HPLC进一步分离Z/E-TPAN-NM异构体。Z-TPAN-NM和E-TPAN-NM的收集时间分别设置为12.6-13.2分钟和11.5-12.1分钟。对于Z-TPAN-NM，通过单晶测量确定结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.37-7.35(m，2H)，7.23-7.14(m，8H)，7.06-7.03(m，2H)，6.69-6.67(m，2H)，3.02(s，6H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：158.3，151.5，139.8，135.8，131.7，131.2，129.8，128.7，128.3，128.0，127.6，127.4，121.5，111.1，107.3，40.1；HRMS(EI)：对于C₂₃H₂₀N₂[M+H]⁺计算值：325.1699；实测值：325.1699。对于E-TPAN-NM：¹H NMR(BrukerAvance，400MHz，CDCl₃)：7.41-7.34(m，7H)，7.27-7.21(m，3H)，6.85-6.82(m，2H)，6.44-6.42(m，2H)，2.93(s，6H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：158.1，150.6，141.3，132.7，130.3，129.6，128.5，128.3，127.8，125.8，121.2，110.9，107.9，40.0；HRMS(EI)：对于C₂₃H₂₀N₂[M+H]⁺计算值：325.1699；实测值：325.1699。

10.Z/E-TPAN-NMBr的合成

真空处理30分钟后，向4-(二甲基氨基)二苯甲酮(500mg，2.22mmol)和NaH(107mg，4.44mmol)的混合物中添加甲苯(60mL)。然后于0℃逐滴加入溶于甲苯(20mL)中的4-溴苯基乙腈(478mg，2.44mmol)。将反应混合物升至室温，并在氮气环境下加热至回流12小时。然后通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。过滤并蒸发溶剂后，将获得的粗产物通过硅胶柱分离纯化，使用1：1正己烷—二氯甲烷作为洗脱剂，得到黄色粗产物。将粗产物溶解在乙腈中，并且在洗脱速率＝10mL/min和乙腈/水＝85∶15的条件下，通过配置C18反相柱的HPLC进一步分离Z/E-TPAN-NMBr异构体。将Z-TPAN-NMBr和E-TPAN-NMBr的收集时间分别设为16.8-18.0分钟和15.0-16.2分钟。对于Z-TPAN-NMBr，通过单晶测量确定结构。¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.36-7.34(m，2H)，7.30-7.26(m，2H)，7.23-7.19(m，2H)，7.09-7.02(m，4H)，6.68-6.66(m，2H)，3.03(s，6H)；¹³C NMR(Bruker Avance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：158.9，151.6，139.5，134.8，131.7，131.4，131.3，131.1，129.0，128.2，127.0，121.6，121.1，111.1，105.8，40.1；HRMS(EI)：对于C₂₃H₁₉BrN₂[M+H]⁺计算值：403.0804；实测值：403.0804。对于E-TPAN-NMBr：¹H NMR(Bruker Avance，400MHz，CDCl₃)：7.38-7.37(m，7H)，7.26-7.22(m，2H)，6.84-6.82(m，2H)，6.47-6.45(m，2H)，2.96(s，6H)；¹³C NMR(BrukerAvance，100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：158.8，150.8，141.0，135.0，132.7，131.7，131.2，130.3，129.8，128.3，125.4，121.7，120.8，111.0，106.5，40.0；HRMS(EI)：对于C₂₃H₁₉BrN₂[M+H]⁺计算值：403.0804；实测值：403.0804。

