一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法
阅读说明：本技术 一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法 (Combined preparation method of grifola frondosa mycelium polypeptide and beta-glucan ) 是由 冯文娟 蔡颖辉 刘振学 杨传伦 魏圣可 杨朝洋 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于天然产物提取分离技术领域,具体提供了一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法。以发酵灰树花菌丝体为原料,经过乙醇脱脂、干燥、超微粉碎、酶法提取、热碱提取、中和、离心、微滤、超滤脱盐浓缩、喷雾干燥等工序生产灰树花多肽和β-葡聚糖。利用该方法制备的灰树花提取物中多肽和β-葡聚糖的含量高,生产周期短,适合工业化生产。(The invention belongs to the technical field of natural product extraction and separation, and particularly provides a joint preparation method of grifola frondosa mycelium polypeptide and beta-glucan. The fermented Grifola frondosa mycelia are used as raw materials, and processes such as ethanol degreasing, drying, superfine grinding, enzyme extraction, hot alkali extraction, neutralization, centrifugation, microfiltration, ultrafiltration desalination concentration, spray drying and the like are carried out to produce Grifola frondosa polypeptide and beta-glucan. The grifola frondosa extract prepared by the method has high content of polypeptide and beta-glucan, short production period and suitability for industrial production.)
技术领域
本发明涉及天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法。
背景技术
灰树花(Grifola frondosa)为担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属真菌,又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云覃、莲花菌等，日本称之为舞茸(Maitake)。其药用作用最早记载于日本阪然的《菌谱》中，“味甘、平、无毒,可治痔疮”。东汉时期的《神农本草经》中记载了其“调和脾胃，安定神志”的功效。灰树花菌丝体具有独特的芳香味，富含多种维生素、矿物质与生物活性物质。灰树花β-葡聚糖是从灰树花菌丝体中提取分离得到的一种灰树花多糖，由具有β-(1-3)侧链的β-(1-6)葡聚糖和具有β-(1-6)侧链的β-(1-3)葡聚糖组成，能够激活多种免疫细胞并释放细胞因子，提高机体的免疫力，在一定程度上缓解亚健康症状。灰树花多肽是指经蛋白酶水解并分离得到的小分子肽，具有降血压、降血脂、抗疲劳、抗菌、提高免疫力和抗氧化等功效，与大分子蛋白质相比，更容易被人体吸收。
灰树花提取物现有提取技术有水提法、碱提法、酶提法、超声波辅助法和微波辅助法等，其中超声波辅助法和微波辅助法对设备要求高，生产能耗高，生产成本高。水提法和酶提法得到的灰树花提取物中β-葡聚糖含量低。碱提法常用氢氧化钠，废水量大，得到的灰树花提取物中β-葡聚糖含量高，但是多肽含量低。因此，如何提供一种低能耗、高多肽和β-葡聚糖收率的从灰树花菌丝体中联合提取多肽和β-葡聚糖的方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法。本发明以发酵灰树花菌丝体为原料，经过乙醇脱脂、干燥、超微粉碎、酶法提取、热碱提取、中和、离心、微滤、超滤脱盐浓缩、喷雾干燥等工序生产灰树花多肽和β-葡聚糖。利用该方法制备的灰树花提取物中多肽和β-葡聚糖的含量高，生产周期短，适合工业化生产。
本发明的技术方案为：该方法首先采用乙醇脱脂破坏灰树花菌丝体细胞壁，然后采用超微粉碎工艺进行物理破壁，使得下一步酶法和碱提法联合提取时，多肽和多糖更容易提取出来。先采用蛋白酶酶解提取，获得灰树花多肽含量较高的提取液，然后再用碱提，获得灰树花β-葡聚糖含量较高的提取液，合并提取液经膜处理，去除大分子物质和小分子的盐，喷雾干燥得到高多肽和β-葡聚糖含量的灰树花提取物。生产用碱采用氢氧化钾代替传统的氢氧化钠，产生的废水可用于液体钾肥的开发。
