一种改善茶多酚茶多糖溶解性的方法及所制备复合物与应用
阅读说明：本技术 一种改善茶多酚茶多糖溶解性的方法及所制备复合物与应用 (Method for improving tea polyphenol and tea polysaccharide solubility, prepared compound and application ) 是由 字成庭 盛军 王宣军 杨柳 张宁 吴以龙 孙秀丽 谢引荣 于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种改善茶多酚茶多糖溶解性的方法及所制备复合物与应用,属于植物化学技术领域,本发明首次从普洱熟茶中分离纯化得到一种茶多糖,该化合物结构新颖,具有生物活性,尤其是较好的降糖活性,为进一步研究药用茶多糖提供重要的启示,可用于降糖药物的研发制备。本发明还提供了茶多酚改善高聚茶多糖溶解性的方法,通过多糖-多酚的相互作用,使高聚茶多糖与多酚类物质在水溶液中自组装形成稳定的大分子复合物,以显著提高高聚茶多糖的溶解性。本发明所提供的茶多糖的增溶方法工艺简单,操作方便,实际应用效果优异,通过茶多糖与茶多酚复配形成的复合物具有显著的协同降糖作用。(The invention relates to a method for improving the solubility of tea polyphenol and tea polysaccharide, a prepared compound and application, and belongs to the technical field of phytochemistry. The invention also provides a method for improving the solubility of the high polymer tea polysaccharide by the tea polyphenol, which enables the high polymer tea polysaccharide and the polyphenol substance to self-assemble in the water solution to form a stable macromolecular compound through the interaction of the polysaccharide and the polyphenol so as to obviously improve the solubility of the high polymer tea polysaccharide. The solubilization method of tea polysaccharide provided by the invention has the advantages of simple process, convenient operation and excellent practical application effect, and the compound formed by compounding the tea polysaccharide and the tea polyphenol has a remarkable synergistic hypoglycemic effect.)
技术领域
本发明涉及植物化学功能性成分的溶解技术领域，更具体地，涉及一种茶多糖的提取纯化与改善茶多酚茶多糖溶解性的方法。
背景技术
普洱茶以云南特色大叶茶种制作的特殊茶类。普洱茶中含有大量的茶多糖，是茶汤的主要滋味物质之一。在茶叶中茶多糖含量在6%左右，其组成复杂，属于杂多糖复合物，由糖类、蛋白质和果胶等物质所组成，是具有生物活性的复合多糖。
现代研究表明，茶多糖具有降脂减肥、降血压、调节免疫、抗癌等作用。茶叶中的多糖有中性多糖、酸性多糖两种，而且往往是与蛋白质紧密结合的糖蛋白复合物。目前已经通过动物体内模型试验证明茶多糖确有降血糖作用，主要是通过茶多糖实现清除自由基调节糖类代谢过程中关键酶活性来调节血糖水平减缓胃的倒空速度，减少葡萄糖的吸收。因此茶多糖的研究也越来越引起人们的关注。但是提取出的普洱茶多糖尤其是高聚茶多糖的水溶性差，进而影响茶多糖降糖效果。随着人们对自身健康的日益关注，研究和开发天然降血糖剂以取代化学合成的降血糖剂已是大势所趋。综上所述，如何克服高聚茶多糖难溶的技术难题是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种高聚茶多糖提取纯化及增溶方法，从普洱茶中提取到一种茶多糖，将其与EGCG混合，建立一种自组装复合物。通过对α-葡萄糖苷酶的抑制活性实验，发现PTPs-EGCG复合物比EGCG提高了1.1倍，PTPs-EGCG复合物比PTPs提高了7.8倍，具有较好的降糖作用。