实施例2.立体异构体的分离

为了获得可用于性质研究的纯化的立体异构体，首先对E/Z-TPAN-M混合物进行异构体分离，该混合物具有两个明显的甲基质子核磁共振(NMR)峰(2.41ppm和2.28ppm)。然而无论在高效液相色谱(HPLC)中采用哪种比例的洗脱溶剂，普通的C18反向柱都无法分离出两种异构体。在分子结构中增加电子给体基团后，洗脱时间出现明显的差异。因此使用乙腈/水＝15/85(体积比v/v)以每分钟10毫升(10mL/min)的速率对含有甲氧基的异构体对(E/Z-TPAN-OM)进行洗脱，并且在280纳米(nm)处检测信号，E/Z-TPAN-OM可以被轻松分离(图2)。与现有的异构体需要在很大程度上扩展其分子结构以进行分离相比，具有简单结构的E/Z-TPAN-OM异构体将受益于其简便有效的合成方法和多样化的结构后修饰。纯化的E/Z-TPAN-OM异构体结构通过核磁氢谱(¹H NMR)和核磁碳谱(¹³C NMR)，高分辨率质谱(HRMS)以及X射线单晶衍射等方法来进行表征。值得注意的是，在Z和E-TPAN-OM的¹H NMR谱中，甲基中的质子共振分别出现在3.86ppm和3.77ppm处。Z和E异构体芳香族质子化学位移也显示出明显的差异，分别位于7.02ppm–7.00ppm(区域1)和6.71ppm–6.68ppm(区域2)(图3)。这些显着差异可用于其结构确认并观测其异构体转化过程。因为它们可以在非常温和的条件下合成，E/Z-TPAN-OH，E/Z-TPAN-POE和E/Z-TPAN-POH等在内的异构体衍生物继承了其前体异构体的立体几何构型(图1)。因此，无需进一步分离便可以获得纯化的异构体。通过上述测量也证实了它们的纯度和几何构型。

实施例3.立体异构体的表征

立体异构体的成功纯化使研究其各自的光学性质成为可能。在溶液状态下，E/Z-TPAN-POH异构体在紫外波段具有相似的吸收波长，最大吸收均在332nm(图4)。令人惊讶的是，立体异构体在DMSO或水中的AIE曲线显示出巨大的差异，在99.5％的水含量下，Z-TPAN-OM和E-TPAN-OM的发射强度分别提高了0.5倍和30倍(图5)。TEM图像清楚地显示了它们在聚集形态上的差异，其中E-TPAN-OM倾向于形成规则的棒状形状，在99.5％的水含量时甚至排列成二维平面中。相反，Z-TPAN-OM无法形成规则的形态。由于溶液状态的显着差异，固态下立体异构体的性质被进一步研究。如图6a所示，与溶液状态的E/Z-TPAN-OM异构体相比，两种异构体在固态下均显示出红移的吸收光谱，表明形成了更平面的构象。另外，E异构体发生较大的红移，可能是由于其相对较强的供体-受体(D-A)结构。荧光性质方面再次，E/Z-TPAN-OM异构体在荧光量子产率上存在显着差异，其中E-TPAN-OM量子产率高达21.8％，而Z异构体几乎不发光(图6b，图6c)。E异构体的荧光寿命长达938皮秒(ps)，是Z异构体的近4倍，进一步证明了E-TPAN-OM中更高的辐射跃迁效率。当E/Z-TPAN-OM冷却至低温(CT，77K)时，它们都发出强烈的荧光，但发光颜色分别为绿色和蓝色。低温(CT，77K)下E/Z-TPAN-OM荧光强度的显着增强可归因于较高程度的分子内运动限制，从而证明E/Z-TPAN-OM均为典型的具有AIE特征的发光分子(图6d)。

