一种增强免疫调节和抗氧化活性的硒化金樱子多糖及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种增强免疫调节和抗氧化活性的硒化金樱子多糖及其制备方法与应用 (Selenized cherokee rose fruit polysaccharide for enhancing immunoregulation and antioxidant activity, and preparation method and application thereof ) 是由 吴晖 詹麒平 董洲 赖富饶 贺萍 王倩 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种增强免疫调节和抗氧化活性的硒化金樱子多糖及其制备方法与应用。该方法为：取金樱子果肉为原料,经过粉碎、脱脂、水提取、脱色、Sevag法除蛋白、醇沉、透析和干燥后即得金樱子粗多糖,经阴离子交换层析0-0.5M梯度NaCl洗脱后和凝胶渗透层析分离出金樱子酸性多糖,经HNO-(3)-Na-(2)SeO-(3)法,调节pH、离心、透析、冻干后即得；当浓度200μg/mL时,与空白对照相比,RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO能力分别显著提高；并且显著提高其抗氧化能力,在其浓度为3mg/mL时红细胞溶血抑制率可达94.25％,显著抑制AAPH诱导的氧化损伤,保护红细胞维持正常的细胞形态。(The invention discloses a selenized cherokee rose fruit polysaccharide for enhancing immunoregulation and antioxidant activity and a preparation method thereofA preparation method and application. The method comprises the following steps: collecting fructus Rosae Laevigatae pulp as raw material, pulverizing, defatting, extracting with water, decolorizing, removing protein by Sevag method, precipitating with ethanol, dialyzing, and drying to obtain fructus Rosae Laevigatae crude polysaccharide, eluting with 0-0.5M gradient NaCl by anion exchange chromatography, separating with gel permeation chromatography to obtain fructus Rosae Laevigatae acidic polysaccharide, and HNO 3 ‑Na 2 SeO 3 The method comprises the steps of adjusting pH, centrifuging, dialyzing and freeze-drying; when the concentration is 200 mug/mL, compared with a blank control, the TNF-alpha, IL-6 and NO secretion capacities of RAW264.7 cells are respectively and obviously improved; and the oxidation resistance of the red blood cell is obviously improved, the hemolysis inhibition rate of the red blood cell can reach 94.25% when the concentration of the red blood cell is 3mg/mL, the oxidation damage induced by AAPH is obviously inhibited, and the red blood cell is protected to maintain normal cell morphology.)
技术背景
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有免疫调节和抗氧化(抗红细胞溶血)活性的硒化金樱子多糖及其制备方法。
背景技术
