具体实施方式

本发明的具体实施方式中使用了北京普析公司的TU-1810紫外分光光度计；DianeUniMate 3000 凝胶渗透色谱仪，TSK-G3000 PWXL色谱柱；Aglient RRLC 1200 SL液相色谱仪，DIKMA Inertsil ODS-3色谱柱，UV-VIS DAD 检测器，流动相为PBS （0.1 M）， pH 7.0，流速为1.0 mL/分钟，进样量为20 μL，检测波长为245 nm；Thermo Fisher 公司的ThermoScientific TSQ 8000三重四极杆气质联用仪；Bruker公司的Vertex 7.0红外光谱仪；Bruker公司的Bruker-600 FT-NMR 核磁共振仪。

实施例1

称取粉碎的干燥朝鲜淫羊藿药材500g，加入90%乙醇加热回流去除色素和其他小分子。残渣再加入蒸馏水（1:30），沸水浴提取三次（1h, 2h, 3h），将提取液趁热过滤（120目），收集三次所得滤液。滤液浓缩（60~80℃）冷却后离心（4000 rpm/min）10分钟，收集上清液，向其中加入乙醇直至溶液最终醇浓度达到80%，静置过夜后离心（4000 rpm/min）10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，得到粉末（82.65克）。

将上述干燥粉末溶解于蒸馏水中，加入Sevag试剂（三氯甲烷:正丁醇=4:1，v/v），混合溶液剧烈振荡120分钟，静置分层后离心保留上清液，再次加入Sevag试剂，如此循环往复5次，将上清液减压浓缩后加入无水乙醇（1:4，v/v），醇沉过夜，离心。

将上述反应溶液利用截留分子量为3500 Da的透析袋进行透析，透析48小时。收集透析外液，60℃减压浓缩，并冷冻干燥，得到干燥粉末（29.45克）。

称取上述干燥粉末10克，溶解于10 ml蒸馏水中，离心，取上清液上样于DEAE-纤维素（Cl^-）柱（7.0×30 cm），洗脱液为蒸馏水，收集洗脱液，流速10 mL/min，每管收集12 mL，苯酚-硫酸法跟踪监测，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥后得到EFPN（5.54克）。

称取上述干燥粉末1克，溶解于10 ml蒸馏水中，离心，上清液上样于SepharoseCL-6B柱（2.5×100 cm），洗脱液为蒸馏水，收集洗脱液，流速10 mL/20 min，每管收集10mL，收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪监测，分析得均一狭窄对称洗脱峰，多分散性指数为1.1，浓缩，冷冻干燥后得到EFPN-1（0.60克）。

取EFPN-1干燥粉末10 mg，溶解于10 mL蒸馏水中，取此溶液20 μL进行上样，应用于HPGPC系统，流动相为蒸馏水，流速为1 mL/min。标准品为一系列标准多糖，分子量为1000，5000，12600，60600，80000，100000，150000 Da。由洗脱时间知，EFPN-1的分子量为21900 Da，分子量均一。

HPLC测定条件如下：

色谱柱：TSK-G3000 PWXL（7.8 mm ID × 30.0 cm L）

检测器：RID-10A

流动相：去离子水

流速：1.0 mL/min

进样量：10 μL

取EFPN-1干燥粉末配制成0.1 mg/ml 溶液，在190~290 nm的范围内进行紫外光谱扫描，在260 nm和280 nm 波长处未发现吸收峰，由此可知EFPN-1中不存在蛋白和核酸。

取EFPN-1干燥粉末，苯酚-硫酸法测得总糖含量为91.43%，考马斯亮蓝法测得蛋白含量小于1%，福林酚试剂盒法未测得EFPN-1中存在酚类物质。

取EFPN-1干燥粉末，经完全酸水解，HPLC。分析得四个洗脱峰，由洗脱时间知，该组合物主要由葡萄糖（66%）组成，还包括鼠李糖（9.7%），半乳糖（17.5%），阿拉伯糖（6.8%）。

