一株母乳来源罗伊氏乳杆菌防治特应性皮炎的应用
阅读说明：本技术 一株母乳来源罗伊氏乳杆菌防治特应性皮炎的应用 (Application of lactobacillus reuteri strain derived from breast milk to prevention and treatment of atopic dermatitis ) 是由 孙进 齐策 于 2021-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一株母乳来源罗伊氏乳杆菌防治特应性皮炎的应用,属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了罗伊氏乳杆菌FN041在预防和/或治疗特应性皮炎中的新用途,可以预防小鼠特应性皮炎的发生,改善小鼠耳朵肿胀程度和皮肤病理学症状；显著降低患轻度特应性皮炎儿童的SCORAD指数。因此,罗伊氏乳杆菌FN041在制备预防和/或治疗儿童特应性皮炎的产品中具有巨大的应用前景。(The invention discloses an application of lactobacillus reuteri from breast milk in prevention and treatment of atopic dermatitis, and belongs to the technical field of microorganisms and medicines. The invention provides a new application of lactobacillus reuteri FN041 in preventing and/or treating atopic dermatitis, which can prevent the occurrence of the atopic dermatitis of mice and improve the ear swelling degree and the skin pathological symptoms of the mice; significantly reduces the score of SCORAD in children with mild atopic dermatitis. Therefore, the lactobacillus reuteri FN041 has huge application prospect in preparing products for preventing and/or treating children atopic dermatitis.)
技术领域
本发明涉及一株母乳来源罗伊氏乳杆菌防治特应性皮炎的应用，属于微生物
技术领域
以及医药技术领域。背景技术
特应性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)是一种慢性、复发性、炎症性的皮肤病，其中约60％以上的患者初发于婴儿期，大多在2岁以内起病，并持续至青春期，甚至成年后。AD引起婴幼儿皮肤剧烈瘙痒，严重影响睡眠和生长发育；随着过敏过程的发展，孩子还容易患上哮喘、过敏性鼻炎和结膜炎。随着城市化的进程和社会的发展，近年来，中国由过敏引发的皮肤、呼吸道疾病发生率明显上升，我国1至7岁城市儿童特应性皮炎患病率已达12.94％，1～12月婴儿AD患病率达30.48％。其患病率的不断增加严重影响了患者和家庭的生活质量。特应性皮炎的发病原因已经确定，是由于患者体内辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T细胞2(Th2)的免疫失衡及未在免疫发育窗口期建立免疫耐受形成的。
现阶段，尚不存在针对AD的具有明确疗效的治疗药物。因此，目前主要是：1)通过外用药物如糖皮质激素类药物和钙调神经磷酸酶抑制剂发挥抗炎作用；2)外用氧化锌油(糊)剂、黑豆馏油软膏、生理氯化钠溶液及其他湿敷药物或磷酸二酯酶4养护皮肤或防止体液渗出；3)系统用药，包括口服抗组胺药物、免疫抑制剂、低剂量系统应用糖皮质激素、白细胞介素4(IL-4)/13受体a链的全人源单克隆抗体等生物制剂、Janus激酶抑制剂等；4)外用或系统进行抗细菌治、抗病毒治疗或抗真菌治疗。