金樱子广泛分布于我国陕西、安徽、江西、江苏、浙江、湖北、湖南、广东、广西、台湾、福建、四川、云南、贵州等地。樱子果实可做利尿剂、镇咳剂、也可用于皮肤肿瘤、烧烫伤、神经衰弱、高血压、神经性头痛、慢性肾炎等的治疗。其中发挥主要作用的是金樱子黄酮，生物碱类和多糖类。目前，关于金樱子的研究主要集中在金樱子中的小分子物质，而作为其主要成分之一的多糖则鲜有报道。
从天然植物中提取的多糖由于具有较好的生物活性受到越来越多人的关注，如抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用，尤其是免疫调节和抗氧化活性使其在食品和医药中得到广泛应用。硒作为一种维持人体健康的重要的微量营养元素，不能在人体内合成，只能从食物中获取。中国营养学会推荐的成年人日硒摄入量为60-250ug，但我国三分之二地区人口的日硒摄入量低于最低推荐摄入量，严重的硒缺乏现象在中国特别突出。当饮食中摄入的硒不足时，能够引起各种硒缺乏相关疾病，例如克山病、糖尿病、肿瘤、免疫缺陷以及心脑血管疾病。因此，提高硒摄入能够有效降低患硒缺乏相关疾病的风险。硒主要以无机硒(亚硒酸、亚硒酸钠等)和有机硒(硒化氨基酸、硒化多糖等)形式存在。无机硒由于高毒性，严重限制了其应用，然而有机硒则具有高生物可用度、毒性小等优点，极大的拓展了硒的工业化应用前景。
硒多糖因兼具硒与多糖的生理活性，且更易于机体吸收利用。大量研究证实相对无机硒、多糖或无机硒和多糖的混合物，硒化多糖具有更好的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血糖和清除自由基的能力，因此在食品和医药中具有更加广泛的应用前景。植物硒多糖是人体摄入硒的主要来源，但由于环境及地域因素，植物中天然硒多糖较少，当多糖与硒共轨结合后可以获得硒化多糖，因此通过化学法合成硒多糖成为学者研究的热点问题。本发明在此基础上提出一种具有增强免疫调节和抗氧化活性的硒化金樱子酸性多糖的制备方法。
发明内容
本发明目的是为了提供一种经济高效的具有免疫调节和抗氧化(抗红细胞溶血)活性的硒化金樱子酸性多糖及其制备方法，拓展其作为抗氧化剂、免疫调节剂以及补硒食品等的应用；本发明所得的硒化金樱子多糖当浓度200μg/mL时，与空白对照相比，RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO能力分别显著提高449.19％、703.38％和485.01％；并且显著提高其抗氧化能力，在其浓度为3mg/mL时红细胞溶血抑制率可达94.25％，显著抑制AAPH诱导的氧化损伤，保护红细胞维持正常的细胞形态。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种具有免疫调节和抗氧化活性硒化金樱子酸性多糖的制备方法，取金樱子果肉为原料，经过粉碎、脱脂、95℃水提取、脱色、Sevag法除蛋白、醇沉、透析和干燥后，经DEAE-Sepharose阴离子交换层析0-0.5M梯度NaCl洗脱后和SephadexG100凝胶渗透层析分离纯化出金樱子酸性多糖，经HNO3-Na2SeO3法，透析冻干后得到具有免疫调节和抗氧化活性的硒化金樱子酸性多糖。
优选的，该方法包括如下步骤：
(1)金樱子多糖的提取：向过筛后的脱脂金樱子果肉粉碎物中加入水，在95℃下搅拌，离心，收集上清液浓缩后采用D101大孔树脂进行脱色处理，脱色后添加用Sevage试剂除蛋白，收集上层清液加入无水乙醇，静置，离心，获得的沉淀加入适量蒸馏水复溶、透析、冻干燥，得到金樱子粗多糖。
(2)分离纯化：将步骤(1)中得到的金樱子粗多糖用水溶解，然后加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中，用洗脱液进行梯度洗脱，苯酚硫酸法追踪在490nm波长下有吸收峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥，0-0.5M NaCl连续洗脱条件下得到组分呈现高而尖的吸收峰，因此用该组分继续分离纯化。向用0.5M NaCl洗脱得到的组分中加入水，加入装填了Sephadex G100填料的层析柱中，用超纯水洗脱，在490nm波长下共有1个吸收峰，收集并冻干后，此组分为金樱子酸性多糖成品。
(3)HNO3-Na2SeO3法硒化金樱子酸性多糖：
将步骤(2)中得到的金樱子酸性多糖用稀HNO3室温搅拌0.5h溶解，加入Na2SeO3，避光、隔绝氧，70℃水浴搅拌，放冷至室温，用Na2CO3调节pH至7-8后，离心，上清液用1000Da透析袋截留透析至透析液电导率低于2ppm，收集并冻干后，得到硒化金樱子酸性多糖成品。
采用红外吸收光谱对比金樱子多糖和硒化金樱子多糖的结构，并对两者的活性进行比较，得到具有更强活性的硒化金樱子多糖。
进一步的，步骤(1)所述脱脂金樱子果肉粉碎物与水的质量体积比为1g:10mL～1g:30mL。
进一步的，步骤(1)所述搅拌的时间为1～3h；所述离心是4000～6000r/min室温离心10～20min。
