一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
阅读说明：本技术 一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法 (Method for preparing alanyl glutamine by immobilized enzyme ) 是由 张学义 李斌水 米造吉 何连顺 张玉锋 李霆 乔青青 张晗 于 2021-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法,包括如下步骤：-、a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液离心处理,收集菌丝；二、菌丝破壁、离心处理,收集离心清液；三、固定化酶载体活化、备用；四、制取a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶,低温储存；五、制备谷氨酰胺溶液,使溶液PH值为6.5-9.5,温度为5-40℃；六、向谷氨酰胺溶液中加丙氨酸甲酯溶液、搅拌,使溶液PH值为6.5-9.5,温度为5-40℃；七、取a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶加入六制备的溶液中,计时转化；八、转化结束后,过滤,a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶淋洗、套用。本发明提供一种可连续套用、提高了酶利用率、降低了蛋白量,适用于固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺。(The invention discloses a method for preparing alanyl glutamine by immobilized enzyme, which comprises the following steps: centrifuging the fermentation liquor of the alpha-amino acid ester acyltransferase, and collecting hypha; secondly, breaking the hypha wall, centrifuging, and collecting the centrifugal clear liquid; activating an immobilized enzyme carrier for later use; fourthly, preparing immobilized alpha-amino acid ester acyltransferase, and storing at low temperature; fifthly, preparing a glutamine solution to ensure that the pH value of the solution is 6.5-9.5 and the temperature is 5-40 ℃; sixthly, adding the alanine methyl ester solution into the glutamine solution, and stirring to ensure that the pH value of the solution is 6.5-9.5 and the temperature is 5-40 ℃; seventhly, adding the a-amino acid ester acyltransferase immobilized enzyme into the solution prepared by the sixth step, and performing timed conversion; eighthly, filtering after the conversion is finished, and leaching and mechanically applying the a-amino acid ester acyltransferase immobilized enzyme. The invention provides the method which can be continuously applied, improves the utilization rate of enzyme, reduces the protein amount and is suitable for preparing alanyl glutamine by immobilized enzyme.)
技术领域
本发明属于丙氨酰谷氨酰胺生产领域，具体涉及一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺又称丙谷二肽，分子式为C8H15N3O4，是白色或类白色的疏松块状物。丙氨酰谷氨酰胺是肠外营养的一个组分，适用于需要补充谷氨酰胺的病人，比如处于分解代谢或高代谢状况的病人。
目前，丙氨酰谷氨酰胺已经可以采用酶促合成方法进行生产，这种合成方法是使用生物酶作为催化剂，能够快速高效地合成L-丙氨酰谷氨酰胺，相对于传统的化学合成法，酶促合成方法工艺简洁、成本低廉，因此，目前酶促合成丙氨酰谷氨酰胺的方法得到大量应用。
但是，使用菌泥或者菌泥均质酶液直接参加反应，(1)酶利用率低，(2)大量蛋白的存在，对后期L-丙氨酰谷氨酰胺的提取设备压力大，环保压力大。
发明内容
本发明解决以上现有技术的不足，提供一种可连续套用、提高了酶利用率、降低了蛋白的固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法，包括如下步骤：
步骤一、a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液离心处理，收集菌丝；
步骤二、菌丝破壁处理；
步骤三、破壁后酶液离心处理，收集离心清液；
步骤四、取固定化酶载体、活化，装柱备用；
步骤五、取离心清液过流活化后的固定化酶载体；
步骤六、过流完后固定化酶载体静止放置，利用纯化水置换出固定化酶载体内游离的离心清液，过滤，得到a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，低温储存；
步骤七、制备谷氨酰胺溶液，用调节液调节谷氨酰胺溶液PH值为6.5-9.5，温度为5-40℃；
步骤八、向谷氨酰胺溶液中加入丙氨酸甲酯溶液、搅拌，使溶液PH值为6.5-9.5，温度为5-40℃；
步骤九、取步骤六制备的a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶加入步骤八制备的溶液中，计时转化；
步骤十、转化10-120min，结束反应，将反应液过滤，a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶淋洗、套用。
进一步地，步骤一中离心处理为转速9500-10500r/min,离心28-32min。
进一步地，步骤二中菌丝破壁处理向菌丝内加入磷酸缓冲液溶解至固含量20％，所述磷酸缓冲液PH值为3.0-9.0，浓度为0.01-0.1M。
进一步地，步骤三中的离心处理为转速9000-11000r/min，离心26-34min。
进一步地，步骤四中活化，取用磷酸缓冲液浸泡固定化酶载体进行活化，所述磷酸缓冲液的PH为3.0-9.0，浓度为0.01-0.2M，所述磷酸缓冲液的体积为固定化酶载体体积的2倍。
进一步地，步骤五中离心清液的过流量为固定化酶载体体积的5-10倍。
进一步地，步骤六中静止放置24h；纯化水体积为固定化酶载体体积的1倍。
进一步地，步骤七中调节液为氨水或氢氧化钠溶液中的一种。
进一步地，步骤八中谷氨酰胺和丙氨酸甲酯溶液的摩尔比为1：2-3。
进一步地，步骤九中a-氨基酸酯酰基转移酶为谷氨酰胺质量的1-2％，转化温度为5-40℃，PH值为6.5-9.5。
本发明由于采用了上述的发明，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明的固定化酶可连续套用，提高了利用率，且转换结束过滤酶后的转化液大分子蛋白较少，减轻了后期提纯丙氨酰谷氨酰胺环保压力及成本投入，工艺操作简单易于控制，可用于大规模生产；
综上，本发明提供一种可连续套用、提高了酶利用率、降低了蛋白量，适用于固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺。
具体实施方式
以下结合本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液5L，进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝500g加PH值为4.0，浓度为0.015M磷酸缓冲液溶解至固含量2500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液2500ml离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到离心清液1950ml。
(4)取固定化酶载体100g，用PH值为4.0，浓度为0.015M磷酸缓冲液200ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的9倍。
(6)过流完后静止放置24h,用100ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml,搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值至6.5，溶液温度为10℃。
(8)取0.23mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为6.5，溶液温度为10℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.33g,加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为10℃，转化PH值为6.5。
(10)转化100min，结束反应，将反应液过滤，转化率98.15％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例2
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为4.0，浓度为0.015M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为4.0，浓度为0.02M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的10倍。
(6)过流完后静止放置24h，用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值至9.0，溶液温度为30℃。
(8)取0.25mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为9.0，溶液温度为30℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g，加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为30℃，转化PH值为9.0.
