一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途
阅读说明：本技术 一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途 (Armillariella tabescens mycelium polysaccharide and its preparation method and bacteriostatic use ) 是由 陈彦 张坤峰 杨宏伟 张文娜 赵弟海 赵彩莲 陈伟 李勇 黄宇哲 陈浩 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途,亮菌菌丝体多糖PAT总糖含量为93.41％,糖醛酸含量为12.24％；单糖组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:阿拉伯糖＝2.87:6.41:9.56:2.53:0.81。本发明制备的亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌生长过程均具有显著的抑制作用。亮菌菌丝体多糖PAT可作为新型天然抑菌剂,在日化和医药领域有着广泛应用前景。(The invention discloses a Armillariella tabescens mycelium polysaccharide and a preparation method and bacteriostatic application thereof, wherein the Armillariella tabescens mycelium polysaccharide PAT total sugar content is 93.41%, and uronic acid content is 12.24%; the monosaccharide composition and the molar ratio of mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose and arabinose are 2.87:6.41:9.56:2.53: 0.81. The Armillariella tabescens mycelium polysaccharide PAT prepared by the invention has obvious inhibition effect on growth processes of escherichia coli, proteus, bacillus subtilis and staphylococcus aureus. The Armillariella tabescens mycelium polysaccharide PAT can be used as a novel natural bacteriostatic agent, and has wide application prospect in the fields of daily chemicals and medicines.)
技术领域
本发明属于功能产品领域，具体涉及一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途。
背景技术
亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing，又称假蜜环菌，是我国特有的一种珍贵药食两用菌，因其菌丝体在暗处发出浅蓝色荧光而得名。植物学分类归属于伞菌目、白蘑科、杯伞属，其含有亮菌甲素、亮菌乙素等活性成分，已被广泛用于治疗急慢性肝炎、阑尾炎、中耳炎和胆囊炎。多糖作为亮菌生长过程中产生的重要次级代谢产物，研究发现其具有抗肿瘤、降血糖、降血脂和改善胰岛素抵抗等多种药理作用。目前关于亮菌多糖的抗菌作用，鲜有文献报道。
发明内容
本发明旨在提供一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途。本发明设计并优化了发酵技术，聚酰胺法制备具有特定化学组成的亮菌多糖，发现其对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有显著的抑制作用。本发明制备的亮菌多糖，可广泛应用在日化和医药领域，例如抗菌牙膏、沐浴露和抑菌喷雾剂等天然抑菌产品的开发，具有重要的市场应用价值和开发前景。
本发明亮菌菌丝体多糖，简记为PAT，其总糖含量为93.41％，糖醛酸含量为12.24％；单糖组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:阿拉伯糖＝2.87:6.41:9.56:2.53:0.81；其分子量分布范围为2.95×104-1.07×106Da。
本发明亮菌菌丝体多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基；将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种(该菌种由合肥诚志生物制药有限公司提供)接种于1000mL葡萄糖-土豆-MgSO4培养基中，28℃静置培养15天，制得人工液体静置发酵亮菌菌丝体；