实施例4.E/Z-TPAN-OM的异构化过程以及在点亮型生物成像中的应用

由于甲基和芳族区域中的质子显示出明显的化学位移差别，因此首先采用核磁法监测E/Z-TPAN-OM异构化过程。将装有E/Z-TPAN-OM的氘代氯仿溶液的石英管置于室温下365nm紫外光照射下。如图7a所示，经辐照后的Z-TPAN-OM样品(表示为甲基的4区和芳香族区的3区)中出现了E-TPAN-OM特征质子的共振，表明了其结构转化的发生。与其对应的异构体，在紫外辐射下也实现了E-TPAN-OM向Z型异构体的转变，其中出现了区域1和区域2中Z型异构体的特征性质子共振。相反，即使在7天后，在自然光下存储的样品的核磁谱也基本没有发生变化，表明E/Z-TPAN-OM在溶液状态下的稳定性。由于E/Z-TPAN-OM的洗脱时间不同，因此异构化过程也可以通过HPLC进行监控。如图7b所示，紫外光照射后区域5和区域6中出现的峰可以分别指认为新生成的E/Z-TPAN-OM，因为它们位于与原始异构体相同的洗脱位置。延长辐照时间导致E异构体的峰强度急剧下降，同时Z异构体的峰强度增加，反之亦然。辐射150分钟后，Z与E异构体的比例约为1.14，接近平衡值。此外，洗脱时间较长的新鲜峰(7区)可以指认为极性较小的光环副产物。理论计算表明，溶液中E/Z-TPAN-OM异构体的光化学经历了两条衰变途径，分子内环化与E/Z异构化。与上述实验数据一致，溶液中的环化路径对E异构体的作用比对Z的更有利。该过程类似于先前报道的光环化，该光环化通常发生在由芳环构成的AIE系统中。

由于E/Z-TPAN-OM能够彼此异构化，因此不发光的Z-TPAN-OM有望通过转换为发光的E型异构体而应用于点亮型生物成像。将人宫颈癌细胞(HeLa)与Z-TPAN-OM中共孵育，分别在汞灯照射0分钟时和照射2分钟后进行荧光成像。如图8所示，在与Z异构体一起孵育后，在细胞膜外没有明显的聚集发生。由于Z-TPAN-OM具有固有的不发光性质，因此无法在显微镜下检测到荧光信号。令人惊讶的是，在汞灯照射2分钟后，HeLa细胞被绿色荧光信号点亮。蓝色荧光可能源自伴随Z-TPAN-OM异构化过程的光环化产物。如果不与Z-TPAN-OM一起孵育，则对照细胞中始终不会出现荧光信号，这表明发光的荧光信号确实起源于异构化过程。另一方面，当将E-TPAN-OM与活细胞一起孵育时，杆状聚集体在培养基中迅速形成，并且难以进入细胞，绿色荧光仅来自细胞外膜。E-TPAN-OM的这种快速聚集方式与TEM图片记录的现象非常吻合。使用Z-TPAN-OM进行的点亮型细胞成像的动态过程显示，绿色荧光强度仅在2分钟照射后就达到了平稳状态，表明其在活细胞中的快速响应能力。此外，可以在空间尺度下精确地操作发光成像，而荧光信号仅在照射下的区域产生。与先前报道的光环化激活的开启荧光互补，光异构化过程提供了另一种策略来实现超分辨生物成像。

实施例5.立体异构体的酶促反应

由于细胞对E/Z-TPAN-OM和E/Z-TPAN-OH的摄取相对有限，因此发明人进一步设计了用磷酸基团修饰的E/Z-TPAN-POH，以改善其水溶性并赋予其酶催化响应性。E/Z-TPAN-POH异构体保留了它们各自的前体的立体结构，通过测量晶体，分别收集E/Z-TPAN-OM，E/Z-TPAN-OH，E/Z-TPAN-POE，Z-TPAN-NM，Z-TPAN-NMBr的绝对荧光量子产率。通过测量固体粉末分别收集非晶态的其他异构体的荧光量子产率，它们显示出迥异的荧光量子产率(表1)。由于E/Z-TPAN-POH及其水解产物E/Z-TPAN-OH(图10a)以不同的时间尺度洗脱，因此ALP催化的E/Z-TPAN-POH水解可通过HPLC进行定量监测。如图10b所示，随着反应的进行，Z-TPAN-POH的峰强度连续降低，伴随着与Z-TPAN-OH相同的洗脱时间的产物的峰强度增加。同样，E-TPAN-POH的水解也导致其峰强度明显降低，E-TPAN-OH的产量增加。重要的是，E-TPAN-POH的水解速率比Z对应的水解速率快近4.2倍，这表明结构上的细微差别可以导致其酶识别和反应方面的巨大差异(图10c)。为了深入了解E/Z-TPAN-POH与ALP的结合方式，发明人对ALP的结构进行了分子亲和力研究(图11)。高于三倍的结合能差异证明，ALP与E-TPAN-POH在其活性位点的结合亲和力比与Z型异构体强得多。立体异构体在酶促反应上的巨大差异类似于已知的药物，例如与反式对应物相比，顺铂对癌症靶标表现出显著的活性。