进一步的，步骤(1)中，所述D101大孔树脂与上清液的体积比为1:2～1:3，摇床可使用任意型号的摇床，所述摇床的转速为160-180r/min，脱色时间1-2h。
进一步的，步骤(1)中，收集上清液浓缩后添加5～10倍体积的无水乙醇。
进一步的，步骤(1)所述静置是在4～8℃下静置8～12h。
进一步的，步骤(1)中，获得的沉淀用3～5倍体积Sevage试剂收集上层清液，重复3～5次。
进一步的，步骤(2)中，按5g:1mL～10g:1mL的比例用水溶解金樱子粗多糖；所述梯度洗脱用0-0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速1.0～2mL/min，10min/管。
进一步的，步骤(2)中，将用0.5M NaCl洗脱得到的组分按5g:1ml～10g:1ml的比例加入水，加入装填了Sephadex G100填料的层析柱，加样体积1～2mL，再用超纯水洗脱，洗脱流速0.5～1.0mL/min，5min/管。
进一步的，步骤(3)中，金樱子酸性多糖为500mg，HNO3的体积为50mL，质量分数为0.4-0.6％，Na2SeO3为300～500mg，搅拌时间为6-8h。
进一步的，步骤(3)中，所述离心是4000～6000r/min室温离心10～20min。
上述方法中，步骤(3)所述进行活性评价：包括免疫活性分析(巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子TNF-α、IL-6和NO的能力)及抗氧化(抗红细胞溶血)能力分析。
进一步的，上述方法中，除所提到的超纯水为指定水外，其它溶液配制所用的水可以是蒸馏水，也可以是超纯水。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用D101大孔树脂对金樱子粗多糖进行脱色，脱色效果高于90％并且多糖损失率低，多糖纯度由53％提升至85％以上，并且D101大孔树脂价格便宜，极大的节约了生产成本。
(2)本发明操作简单，生产成本低，适合工业化生产，与传统的生物硒转化或硒化后直接乙醇沉淀的有机产品相比，生产时效短，并且有效的避免了产品中无机硒残留所带来的安全隐患。
(3)本发明制备的硒化金樱子酸性多糖与原多糖相比，显著增强了原多糖免疫和抗氧化活性，可以将其添加到具有增强免疫调节、抗氧化(抗红细胞溶血)和补硒功能的保健药品或食品添加剂中，不仅更有利于吸收，而且产品稳定性好，可广泛的应用于食品及药品行业。
(4)本发明促进了金樱子资源的开发利用，提升了其药食两用价值，为制备具有增强免疫调节和抗氧化活性的新型硒化金樱子酸性多糖提供了新途径，推动了硒化金樱子酸性多糖在食品与医药中的应用和发展。
附图说明
图1是本发明提供的工艺流程图。
图2是硒化金樱子酸性多糖和金樱子酸性多糖的红外光谱图。
图3是硒化金樱子酸性多糖和金樱子酸性多糖对刺激RAW 264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO的影响图。
图4是硒化金樱子酸性多糖和金樱子酸性多糖对AAPH诱导的红细胞溶血作用和扫描电镜图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明工艺方法流程图见图1。
实施例1
硒化金樱子多糖的制备及结构表征：
(1)金樱子多糖粗品制备：金樱子果肉洗净晒干，粉碎后过100目筛，得到金樱子果肉粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用95％的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂以及小分子物质，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1:30(g/mL)的比例加入水，在95℃下搅拌1h，4000r/min，室温离心10min后，收集上清液浓缩后，以体积比2:1加入D101大孔树脂，180r/min，脱色2h；脱色后糖液用3倍体积Sevage试剂收集上层清液，重复3次，浓缩后添加4倍体积的无水乙醇，在4℃下静置8h，4000r/min，室温离心10min；获得的沉淀用蒸馏水复溶后透析并冷冻干燥，得到金樱子粗多糖，此条件下多糖的得率为4.47％；