本发明一种灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将发酵灰树花菌丝体和乙醇加入到提取容器中搅拌脱脂12～24h，离心，干燥后进行超微粉碎；
所述的乙醇优选食品级95％乙醇；加入后，乙醇的质量百分比在75％以上。
超微粉碎得到的灰树花菌丝粉能过200目筛；
(2)将灰树花超微粉和水加入到提取容器中，加入蛋白酶，搅拌提取2～6h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用；
(3)向固形物中加入碱溶液，80℃～90℃温度下提取2h，提取1～3次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液，沉淀用于有机肥加工；
(4)合并步骤(2)和(3)中的离心清液，采用孔径0.2～0.5μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤；
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
步骤(2)中水的用量为灰树花超微粉质量的10～40倍，蛋白酶为碱性蛋白酶或中性蛋白酶或其混合物，酶活20万U/g，添加量为灰树花超微粉质量的0.2％～1％；使用碱性蛋白酶前，需要加入氢氧化钾调节pH值至8.5～10.5；使用碱性蛋白酶和中性蛋白酶的混合物前，需加入氢氧化钾调节pH值至7.5～9.5。
步骤(3)中碱溶液为氢氧化钾溶液，碱溶液浓度为5％～10％(w/v)；加入的碱溶液体积为最初灰树花超微粉质量的10～30倍(ml/g)。
本发明在灰树花提取物的生产过程中首次采用破壁、酶法、碱法、膜处理联合提取的工艺，灰树花发酵结束后得到的菌丝体直接采用乙醇脱脂破坏细胞壁，脱脂后的灰树花菌丝体干燥后采用超微粉碎工艺进行物理破壁，同时，乙醇脱脂和超微粉碎也使蛋白质发生变性，蛋白质分子从有序的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构，更容易被蛋白酶水解，多肽和多糖更容易被提取出来。
酶法提取工艺主要是获得灰树花多肽含量较高的提取液，经过酶法提取后，灰树花菌丝体中大分子的蛋白质得到了去除，使得碱提过程中β-葡聚糖更易被提出。碱提工艺主要是获得灰树花β-葡聚糖含量较高的提取液。合并提取液，统一经膜处理，去除大分子物质和小分子的盐，喷雾干燥得到灰树花提取物，含有很高的多肽和β-葡聚糖。该工艺为β-葡聚糖的提取起到更好的增效效果，同时还降低了碱的用量，上述组合为本领域的首次应用，较之现有技术有明显的进步。
除此之外，本发明在碱提过程中采用氢氧化钾代替氢氧化钠，可实现废水在液体肥的应用。
综上所述，采用本发明的灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法采用破壁、酶提、碱提、膜处理等组合工艺，大大减少了碱的用量，提高了多肽和β-葡聚糖的收率。采用氢氧化钾代替氢氧化钠，废水中含有醋酸钾，钾盐可应用于液体肥的制备，解决了废水难处理的问题。本发明得到的灰树花提取物收率可以达到11％以上，其中多肽含量高于30％，β-葡聚糖含量高于60％，远高于现有技术的收率，且工艺简单，可操作性强，适合工业化规模生产。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
(1)将发酵灰树花菌丝体和食品级95％乙醇加入到提取容器中，乙醇最终质量百分比大于75％，搅拌脱脂12～24h，离心，干燥。将干燥好的灰树花菌丝体，采用超微粉碎机粉碎，得到的灰树花菌丝粉能过200目筛。
(2)准确称取100g灰树花超微粉，加入3kg纯净水,加入氢氧化钾调节pH值至8.5～10.5,加入0.5g酶活20万U/g的碱性蛋白酶，搅拌提取5h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用。
(3)向固形物中加入2L质量浓度为9％的氢氧化钾溶液，85℃温度下提取2h，提取2次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。
(4)合并步骤(2)酶提和步骤(3)碱提的离心清液，采用孔径0.5μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤。
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
以灰树花菌丝体干重计，所得灰树花提取物收率为12.02％，其中多肽含量33.28％，β-葡聚糖含量60.5％。
实施例2
(1)将发酵灰树花菌丝体和食品级95％乙醇加入到提取容器中，乙醇最终质量百分比大于75％，搅拌脱脂12～24h，离心，干燥。将干燥好的灰树花菌丝体，采用超微粉碎机粉碎，得到的灰树花菌丝粉能过200目筛。
(2)准确称取100g灰树花超微粉，加入2.5kg纯净水,加入1g酶活20万U/g的中性蛋白酶，搅拌提取6h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用。
(3)向固形物中加入3L质量浓度为7％的氢氧化钾溶液，85℃温度下提取2h，提取2次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。
(4)合并酶提和碱提的离心清液，采用孔径0.2μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤。
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