表1.固态立体异构体的晶体堆积中的空隙体积(V_V)和荧光量子产率(Φ_F)

*ND：无检测信号。

实施例6.立体异构体的细胞毒性

受E/Z-TPAN-POH在ALP酶促反应方面的巨大差异的启发，发明人对它们在癌细胞毒性方面进行了进一步研究。如图12所示，在与HeLa细胞孵育2小时后，E/Z-TPAN-POH表现出明显的毒性。当浓度达到300μM时，Z-TPAN-POH的细胞存活率迅速降至0。形成鲜明对比的是，对于E异构体，细胞活性却保持近100％。这种细胞毒性还与孵育时间相关。当时间延长至12小时后，Z异构体的毒性变得更加明显，因为200μM的Z异构体可以完全杀死细胞。然而，在800μM的浓度下，E异构体的细胞活性仍保持在70％以上。与Z-TPAN-POH孵育后破坏的细胞形态和与E-TPAN-POH对应的完整细胞形态也证明了毒性的强烈差异，进一步证实了异构体在细胞毒性方面的巨大差异(图13和14)。细胞毒性和E/Z构型之间的这种相关性不仅在HeLa细胞中得到了证实，而且在许多其他癌细胞系中也得到了证实，包括人类肾腺癌细胞(ACHN)、人类骨肉瘤细胞(HOS，SJSA-1和耐药U2R)和人类肝癌细胞(HepG2)。如图12b-图12f所示，所述细胞在与Z-TPAN-POH孵育后均显示出惊人的毒性，但与E异构体具有良好的生物相容性，这表明E/Z-TPAN-POH对癌细胞具有不同毒性的总体趋势相同。与Z异构体孵育后，所有细胞系中普遍发生的明显细胞形态变化进一步证实了细胞死亡的命运。

为了研究毒性差异的根源，发明人首先测试了酶水解产物E/Z-TPAN-OH的毒性。与HeLa细胞孵育后，E/Z-TPAN-OH的毒性均无明显差异。接下来评估细胞摄取量，如图15所示，Z-TPAN-OH孵育的HeLa细胞发出的强烈荧光信号几乎出现在每个细胞单元中。但是，对于E-TPAN-OH，即使在汞灯下照射10分钟后也几乎观察不到荧光信号(图16)。用Z-TPAN-POH孵育的细胞在2220cm^-1处的独特拉曼峰(可以归因于腈键(C≡N))显示出比E-TPAN-POH孵育的细胞更强的强度(图17)。在用Z-TPAN-POH培养的HeLa细胞所提取的内容物的HPLC洗脱图中，Z-TPAN-POH前体和Z-TPAN-OH产物的信号更强，进一步证实了与E异构体相比，Z异构体表现出更快的吸收速率和显著的抗癌作用(图18)。同时因为Z-TPAN-POH在ALP酶促水解反应中较慢的速度，其在癌细胞中的大量积累将进一步导致严重的细胞毒性。立体异构体导致的细胞毒性差异表明，Z-TPAN-POH的毒性来源于其更快的细胞摄取速度和在癌细胞中的大量积累。