步骤2：将步骤1获得的亮菌菌丝体(2000g)粉碎，按照液料比1:10(g/mL)加入蒸馏水，然后90℃浸提3h，重复浸提3次，过80目筛，合并提取液；
步骤3：将步骤2所得提取液浓缩至原体积的1/250，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h，4500rpm离心10-15min，收集沉淀物；
步骤4：将步骤3得到的沉淀物加蒸馏水溶解，采用聚酰胺法除蛋白脱色制备亮菌菌丝体多糖。条件为：80g的100-120目聚酰胺和300mL的沉淀物溶液在500mL摇瓶中混匀，室温条件下，摇床200rpm振摇30min，使其充分吸附蛋白质和色素，然后过滤液体，收集滤液、浓缩，冻干为PAT。
本发明亮菌菌丝体多糖的用途，是用于制备抑菌制剂，所述抑菌制剂对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长具有显著的抑制效果。
本发明通过亮菌菌丝体多糖PAT分别干预大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌的生长，测定干预后的抑菌圈直径、最小抑制浓度和生长曲线来评价其抗菌功效。
本发明1mg/mL亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为25.4mm±0.5，18.2mm±0.9，15.23mm±0.4，13.71mm±0.4，同浓度氯霉素的抑菌直径为29.5mm±0.5。
本发明亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑制浓度(Minimum inhibition concentration)分别为：0.5mg/mL，-1.0mg/mL，4.0mg/mL，4.0mg/mL。
本发明的有益效果体现在：1、采用控制变量法优化液态静置发酵技术，通过筛选特定培养基，28℃静置15天培养，获得生物产量高的菌丝体；2、聚酰胺法取代传统Sevag试剂快速有效除去蛋白和色素纯化活性多糖，得到富含半乳糖醛酸、鼠李糖等特定单糖组成亮菌菌丝体多糖PAT，其操作简便、绿色高效，适用于规模化制备。
附图说明
图1是标准单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖醛酸，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，6-半乳糖，7-阿拉伯糖，8-岩藻糖)。
图2是亮菌菌丝体多糖PAT单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，7-阿拉伯糖)。
图3是亮菌菌丝体多糖PAT相对分子质量检测色谱图，色谱条件为安捷伦1260HPLC-ELSD，TSKgel-G6000-PWxL(7.8mm×30cm，13μm)。
图4亮菌菌丝体多糖对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌图。
图5是亮菌菌丝体多糖对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例描述本发明的制备和抑制细菌生长，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
实施例1：亮菌菌丝体的发酵技术
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于1000mL培养基上，28℃静置培养15天，制到人工液体静置发酵亮菌菌丝体，其生物量为19.3g/L。
步骤2：步骤1得到的葡萄糖-土豆-MgSO4培养基加入15g琼脂，得到固态培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于该固体培养基上，28℃静置培养15天，制到人工固态静置发酵亮菌菌丝体，其生物量为13.2g/L。
步骤3：步骤1得到的葡萄糖-土豆-MgSO4液态培养基，28℃以180rpm摇床振动培养15天，制到人工液体摇床发酵亮菌菌丝体，其生物量为17.5g/L。
实施例2：亮菌菌丝体多糖的制备
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于1000mL培养基上，28℃静置培养15天，制到人工液体静置发酵亮菌菌丝体；
步骤2：将步骤1得到的亮菌菌丝体用中药粉碎机粉碎后按照1:10的液料比加入蒸馏水，90℃浸提3h，重复浸提3次，过80目筛，合并提取液；
步骤3：将步骤2提取液浓缩至原先体积的1/250，加入4倍体积的95％，4℃静置沉淀12h，4500rpm/min下离心10-15min，收集沉淀；
步骤4：将步骤3得到的沉淀(CAT)称取3g加蒸馏水溶解，用聚酰胺法、Sevag法和酶法分别制备亮菌菌丝体多糖。聚酰胺法：80g的100-120目聚酰胺和300mL沉淀溶液在500mL摇瓶中混匀；室温条件下，摇床200rpm振摇30min，使其充分吸附蛋白质和色素，然后过滤液体，收集滤液、浓缩，冻干为PAT；Sevag(正丁醇:三氯甲烷v/v＝1:4)，重复操作3次，取上清离心，旋转蒸发除去有机试剂，冷冻干燥为AT；酶法：沉淀溶解后的溶液中加入木瓜蛋白酶，60℃水浴2h，然后100℃灭活10min，冷却至室温，离心，冻干为EAT。