但是，上述药物存在较大的不良反应，并且，多数患者对激素类药物存在顾虑，且不适合直接应用于婴幼儿，这些都给AD治疗带来了极大的困难。同时，也给患者以及其家庭的生活带来了极大的困扰。此外，目前的治疗措施主要用于改善症状，而不能调节患者的免疫平衡，也就不能从根本上改善患者的过敏体质。因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既适合于婴幼儿患者且不会给患者带来副作用，同时也能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展，并且能够应用于各类别的患者。
发明内容
本发明发现罗伊氏乳杆菌FN041具有缓解特应性皮炎的作用，因而本发明提供了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)FN041在制备用于目标人群预防和/或治疗特应性皮炎的产品中的应用；所述目标人群为妊娠期女性、哺乳期女性和/或儿童。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌FN041已公开于公开号为CN110205261A的专利文献中。
在一种实施方式中，所述预防和/或治疗特应性皮炎包括(a)～(d)所示任一：
(a)减轻炎症反应，缓解炎症增生；
(b)缓解患处肿胀程度；
(c)降低肥大细胞和嗜酸性粒细胞的数量；
(d)改善小鼠炎性细胞浸润程度。
在一种实施方式中，所述妊娠期为从妊娠第14周起至婴儿出生前。
在一种实施方式中，所述哺乳期为从婴儿出生起12个月内。
在一种实施方式中，所述目标儿童年龄不超过12周岁；优选的，所述目标儿童年龄不超过8周岁。
在一种实施方式中，所述特应性皮炎为轻度特应性皮炎，具体为特应性皮炎皮损面积≤40％体表面积。
在一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、药物或药物组合物和/或保健品。
在一种实施方式中，所述产品以活菌数不低于1×106CFU/天的剂量提供给儿童；优选的，以活菌数为1×109CFU/天的剂量提供给儿童。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌的形态包括活细胞、失活的细胞或罗伊氏乳杆菌的发酵产物或代谢物的形式，或上述任一所述形态的混合物形式。
在一种实施方式中，所述产品中所述罗伊氏乳杆菌的含量不低于1×104CFU/mL或1×104CFU/g。
在一种实施方式中，所述产品的剂型包括但不限于：片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、液体或果冻。
在一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
在一种实施方式中，所述食品包含使用含有罗伊氏乳杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、果蔬制品或饮料；或所述食品包含含有所述罗伊氏乳杆菌的固体饮料、片剂、软糖果和滴剂。
在一种实施方式中，所述食品、保健品中还包含常规辅料，所述辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供了罗伊氏乳杆菌FN041在预防和/或治疗特应性皮炎中的新用途，并具备良好的效果，在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品中具有巨大的应用前景。
动物实验表明：
(1)母代小鼠在妊娠期和泌乳期服用罗伊氏乳杆菌FN041可预防子代发生特应性皮炎，表现为显著改善断奶子代小鼠耳朵肿胀程度和皮肤病理学症状；
(2)母代小鼠在妊娠期和泌乳期服用罗伊氏乳杆菌FN041，同时子代小鼠也服用罗伊氏乳杆菌FN041，可改善子代小鼠耳朵的肿胀程度和皮肤病理学症状；
(3)幼龄子代小鼠给予罗伊氏乳杆菌FN041显著改善耳朵肿胀程度和皮肤病理学症状。
人体实验表明：
在给患轻度特应性皮炎儿童服用含有罗伊氏乳杆菌FN041的益生菌菌粉之后，可以显著降低患轻度特应性皮炎儿童的SCORAD指数。
附图说明
图1为实验设计图；在小鼠妊娠晚期和哺乳期每日灌胃罗伊氏乳杆菌FN041或鼠李糖乳杆菌GG处理(1×109CFU/天)，断奶后用MC903抹子代小鼠右耳，诱导特应性皮炎。GDMCC60546，罗伊氏乳杆菌FN041；LGG，鼠李糖乳杆菌GG；MC903，钙泊三醇。
图2为母代小鼠摄入益生菌预防子代发生特应性皮炎的效果图；A.GDMCC60546处理明显预防了子代小鼠由MC903诱导耳朵红肿；B.MC903处理后小鼠每日耳朵厚度；C.MC903处理终点时小鼠耳朵相对于正常对照组的厚度；GDMCC60546，罗伊氏乳杆菌FN041；LGG，鼠李糖乳杆菌GG；MC903，钙泊三醇。