HPLC测定条件如下：

色谱柱：DIKMA Inertsil ODS-3（4.6mm × 150 mm）

检测器：UV-VIS DAD

检测波长：245 nm

流动相：PBS（0.1 M , pH 7.0）：乙腈=82:18（v/v）, pH 7.0

流速：1.0 mL/min

进样量：10 μL

取EFPN-1干燥粉末，以KBr压片，在4000~400 cm^-1的范围内进行红外光谱扫描，记录红外光谱图数据如下：3385cm^–1和1641cm^–1处为OH的伸缩振动吸收峰，在2931 cm^-1处显示CH伸缩振动吸收峰，1422cm^–1和1042cm^–1处的强吸收峰显示为C-H和C-O的伸缩振动峰，此外，917cm^–1处的强吸收峰显示含有大量的β-糖苷键连接，815cm^–1的弱吸收峰表明α-糖苷键的存在。

根据GC-MS结果分析可知，EFPN-1含有8种不同的单糖残基。进一步根据每个单糖残基的离子碎片图及相对保留时间分析可知，这8种单糖残基分别为 (1→)-Araf、(1→)-Glcp、(1→)-Galp、(1→3)-Rhap、(1→4)-Glcp、(1→3)-Galp、(1→3,6)-Galp和(1→4,6)-Glcp；根据其峰面积计算可知这8种单糖残基的摩尔比分别是7.90:8.15:12.40:1.78:44.10:6.96:7.60:11.11，(1→4)-Glcp残基的摩尔百分含量为44.10%，表明其可能为构成EFPN-1的骨干部分，支链主要由(1→4,6)-Glcp和(1→3,6)-Galp构成，摩尔比约为2:3，末端多糖主要由Ara，Glc和痕量的Gal构成，总含量为22.10%，几乎与支链残基含量（18.71%）相当。根据分支含量，末端残基与线性残基，计算得到EFPN-1的分支度（DB）为40.40%。因此，推断出EFPN-1是一种支链多糖，每个分支由五个(1→4)-Glcp残基重复单元构成。

GC-MS测定条件如下：

色谱柱：DIKMA Inertsil ODS-3（4.6mm × 150 mm）

检测器：UV-VIS DAD

检测波长：245 nm

流动相：PBS（0.1 M , pH 7.0）：乙腈=82:18（v/v）, pH 7.0

流速：1.0 mL/min

进样量：10 μL

色质联机AGILENT 5975 GC/6890MS

色谱柱：HP-1石英毛细管柱（23 m×0.25 mm×0.25 nm）

进样口：250 ℃

离子源：280 ℃

程序升温：120 °C 保持5分钟；120 °C→280 °C（5 °C/min），保持 2分钟。

检测范围：30–400 m/z

表1 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物甲基化的GC-MS分析。

根据EFPN-1的1D和2D NMR分析结果可知，EFPN-1由7种糖残基组成，命名为A-G，分别是α-L-Araf-(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→、α-D-Glcp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→、→4, 6)-α-D-Glcp-(1→和→3, 6)-β-D-Galp-(1→。但是在核磁共振图谱中，未发现t-Galp残基的信息，这可能由于该残基的含量在EFPN-1中的含量低于5%（1.78%）。

由EFPN-1的¹H NMR图谱可知，由于D₂O的抑制效应，所以多糖的一些异头质子的特征信号峰与D₂O重合，而被D₂O覆盖。在异头氢区域，5.04~5.18 ppm出现较弱的特征峰，该信号归属于α-Araf和α-Rhaf残基的异头质子信号。4.20~4.57 ppm处信号表明EFPN-1中含有β-构型的糖苷键。Rhap残基中-CH₃上H的化学位移为1.27 ppm。¹³C NMR谱图中，Rhap残基中C6的化学位移为16.8 ppm，δ96.00~109.19 ppm信号峰为糖残基的异头碳原子的特征峰，而这些残基的C2-C5的特征峰出现在δ60.00~84.00 ppm范围之间。