以灰树花菌丝体干重计，灰树花提取物收率为11.16％，其中多肽含量29.05％，β-葡聚糖含量64.68％。
实施例3
(1)将发酵灰树花菌丝体和食品级95％乙醇加入到提取容器中，乙醇最终质量百分比大于75％，搅拌脱脂12～24h，离心，干燥。将干燥好的灰树花菌丝体，采用超微粉碎机粉碎，得到的灰树花菌丝粉能过200目筛。
(2)准确称取100g灰树花超微粉，加入2kg纯净水,加入氢氧化钾调节pH值至7.5～9.5,加入1.0g酶活20万U/g的碱性蛋白酶和中性蛋白酶的混合酶，其中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比1:1混合，搅拌提取4h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用。
(3)向固形物中加入2.5L质量浓度为8％的氢氧化钾溶液，90℃温度下提取2h，提取2次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。
(4)合并酶提和碱提的离心清液，采用孔径0.5μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤。
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
以灰树花菌丝体干重计，灰树花提取物收率为12.25％，其中多肽含量30.47％，β-葡聚糖含量62.79％。
实施例4
(1)将发酵灰树花菌丝体和食品级95％乙醇加入到提取容器中，乙醇最终质量百分比大于75％，搅拌脱脂12～24h，离心，干燥。将干燥好的灰树花菌丝体，采用超微粉碎机粉碎，得到的灰树花菌丝粉能过200目筛。
(2)准确称取100g灰树花超微粉，加入3kg纯净水,加入氢氧化钾调节pH值至8.5～10.5,加入0.2g酶活20万U/g的碱性蛋白酶，搅拌提取3h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用。
(3)向固形物中加入3.5L质量浓度为6％的氢氧化钾溶液，87℃温度下提取2h，提取1次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。
(4)合并酶提和碱提的离心清液，采用孔径0.2μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤。
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
以灰树花菌丝体干重计，灰树花提取物收率为11.85％，其中多肽含量35.42％，β-葡聚糖含量58.06％。
实施例5
(1)将发酵灰树花菌丝体和食品级95％乙醇加入到提取容器中，乙醇最终质量百分比大于75％，搅拌脱脂12～24h，离心，干燥。将干燥好的灰树花菌丝体，采用超微粉碎机粉碎，得到的灰树花菌丝粉能过200目筛。
(2)准确称取100g灰树花超微粉，加入4kg纯净水,加入1g酶活20万U/g的中性蛋白酶，搅拌提取5.5h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液备用。
(3)向固形物中加入1L质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，90℃温度下提取2h，提取3次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。
(4)合并酶提和碱提的离心清液，采用孔径0.5μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，停止超滤。
(5)超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。
以灰树花菌丝体干重计，灰树花提取物收率为12.18％，其中多肽含量28.86％，β-葡聚糖含量65.11％。
比较例1
准确称取100g灰树花超微粉，加入2L质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，85℃温度下提取2h，提取2次，提取结束后，合并提取液，用乙酸中和，离心，收集清液。采用孔径0.5μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。灰树花提取物收率为4.68％，其中多肽含量8.72％，β-葡聚糖含量83.41％。
比较例2
准确称取100g灰树花超微粉，加入4L纯净水,加入氢氧化钾调节pH值至8.5～10.5,加入0.3g酶活20万U/g的碱性蛋白酶，搅拌提取5h，100℃灭酶10min，冷却，离心，分别收集清液和固形物，清液用盐酸调节pH至3.5～4.0，离心，收集清液采用孔径0.2μm的微滤膜过滤，透过液再用1kD的超滤膜脱盐，连续向截留液中加入纯净水洗脱除盐，直至截留液的电导率小于1mS/cm，可溶性固形物含量2～3％，超滤截留液喷雾干燥，得到含有多肽和β-葡聚糖的灰树花提取物。灰树花提取物收率为4.06％，其中多肽含量76.85％，β-葡聚糖含量10.26％。
可见本发明采用的灰树花菌丝体多肽和β-葡聚糖的联合制备方法对于灰树花提取物的收率有很大的提升，具有更好的推广和应用价值。
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