图3为特应性皮炎小鼠耳朵切片病理特征；A.典型苏木精-伊红染色、肥大细胞染色(甲苯橄胺蓝染色)或嗜酸性粒细胞(Carbol 2R染色)典型病理图片；B.病理切片单位面积肥大细胞含量；C.病理切片单位面积嗜酸性粒细胞含量；GDMCC60546为罗伊氏乳杆菌FN041；LGG为鼠李糖乳杆菌GG；MC903为钙泊三醇。
图4为特应性皮炎患者的SCORAD指数临床试验流程图。
图5为不同组别降低轻度特应性皮炎患者SCORAD指数的效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的酶水解脱脂乳、葡萄糖﹑胰蛋白胨与酵母浸膏购自上海医药集团股份有限公司。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中所使用的罗伊氏乳杆菌FN041公开于专利公开号为CN110205261A的专利文献中。
实施例l：罗伊氏乳杆菌FN041对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响
将7周龄雄性和雌性BALB/C小鼠(按个数比2:1)饲养在聚丙烯笼子中，待雌性受孕后，将雄性从笼子中取出，将母鼠随机分为4组，分别为：空白组(Control)、MC903诱导皮炎组(AD)、MC903诱导皮炎且灌胃罗伊氏乳杆菌FN041组(AD+GDMCC60546)、MC903诱导皮炎且灌胃鼠李糖乳杆菌GG组(AD+LGG)，其中，AD+GDMCC60546组、AD+LGG组均为治疗组。
在孕鼠产前一周开始灌胃治疗：空白组和MC903诱导皮炎组灌胃PBS(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，AD+GDMCC60546组每天灌胃罗伊氏乳杆菌FN041(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，AD+LGG组每天灌胃鼠李糖乳杆菌GG(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，直至3周哺乳期结束。
在幼龄子代断奶后，用MC903诱导子代特应性皮炎，总计7天，每天用MC903 20μL涂抹子代小鼠右耳，左耳用等量无水乙醇对照，空白组不处理，同时对子代各分组也进行同母鼠的灌胃处理，所有分组均为自由饮水和摄食。上述实验流程可参见图1。造模开始前(即第0天)利用电子游标卡尺测定4组小鼠的耳朵厚度，随后每天测量小鼠耳朵厚度的变化情况，造模结束后(即第8天)对小鼠进行拍照，处死小鼠。
由图2可知，罗伊氏乳杆菌FN041与鼠李糖乳杆菌GG治疗组在实验后显著降低了模型组小鼠耳朵的厚度以及小鼠耳朵的红肿程度(P<0.05)。与AD+LGG组相比，罗伊氏乳杆菌FN041对小鼠耳朵厚度的降低程度更大，对小鼠耳朵肿胀程度的缓解能力更强。在处理第5天，GDMCC60546处理抑制小鼠耳朵肿胀程度可达50％，比LGG多25％。在第七天，GDMCC60546维持了50％的抑制率，比LGG高30％。
实施例2：罗伊氏乳杆菌FN041对特应性皮炎小鼠皮肤炎症的影响
将7周龄雄性和雌性BALB/C小鼠(按个数比2:1)饲养在聚丙烯笼子中，待雌性受孕后，将雄性从笼子中取出，将母鼠随机分为4组，分别为：空白组(Control)、MC903诱导皮炎组(AD)、MC903诱导皮炎且灌胃罗伊氏乳杆菌FN041组(AD+Fn041)、MC903诱导皮炎且灌胃鼠李糖乳杆菌GG组(AD+LGG)，其中，AD+Fn041组、AD+LGG组均为治疗组。
在孕鼠产前一周开始灌胃治疗，空白组和MC903诱导皮炎组灌胃PBS(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，AD+Fn041组每天灌胃罗伊氏乳杆菌FN041(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，AD+LGG组每天灌胃鼠李糖乳杆菌GG(1×109CFU/天，每天1次，每次100μL)，直至3周哺乳期结束。
在幼龄子代断奶后，用MC903诱导子代特应性皮炎，总计7天，每天用MC903 20μL涂抹子代小鼠右耳，左耳用等量无水乙醇对照，空白组不处理，所有分组均为自由饮水和摄食。具体实验流程如图1。造模结束后(即第8天)取血并处死小鼠，制作耳朵切片，分别进行伊红苏木精染色、肥大细胞染色(甲苯胺蓝染色)和嗜酸性粒细胞染色(Carbol 2R染色)。