下述的技术方案是用来实现上述的发明目的：
本发明提供的茶多糖是从云南大叶种普洱茶中分离得到的新的多糖，属于一种均一多糖，该多糖分子量≈4.59 KDa，单糖构成为鼠李糖:阿拉伯糖 = 1:7，PTPs的骨架由6个→2)-α-L-Arap-(3→为主链和1个β-L-Rhap-(3→1)-α-L-Arap的重复单元组成，其具有如下结构：
该化合物命名为PTPs，其分子式为C41H82O40。
所述茶多糖的制备方法，具体包括以下步骤：
1)普洱茶叶阴干后粉碎，过筛（40目）作为原料；
2)将步骤1)放入热水萃取器中，加入超纯水，在85℃下萃取2小时，不溶物过滤后得到水萃取物，蒸发浓缩；
3)将步骤2)所得到的浓缩液用95%的乙醇沉淀，在剧烈搅拌下最终浓度为70%；室温静置过夜，离心（4000 r/min, 15 min, 0℃），得到沉淀；用热水（80℃）重新溶解沉淀物并冷却至室温；
4)将步骤3)所得到溶液用Sevag试剂（正丁醇/氯仿1:4，V/V）洗涤去蛋白；最后，通过浓缩和冷冻干燥得到粗茶多糖；
5)将步骤4)所得到粗茶多糖使用DEAE-52柱纯化茶多糖中，用纯水清洗柱，收集洗脱液浓缩；用透析袋去除杂质如单糖和寡糖，冷冻干燥得到白色絮状物；
6)将步骤5)所得到白色絮状物，使用Sephadex G-100柱进一步纯化，用恒流泵和纯化水洗脱，将洗脱液收集，冷冻干燥得到纯化的茶多糖。
作为优选，步骤2)中，原料与水的质量比为1:15。
作为优选，步骤5)中，DEAE-52柱选择2.9厘米×50厘米，透析袋为 7000 Da。
作为优选，步骤6)中，DEAE-52柱选择2.9厘米×100厘米。
本发明还提供了一种茶多酚改善茶多糖溶解性方法,：将茶多糖与多酚建立自组装复合物，进而改善茶多糖的溶解性。具体包括以下步骤：向茶多糖水溶液中加入茶多酚类物质，混合搅拌均匀，即可。
进一步地，茶多糖为高聚茶多糖或上述结构的茶多糖；茶多酚类物质包含没食子儿茶素（EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)中的一种或多种。
进一步地，茶多糖与茶多酚类物质的摩尔质量比为1:1。
20℃水溶液中茶多糖的溶解时间可从214 s提高到150 s。
本发明还提供了一种茶多糖-多酚复合物，茶多糖与茶多酚类物质的摩尔质量比为1:1。
进一步地，茶多糖为高聚茶多糖或上述结构的茶多糖；茶多酚类物质包含没食子儿茶素（EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)中的一种或多种。
本发明还提供了上述茶多糖-多酚复合物在制备降糖降脂类食品或药物中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次从普洱熟茶中分离纯化得到一种茶多糖，该化合物结构新颖，具有较好的降糖作用，为进一步研究药用茶多糖提供重要的启示，可用于降糖药物的研发制备。
(2)本发明所提供的茶多糖的增溶方法通过加入多酚类物质，通过多糖-多酚的相互作用，在茶多糖与茶多酚类物质的摩尔质量比为1:1的条件下，使高聚茶多糖与多酚类物质在水溶液中形成稳定的复合物，使其溶解时间提高了。20℃水溶液中茶多糖的溶解时间可从214 s提高到150 s。
(3)本发明所提供的茶多糖-多酚复合物可应用于制备降糖类食品或药物。
附图说明
图1是茶多糖PTPs的结构式。
图2是PTPs纯品HPLC图谱。
图3是PTPs纯品PMP-HPLC图谱。
图4是PTPs纯品IR图谱。
图5是PTPs纯品UV图谱。
图6是PTPs纯品NMR图谱。
图7是25℃下将800 μM PTPs滴定到800 μM EGCG的ITC图。
图8是PTPs纯品（a）与PTPs-EGCG（b）溶于水中的自组装透射电镜图谱。
图9是PTPs纯品与EGCG互溶增加溶解度；（a）EGCG, PTPs和PTPs-EGCG的ζ电位，（b）PTPs和PTPs-EGCG的溶解度。
图10是PTPs纯品与EGCG互溶增加复合物的分散性。
图11是PTPs-EGCG对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测试。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1：茶多糖PTPs的制备方法