(2)金樱子酸性多糖的分离纯化及硒化：将步骤(1)中金樱子多糖粗品水溶解，配制5mg/mL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取5mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用超纯水、0-0.5mol/L的NaCl连续梯度溶液以1.0mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集(10min/管)。得到0.5mol/L NaCl溶液洗脱组分，将收集组分通过1000Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度5mg/mL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取1mL加入到Sephadex G-100凝胶柱中进行层析分离。流速0.5mL/min，5min/管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干。取500mg金樱子酸性多糖用50mL的0.5％HNO3室温下搅拌0.5h溶解，加入400mg Na2SeO3，避光、隔绝氧，70℃水浴搅拌8h，放冷至室温，用Na2CO3调节pH至7-8后,6000r/min，室温下离心10min，上清液用1000Da透析袋截留透析至透析液电导率低于2ppm，收集并冻干后，得到硒化金樱子酸性多糖成品，经过氢化物原子荧光法测得硒化金樱子酸性多糖经湿法消解硒含量约为547μg/g-862μg/g。
(3)硒化金樱子酸性多糖与金樱子酸性多糖的结构对比
取2mg干燥的金樱子多糖和硒化金樱子酸性多糖样品，分别加入150mg干燥的KBr用研钵研磨均匀，通过压片机压成薄片后，采用iS5N型傅里叶红外光谱仪对4000-400cm-1波段进行扫描分别获得金樱子酸性多糖和硒化金樱子多糖的红外光谱图(图2)。通过与原金樱子酸性多糖的红外光谱图对比，在硒化金樱子酸性多糖红外光谱图中新出现的763.78cm-1对应Se＝O伸缩振动吸收峰，915.19cm-1对应C-O-Se伸缩振动吸收峰，表明金樱子酸性多糖硒化成功。
实施例2
硒化金樱子酸性多糖的免疫和抗红细胞溶血活性评价：
(1)对本发明实施例制备的硒化金樱子酸性多糖进行免疫活性测定：将该硒化多糖用DMEM培养基溶解后配成1000μg/mL的母液，并等梯度稀释成200μg/mL、100μg/mL和50μg/mL三个剂量组；将原酸性多糖用DMEM培养基溶解后配成200μg/mL溶液；再解冻小鼠巨噬细胞RAW264.7，迅速将解冻细胞转移到15mL的无菌离心管，加入12mL DMEM培养基，混匀后低速离心(1000rpm/min，5min)。除去培养基，加入新鲜的培养基，将细胞悬浮后转移至细胞培养瓶中。置于CO2培养箱中培养(37℃，5vol％CO2)，每隔两天换一次培养基，加入100μL不同浓度的硒化金樱子酸性多糖溶液、原金樱子酸性多糖溶液，阳性对照组加入100μL含脂多糖(20μg/mL)的培养基，调零组和阴性对照组分别加入100μL DMEM培养基，每组设3个平行孔。将细胞放回CO2培养箱中培养24h，用Elisa试剂盒和一氧化氮检测试剂盒测定细胞上清液中各细胞因子(TNF-α、IL-6和NO)的表达量，结果如图3所示，图中不同的字母代表不同组之间具有显著差异，p<0.05。该硒化多糖在达到200μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO的能力与原多糖比分别提高了16.28％、14.85％和24.02％；与空白对照比分别提高了449.19％、703.38％和485.01％。
(2)对本发明实施例制备的硒化金樱子酸性多糖进行抗氧化(抗红细胞溶血)活性测定：同时利用对0.2mL红细胞悬液、0.2mL不同浓度的硒化金樱子酸性多糖和金樱子酸性多糖溶液(0.75、1.5、和3mg/mL，PBS稀释)、0.4mL AAPH溶液的体系比较金樱子酸性多糖硒化前后抗红细胞溶血活性的变化，结果如图4所示。在硒化金樱子酸性多糖浓度为3mg/mL时红细胞溶血抑制率可达94.25％。当硒化金樱子酸性多糖浓度为1.5mg/mL时红细胞溶血抑制率为78.48％，较原金樱子酸性多糖显著升高17.17％，较阳性组显著升高154.39％，使红细胞免受AAPH的氧化损伤，保持正常的红细胞基本形态。
实施例3
硒化金樱子酸性多糖的一种制备方法
(1)金樱子多糖粗品制备：金樱子果肉洗净晒干，粉碎后过100目筛，得到金樱子果肉粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用95％的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂以及小分子物质，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1:30(g/mL)的比例加入水，在95℃下搅拌1h，4000r/min，室温离心10min后，收集上清液浓缩后，以体积比3:1加入D101大孔树脂，160r/min，脱色1h；脱色后糖液用3倍体积Sevage试剂收集上层清液，重复3次，浓缩后添加4倍体积的无水乙醇，在4℃下静置8h，4000r/min，室温离心10min；获得的沉淀用蒸馏水复溶后透析并冷冻干燥，得到金樱子粗多糖，此条件下多糖的得率为6.18％；