步骤5：PAT，AT，EAT和CAT的化学组成测定。总糖含量以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定；蛋白质含量以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，考马斯亮蓝G-250法测定；咔唑–硫酸法测定糖醛酸含量；焦没食子酸法测定多酚含量，之后分别在490nm、595nm、520nm、540nm处测量吸光值。
结果如表1，三种制备方法得到的多糖化学组成相比，PAT的总糖和糖醛酸含量显著高于AT和EAT；而蛋白质和酚含量显著低于AT和EAT，表明聚酰胺法相比于传统的Sevag法和酶法，其制备的多糖纯度高，杂质少。
表1多糖化学组成
实施例3：PAT单糖组成和分子量测定
步骤3：PAT的单糖组成分析采用酸水解-柱前PMP衍生化方法处理样品，高效液相色谱法分析测定。称取PAT(5mg)溶于5mL的2mol/L的三氟乙酸中，氮气封管，110℃油浴8h使充分水解。旋转蒸发仪旋出水分，加适量的去离子水，如此反复旋蒸至溶液pH显示中性为止，加入1mL蒸馏水，备用。
步骤4：标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μL，0.5mol/LPMP甲醇溶液和50μL，0.3mol/LNaOH溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行PMP柱前衍生化，然后用50μL0.3mol/LHCl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用DAD检测器。HPLC柱温为30℃，色谱柱为Zorbox Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，波长为245nm下检测。检测流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液。时间梯度洗脱0-60min，初始设置为流动相A：流动相B＝17％：83％，最终洗脱到比例为流动相A:流动相B＝20％：80％，进样量为10μL。
步骤5：采用去离子水洗脱，安捷伦高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测PAT组分。配制2mg/mL的PAT和葡聚糖标准品(T5、T12、T41、T100、T200)的溶液1mL，采用TSK Gel G6000 PWXL色谱柱(300×7.0mm，13μm)，载气为N2，气体流速为2.5L/min，进样量为10μL。以标准品相对分子质量的对数(LgMw)和保留时间(Rt)做标准曲线，测得的分子量范围为2.95×104-1.07×106Da。
实施例4：亮菌菌丝体多糖抗菌能力测定
PAT、AT、EAT和CAT对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌抑制能力评价。
步骤1：大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球(菌种购自ATCC,CICC)等细菌悬液的制备。斜面培养菌种在培养箱中孵育3h，超净工作台内接种LB固体培养基，37℃恒温静置培养；12h后，在超净工作台内选取平板上的菌落接种于LB的液体培养基，相同温度以180rpm转速摇床培养8h，制得原菌悬液。
步骤2：将步骤1制得的原菌悬液用无菌水稀释到2.0×105CFU/mL。
步骤3：采用薄层琼脂糖孔穴扩散法测定样品的抗菌功效。将步骤2的菌液均匀涂布于固LB培养基表面，经过灭菌直径为6mm的滤纸片置于培养基表面，滴加10μL2.0mg/mL的样品至滤纸片，37℃培养18-20h，等量的氯霉素作为阳性对照，无菌水作为空白对照，有抑菌圈形成表明有抑菌活性。
结果如图4所示，PAT对受试菌种均存在强烈抗菌能力，观察抑菌圈直径，PAT对大肠杆菌的抑制效果最优，抑制效果与阳性药氯霉素无显著差异。
步骤4：微量肉汤法测定样品对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球的MIC。无菌环境下，96孔无菌板第1孔加入2×105CFU/mL 90μLMH液体培养基，第2孔至第11孔中加入50μL LB液体培养基；10μL8.0 mg/mL的样品溶液添加到第一个孔后充分混合，吸取50μL混合液添加到第2孔，依次操作至第10孔，第10孔吸取50μL丢弃。50μL的细菌液体(没有药物)添加到11孔作为空白对照，药物与菌悬液共培养6-8h后，酶标仪600nm下平板扫描的吸光值低于对照组50％时即为该样品对该菌MIC。
结果如表1所示，PAT对大肠杆菌的抑制浓度最小，为0.5mg/mL，这与抑菌圈的结果相吻合。
表2多糖的最小抑制浓度
步骤5：100μL含有2×105CFU/mL的菌悬液和100μL 1/2MIC药物加入到5mL的LB液体培养基中，37℃培养箱以转速180rpm共培育24h。0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时取样在600nm处测定吸光值。
如图5显示PAT组的吸光度在所有被测细菌中OD值最低，且右移趋势最大，说明细菌的正常生长受到了抑制，特别是对大肠杆菌的生长曲线影响最大。而EAT、AT、CAT生长曲线右移趋势逐渐变小，与PAT相比，其存在着相对较弱的抑菌作用。