残基A：在¹H NMR图谱中异头质子的特征峰出现在δ5.18 ppm，根据HSQC图谱可判断，该异头质子对应的异头碳的信号为δ109.19 ppm, 证明该残基为α-构型。由图进一步分析可知，HSQC图谱中交叉峰4.14/81.9 ppm、3.93/76.35 ppm、4.06/83.67 ppm、3.57/62.45ppm分别归属为该残基的H2/C2，H3/C3，H4/C4和H5/C5，根据文献报道的化学位移值，残基A为判定为α-L-Araf。

残基B：δ4.95 ppm归属为残基B的异头质子信号峰，证明残基B是α-吡喃型鼠李糖残基。通过COSY图谱，可以发现交叉信号峰δ4.95/δ4.16 ppm，由此可以判断，残基B的H-2的化学位移是δ4.16 ppm。由此我们可以依次推断出该残基H-2、H-3、H-4、H-5和H-6的化学位移。同时，根据HSQC图谱中C-H相关峰，我们可以获得残基B的C-2~C-6的化学位移值。其中，交叉峰δ3.99/76.78 ppm归属于该残基的H3/C3交叉信号峰，因此残基B推断为→3)-α-L-Rhap-(1→。

残基C、D、和F：通过对¹H、COSY图谱分析判定残基的C、D和F的异头质子化学位移分别为δ4.90 ppm (C)，δ5.04 ppm (D) 和δ4.92 ppm (F)，进一步通过HSQC图谱，根据H1-C1，H2-C2……H6-C6交叉峰，可推断出残基C、D和F的异头碳相关位移分别为δ100.17 ppm (C)，δ99.29 ppm (D)和δ100.24 ppm (F)。通过对异头质子及异头碳的分析结果可知这3个残基均为α-吡喃型葡萄糖残基。同理，对这3个残基的其它位置上的碳、氢信号进行了判定和归属。根据文献报道，残基C为t-α-D-Glcp。δ76.35 ppm为残基D的C4发生取代，进而引起了向低磁场移动的结果，故可判定残基D为→4)-α-D-Glcp-(1→。同理，δ76.35 ppm和δ67.87ppm是残基C的C4和C6发生取代而引起的向低场位移，故推测残基F为→4,6)-α-D-Glcp-(1→。

残基E和G：¹H及COSY图谱中的δ4.57 ppm和δ4.45 ppm证明残基E和G为β-构型。根据HSQC图谱分析，残基E和G的H1/C1交叉峰为δ4.57/103.86 ppm和δ4.45/102.93 ppm，交叉信号峰δ3.68/80.02 ppm归属为残基E的H3/C3。根据文献报道，β-D-Galp的C3化学位移为δ71~73 ppm，由此可知，残基E的C3是由于发生了取代，进而向地磁场移动，由此推测残基E为→3)-β-D-Galp-(1→，同理可判断，残基G的C3 (δ 80.96 ppm)和C6 (δ67.0 ppm)发生了取代，故判定残基G为3,6)-β-D-Galp-(1→。

表2 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物¹HNMR和¹³CNMR光谱信号的化学位移

。

EFPN-1的7种残基(A-G)的连接顺序可根据HMBC图谱结果进行判定。根据HMBC图谱，我们可找到AH1-EC3，CH1-BC3和CH1-GC3的交叉信号峰，由此可推断EFPN-1中含有以下糖残基结构单元：→3)-β-D-Galp-(1→α-L-Araf、→3)-α-L-Rhap-(1→α-D-Glcp和4)-α-D-Glcp-(1→α-D-Glcp。同理，在HMBC图谱中我们找到了DH1-DC4、DH1-FC4、EH1-GC6、BH1-GC3和FH1-DC4的交叉信号峰，证明EFPN-1中含有以下糖残基结构单元→4)-α-D-Glcp-(1→4,6)-α-D-Glcp、→3)- β-D-Galp-(1→3, 6)-β-D-Galp、→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap。