(10)转化100min，结束反应，将反应液过滤，转化率为98.25％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例3
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L,进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为4.0，浓度为0.015M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为4.0，浓度为0.02M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h,装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的8倍。
(6)过流完后静止放置24h，用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值至9.5，溶液温度为35℃。
(8)取0.25mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为9.5，溶液温度为35℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g,加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为35℃，转化PH值为9.5。
(10)转化80min，结束反应，将反应液过滤，转化率为97.34％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例4
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液5L，进行离心处理，转速9500r/min，离心32min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝500g加PH值为3.0，浓度为0.01M磷酸缓冲液溶解至固含量2500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液2500ml离心处理，转速9000r/min，离心34min，得到离心清液1950ml。
(4)取固定化酶载体100g，用PH值为3.0，浓度为0.01M磷酸缓冲液200ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的5倍。
(6)过流完后静止放置24h，用100ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH至7.0，溶液温度为5℃。
(8)取0.23mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为7.0，溶液温度为5℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.33g加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为5℃，转化PH值为7.0。
(10)转化120min，结束反应，将反应液过滤，转化率97.26％，固定化酶用10ml
纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例5
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速10500r/min，离心28min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为5.0，浓度为0.1M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速9000r/min,离心34min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为5.0，浓度为0.1M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h,装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的10倍。
(6)过流完后静止放置24h,用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氢氧化钠液调节溶液PH值至9.5，溶液温度为40℃。
(8)取0.25mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为9.5，溶液温度为40℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g，加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为40℃，转化PH值为9.5。
(10)转化90min,结束反应，将反应液过滤，转化率为98.10％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例6
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速9500r/min，离心32min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为7.0，浓度为0.1M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速11000r/min，离心26分钟，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为7.0，浓度为0.2M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h,装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的8倍。
(6)过流完后静止放置24h,用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值至8.0，溶液温度为30℃。
(8)取0.25mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH为8.0，溶液温度为30℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g,加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为30℃，转化PH值为8.0。
(10)转化70分钟，结束反应，将反应液过滤，转化率为97.17％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例7
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH为8.0，浓度为0.05M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速11000r/min，离心26min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为8.0，浓度为0.05M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的7倍。
(6)过流完后静止放置24h，用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氢氧化钠液溶液PH值至8.5，溶液温度为20℃。
(8)取0.25mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为8.5，溶液温度为20℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为20℃，转化PH值为8.5。
(10)转化60min，结束反应，将反应液过滤，转化率为96.73％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例8
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为9.0，浓度为0.08M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH为9.0，浓度为0.08M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的6倍。
(6)过流完后静止放置24h,用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值至7.5，溶液温度为25℃。
(8)取0.2mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为7.5，溶液温度为25℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为25℃，转化PH值为7.5。
(10)转化10min，结束反应，将反应液过滤，转化率为93.42％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
实施例9
一种固定化酶制备丙氨酰谷氨酰胺的方法
(1)取a-氨基酸酯酰基转移酶发酵液3L，进行离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到菌丝。
(2)取离心后的菌丝300g加PH值为7.5，浓度为0.01M磷酸缓冲液溶解至固含量1500ml，进行均质破壁，得到均质液。
(3)取均质液1500ml离心处理，转速10000r/min，离心30min，得到离心清液1200ml。
(4)取固定化酶载体60g,用PH值为7.5，浓度为0.02M磷酸缓冲液120ml冲溶活化浸泡12h，装柱备用。
(5)取离心清液过流固定化酶载体，离心清液体积为固定化酶载体体积的5倍。
(6)过流完后静止放置24h,用60ml纯化水将游离离心清液置换出，过滤，得a-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶，即固定化酶，冰箱冷藏放置。
(7)将0.1mol谷氨酰胺加水300ml，搅拌溶解，用氨水调节溶液PH值7.5，溶液温度为15℃。
(8)取0.3mol丙氨酸甲酯溶液，加入谷氨酰胺溶液中，控制溶液PH值为7.5，溶液温度为15℃，得到反应液。
(9)取固定化酶0.3g加入到反应液中，计时转化，转化过程中控制转化温度为15℃，转化PH值为7.5。
(10)转化30min，结束反应，将反应液过滤，转化率为95.68％，固定化酶用10ml纯化水淋洗后套用，用于下一批次转化。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
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