茶多糖PTPs的制备方法包括以下步骤：将阴干的1 kg大叶种普洱茶叶粉碎，过40目筛作为原料；放入热水萃取器中，所得原料用8倍量（质量比）的超纯水在85℃下萃取2小时，反复提取三次，不溶物过滤后得到水萃取物，蒸发浓缩，得到浓缩液500 mL。所得到的浓缩液用95%的乙醇沉淀，在剧烈搅拌下最终浓度为70%。室温静置过夜，离心（4000 r/min,15 min, 0℃），得到沉淀。用热水(80℃)重新溶解沉淀物并冷却至室温。所得到溶液用Sevag试剂（正丁醇/氯仿1:4，V/V）多次洗涤，去除蛋白。最后，通过浓缩和冷冻干燥得到粗茶多糖。粗茶多糖使用DEAE-52柱（2.9 cm×50 cm）纯化茶多糖，用纯水清洗柱，收集洗脱液浓缩。用透析袋透析（7000 Da）去除杂质如单糖和寡糖，冷冻干燥得到白色絮状物。所得到白色絮状物，使用Sephadex G-100柱（2.9 cm×100 cm）进一步纯化，用恒流泵和纯化水以0.6 mL/min的流速洗脱，洗脱液（3 mL/管）自动收集，冷冻干燥得到纯化的茶多糖PTPs。
如图1所示为纯化茶多糖PTPs的结构。如图2所示为PTPs纯品HPLC图谱。如图3所示为PTPs纯品PMP-HPLC图谱。如图4所示为PTPs纯品IR图谱。如图5所示为PTPs纯品UV图谱。如图6所示为PTPs纯品NMR图谱。
实施例2：茶多酚改善高聚茶多糖的测试
采用实施例1方法获得的茶多糖PTPs纯品与茶多酚EGCG作为实验材料，所用茶多酚为实验室自提。
配置浓度为1 mM的纯化茶多糖水溶液和PTPs-EGCG水溶液（摩尔比为1:1，见图7），采用透射电镜观察其在水溶液中的存在形态。
结果如图8所示，从图8（a）可以看出，纯化茶多糖在水中溶解效果不佳，分散不均匀；其难溶于水的特征造成其很难应用于制备降糖降脂类食品药物中。结果如图8（b）所示，从图8（b）中可以看出，PTPs与EGCG摩尔比1:1配制，PTPs-EGCG形成了稳定的纳米微粒，分散均匀。
结果如图9所示，PTPs-EGCG溶液电位值低于PTPs溶液电位，1 mg/mLPTPs溶液电位是-17.8 mV, 1 mg/mL EGCG溶液电位是-33.4 mV，而1 mg/mLPTPs-EGCG混合物电位是-29.7 mV。当EGCG中加入PTPs中，电位增大，电位绝对值(正负)越高，体系越稳定，溶解度提高。
结果如图10所示，EGCG的粒径为110.29 nm；PTPs的粒径为241.53 nm；当EGCG加入到PTPs中时，PTPs-EGCG复合物的粒径减小到134.17 nm，说明EGCG能有效抑制PTPs的自聚合，形成PTPs-EGCG复合物。
实施例3：PTPs-EGCG对α-葡萄糖苷酶抑制活性测试
以pNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，EGCG，PTPs，PTPs-EGCG为实验组进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性的实验。取50 μL PBS，50 μL α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）和50 μL不同浓度（0，12.5，25，50，100，200 μM）的EGCG、PTPs和PTPs-EGCG及阿卡波糖（5，10，20，40，80 μM），37℃孵育15 min。然后再添加50 μL的pNPG溶液（6 mM），37℃孵育15 min。最后加50 μL的Na2CO3（0.2 M）终止反应，并在405 nm下测量吸光度。重复实验3次。α-葡萄糖苷酶的抑制活性公式如下：
结果如图11所示，在体外条件下，与EGCG相比，PTPs-EGCG的比例（摩尔比，μM）在12.5:12.5，25:25，50:50，100:100时其α-葡萄糖苷酶的抑制活性要高于EGCG的抑制活性。而单独使用PTPs时，α-葡萄糖苷酶的抑制活性较差。表明PTPs-EGCG可有效的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
本发明首次从普洱茶叶中分离、纯化和鉴定得到一种高聚茶多糖，该化合物结构新颖，具有多种生物活性，尤其是较好的降糖作用，为进一步研究在制备降糖降脂类食品药物提供重要的启示，可用于降糖药物的研发制备。本发明制备方法简单，制备成本较低，应用情景广阔。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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