药效试验

利用实施例1制备得到的朝鲜淫羊藿中性多糖组合物进行体外抗氧化活性实验。

1、朝鲜淫羊藿中性多糖组合物体外抗氧化实验

1.1羟基自由基清除实验

0.1 ml EFPN-1溶液与0.6 ml反应缓冲液[0.2 M磷酸缓冲液（pH=7.4）2.67 mM去氧核糖和0.13 mM EDTA]，0.2 ml 0.4 mM硫酸亚铁盐，0.05 ml 12 mM维生素C和0.05 ml 20 mM过氧化氢混合制成反应溶液。将混合溶液在37℃水浴15分钟，然后加入1 ml 1%硫代巴比妥酸和1 ml 2.0%的三氯乙酸。将此混合物沸水浴15分钟，放入冰中冷却，在532 nm下测定其吸光度值A样品。用蒸馏水作为空白溶液A空白，维生素C作为阳性对照进行测定。测定的吸光度值越低表明清除能力越高。并计算半数抑制浓度IC50值。

清除羟基自由基的能力用以下公式来计算：

清除率S(%)=(1-样品吸光度/对照品吸光度)×100%。

由表1可知，EFPN、EFPN-1在1~8 mg/mL范围内有良好的清除效果，并且呈剂量依赖性，IC50值分别为6.55 mg/mL和1.54 mg/mL。EFPN、EFPN-1均在8 mg/mL达到最大值，其中EFPN-1的效果最好，抑制率达到了90.05%，几乎接近于Vc的清除率（92.46%）。在试验剂量范围内，EFPN-1比EFPN具有更强的羟基自由基清除能力。

表3 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物羟基自由基清除能力。

DPPH自由基清除实验：

取0.1 mmol/L DPPH溶液1.5 ml，在此溶液中加入4.5 ml的EFPN-1溶液，振荡混匀。30分钟后在517 nm处测定其吸光度值A样品。反应物的吸光度值越低代表自由基清除能力越高。用蒸馏水作为空白溶液A空白。维生素C作为阳性对照进行测定。并计算半数抑制浓度IC50值。清除DPPH的能力用以下公式来计算：

清除DPPH自由基的能力用以下公式来计算：

清除率S(%)=1-(A样品/A空白）×100%。

由表2可知，EFPN和EFPN-1对DPPH自由基的清除能力在0.05~0.4 mg/mL范围内呈浓度依赖性。Vc、EFPN和EFPN-1的清除率最大值分别为76.68%、53.80%和71.83%，EFPN-1的清除率几乎接近于Vc的清除率，IC50分别为0.98、0.18和0.12 mg/mL。在试验剂量范围内EFPN-1比EFPN具有更强的抗氧化活性。

表4 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物DPPH自由基清除能力。

金属离子螯合能力实验

1 ml EFPN-1溶液，加入3.7 ml甲醇及0.1 ml 2 mM FeCl₂·4H₂O，加入0.2 ml 5 mM菲洛嗪，在室温下反应10分钟后立即在562 nm测定其吸光度值。吸光值愈低表示螯合亚铁离子之能力愈强。用蒸馏水作为空白溶液，维生素C作为阳性对照溶液进行测定。并计算半数抑制浓度IC50值。

金属离子螯合能力用以下公式来计算：

清除率S(%)=1-(A样品/A空白）×100%。

由表3可知，在0~5 mg/mL浓度范围内，EFPN的Fe²⁺螯合率为40.62%~64.40%，EFPN-1为37.54%~85.25%，IC50分别为1.32、1.15 mg/mL。当浓度为1.5 mg/mL时，EDTA的螯合率最大值为97.40%。因此EFPN-1比EFPN具有更强的螯合活性。

表5 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物对金属离子的螯合能力。

还原能力（FRAP）实验

FeSO₄标准曲线的绘制：取FeSO₄·7H₂O溶液5 ml定容于50 ml容量瓶中，即为8 mmo1/LFeSO₄标准溶液。依次配制7.2、6.4、5.6、4.8、4.0、3.2、0.8 mmol/L标准溶液，绘制标准曲线。