(2)金樱子酸性多糖的分离纯化及硒化：将步骤(1)中金樱子多糖粗品水溶解，配制5mg/mL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取5mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用超纯水、0-0.5mol/L的NaCl连续梯度溶液以1.0mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集(10min/管)。得到0.5mol/L NaCl溶液洗脱组分，将收集组分通过1000Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度5mg/mL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取1mL加入到Sephadex G-100凝胶柱中进行层析分离。流速0.5mL/min，5min/管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干。取500mg金樱子酸性多糖用50mL的0.4％HNO3室温下搅拌0.5h溶解，加入300mg Na2SeO3，避光、隔绝氧，70℃水浴搅拌6h，放冷至室温，用Na2CO3调节pH至7-8后,6000r/min，室温下离心10min，上清液用1000Da透析袋截留透析至透析液电导率低于2ppm，收集并冻干后，得到硒化金樱子酸性多糖成品，经过氢化物原子荧光法测得硒化金樱子酸性多糖经湿法消解硒含量约为329-553μg/g。
实施例4
硒化金樱子酸性多糖的一种制备方法
(1)金樱子多糖粗品制备：金樱子果肉洗净晒干，粉碎后过100目筛，得到金樱子果肉粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用95％的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂以及小分子物质，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1:10(g/mL)的比例加入水，在95℃下搅拌1h，4000r/min，室温离心10min后，收集上清液浓缩后，以体积比2:1加入D101大孔树脂，180r/min，脱色2h；脱色后糖液用3倍体积Sevage试剂收集上层清液，重复3次，浓缩后添加4倍体积的无水乙醇，在4℃下静置8h，4000r/min，室温离心10min；获得的沉淀用蒸馏水复溶后透析并冷冻干燥，得到金樱子粗多糖，此条件下多糖的得率为3.18％；
(2)金樱子酸性多糖的分离纯化及硒化：将步骤(1)中金樱子多糖粗品水溶解，配制5mg/mL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取5mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用超纯水、0-0.5mol/L的NaCl连续梯度溶液以1.0mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集(10min/管)。得到0.5mol/L NaCl溶液洗脱组分，将收集组分通过1000Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度5mg/mL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取1mL加入到Sephadex G-100凝胶柱中进行层析分离。流速0.5mL/min，5min/管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干。取500mg金樱子酸性多糖用50mL的0.6％HNO3室温下搅拌0.5h溶解，加入500mg Na2SeO3，避光、隔绝氧，70℃水浴搅拌8h，放冷至室温，用Na2CO3调节pH至7-8后,6000r/min，室温下离心10min，上清液用1000Da透析袋截留透析至透析液电导率低于2ppm，收集并冻干后，得到硒化金樱子酸性多糖成品，经过氢化物原子荧光法测得硒化金樱子酸性多糖经湿法消解硒含量约为631-875μg/g。
综上，本发明实施例制备的硒化金樱子酸性多糖与原金樱子酸性多糖相比，可显著提高免疫和抗氧化活性，说明硒化金樱子酸性多糖是一种具有较高应用价值的生物活性物质以及硒补充剂。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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