取0.3 ml EFPN-1溶液，加入2.7 ml 预热至37℃的FRAP工作液，振荡摇匀后放置10分钟，于593 nm 波长处测其吸光度值A。蒸馏水作为空白溶液A。根据反应后吸光度值，在标准曲线上求得相应FeSO₄ 的浓度(mmol/L)，定义为FRAP值。FRAP值越大，抗氧化活性越强。

硫酸亚铁标准曲线为y=0.0865x+0.0971，R²=0.9994。根据线性标准曲线计算样品的抗氧化能力，并以每克样品的FeSO₄当量表示。EFPN和EFPN-1 (5 mg/mL)的FRAP值分别为4.40 mm FeSO₄/g和7.04 mm FeSO₄/g，EFPN还原能力低于EDTA (0.04 mg/mL，5.58mmFeSO₄/g)，EFPN-1还原能力高于EDTA，说明EFPN-1有较强的还原能力。

2. 朝鲜淫羊藿中性多糖组合物的体内抗氧化活性研究

D-半乳糖衰老动物模型造模方法简便易行, 价格低廉, 结果相对稳定, 已成为公认的衰老动物模型。D-半乳糖能引起动物的氧化应激损伤，因此在此模型的基础上进一步测定抗氧化的指标。

2.1 模型的建立

雄性昆明小鼠(20±2g，8周龄)，21±1℃和50~60%相对湿度,自由摄取食物、水和保持光/暗12小时循环的环境。小鼠随机分为六组,包括正常组（灌胃15mL/kg生理盐水），D-半乳糖模型对照组(腹腔注射D-半乳糖1.35g/kg、灌胃15mL/kg生理盐水),阳性对照组(腹腔注射D-半乳糖1.35g/kg、灌胃Vc 100mg/kg)，实验组10、50、100mg/kg（腹腔注射D-半乳糖1.35g/kg、分别灌胃朝鲜淫羊藿中性多糖组合物 10、100、200、400mg/kg），连续灌胃42天。

2.2 SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的酶活力及MDA水平的检测

末次给药24h以后将所有小鼠眼球取血后离心（4000转/分，10分钟）获得血清。迅速移除肝脏，用生理盐水清洗后匀浆制成10%（w/v）的匀浆液，离心（4000转/分，10分钟）去掉细胞碎片，收集上清液。血清和肝脏匀浆液中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px的酶活力和MDA的水平按试剂盒说明书上的步骤进行测定。

表4、5显示了小鼠血清和肝脏匀浆小中SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的酶活力以及MDA的水平，相较于空白组，模型组小鼠血清、肝脏内的酶活力明显受到抑制，MDA的水平升高，具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，说明采用腹腔注射大剂量D-Gal制备亚急性衰老模型是成功的；与模型组相比，EFPN-1给药组不同程度的提高了小鼠血清与肝脏中SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的酶活性(P<0.01或P<0.05)，降低了MDA(P<0.01或P<0.05)的水平，说明EFPN-1具有明显的体内抗氧化活性，其中10mg/kg给药组作用最为显著(P<0.01)。

表6朝鲜淫羊藿中性多糖组合物对氧化损伤小鼠血清中 SOD (U/mL), CAT (U/mL), T-AOC (U/mL), GSH-Px (U/mL) 及MDA (nmol/mL)水平的影响

^a P<0.05 vs. 阴性对照组；^b P<0.01 vs. 阴性对照组。

表7朝鲜淫羊藿中性多糖组合物对氧化损伤小鼠肝脏匀浆中 SOD (U/ mgprotein), CAT (U/ mg protein), T-AOC (U/mg protein), GSH-Px (U/ mg protein)及MDA (nmol/ mg protein)水平的影响

^a P<0.05 vs. 阴性对照组；^b P<0.01 vs. 阴性对照组。