由图3可知，空白组小鼠耳部皮肤表皮细胞结构正常，表皮各层未见炎症反应；皮炎组小鼠耳朵皮损病理学呈明显炎症增生性改变，同时耳朵红肿程度加重，肥大细胞和嗜酸性粒细胞的数量明显增多；罗伊氏乳杆菌FN041与鼠李糖乳杆菌GG治疗组的小鼠耳部皮肤红肿程度减弱，且炎症增生缓解，嗜酸性粒细胞以及肥大细胞的数量明显减少，且罗伊氏乳杆菌FN041治疗小鼠的耳朵红肿程度更轻，炎性细胞浸润更少。MC903诱导，使小鼠耳朵肥大细胞增多2.3倍左右。GDMCC60546处理后，可使耳朵切片每平方毫米的肥大细胞数量降低62％，而LGG处理仅降低56％。MC903诱导，使小鼠耳朵嗜酸性粒细胞增多12倍左右，MC903诱导，使小鼠耳朵切片每平方毫米的嗜酸性粒细胞减少67％，而LGG可使其减少58％。
以上实验表明，母代摄入罗伊氏乳杆菌FN041和LGG都可预防子代小鼠发生AD，可显著缓解特应性皮炎模型小鼠的耳朵肿胀程度，改善小鼠炎性细胞的浸润程度，从而有效地缓解了小鼠的特应性皮炎症状，并且GDMCC60546的作用优于LGG。
实施例3：罗伊氏乳杆菌FN041对4～7岁儿童特应性皮炎患者SCORAD指数的影响
本次临床试验共招募80名特应性皮炎儿童患者，所有患者被随机分为3组，三组分别为
A组：服用麦芽糊精的安慰剂组(20人)，
B组：服用鼠李糖乳杆菌GG的治疗组(LGG组)(25人)，
C组：服用罗伊氏乳杆菌FN041的治疗组(GDMCC60546组)(35人)。
其中，安慰剂组服用的产品是不包含益生菌成分的麦芽糊精；GDMCC60546组服用的是含有罗伊氏乳杆菌FN041(活菌数1×109CFU/条)的益生菌菌粉；LGG组服用的是含有鼠李糖乳杆菌GG(活菌数1×109CFU/条)的益生菌菌粉。
患儿纳入标准为：1)特应性皮炎皮损面积≤40％体表面积者；2)患儿及家长知情，家长签署了知情同意书；3)依从性好；4)就诊前2周内未接受糖皮质激素、免疫调节剂、抗组胺药物治疗者。
排除标准为：1)伴有器质性、免疫性、感染性、血液系统疾病者；2)观察前2周内曾系统性接受光疗、细胞生长抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂治疗者；3)未参加其他试验。
在整个试验过程中，罗伊氏乳杆菌FN041和鼠李糖乳杆菌GG的给菌方式均为益生菌菌粉，可直接服用或温水(不超过37℃)冲服服用，用量为1条/天。
试验预备期2周，临床试验期8周，共计10周。
预备期：在试验前2周联系患病儿童，统计有意参与试验人数，向他们及家长或其他监护人解释说明试验性质和内容，签订知情同意书，同时协调医院和医生的时间，以及准备试验所需的材料。
临床试验期：对指经过医生确诊、自愿、监护人同意参加试验的儿童，服用安慰剂、益生菌(外包装完全一致)，持续8周。实验前对儿童和家长进行一次集中教育，说明引起AD的原因和饮食是、生活中避免AD的措施，希望他们在试验期间坚持相应原则。
在预备期结束后、临床试验初和结束后，进行诊断。记录皮损面积，临床特征﹑瘙痒和睡眠丧失程度及分值等观察指标，询问依从性，记录不良反应，具体实验流程如图4。采用SCORAD指数评估对轻度AD程度，包括：
1.评价面积(9法则)，最大评分100，注意2岁以下婴儿和成人的区别。
2.评价六个临床特征：红斑/颜色加深；水肿/丘疹；渗出/结痂；剥蚀；苔藓化/痒疹；干燥。
前5个评价单个平均的有代表性的部位，干燥评价未受累部位。
评分尺度：0-3，0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度，最大分值18分。
3.两个视觉模拟标尺：患者评价过去3天(晚)前的瘙痒和睡眠丧失平局程度。
前两项为客观SCORAD，可以独立使用，最大分值83分，加上第3项最大分值103分。
如图5所示，最终5名患儿被排除在外，共75名完成了临床研究，患儿分别服用8周的益生菌菌粉﹑安慰剂，罗伊氏乳杆菌FN041组患者经过评估后其SCORAD指数相比于服用益生菌之前显著下降(P<0.05)，患者症状出现明显的改善。在干预初期三组SORAD物显著差异。干预末期两种益生菌都可以缓解SCORAD指数，其中LGG处理使SCORAD降低月16％，而GDMCC60546处理后，SCORAD降幅达到28％。
实施例4：含有罗伊氏乳杆菌FN041的发酵果蔬饮料的制备
具体步骤如下：
先将新鲜蔬菜、水果洗净后榨汁，然后将获得的果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒后立即降温到温度约42℃，按106CFU/mL果蔬汁接种罗伊氏乳杆菌FN041，最后将接种后的果蔬汁于在42℃下发酵16h，即得含有罗伊氏乳杆菌FN041活菌的发酵果蔬饮料。
经检测，此含有罗伊氏乳杆菌FN041活菌的发酵果蔬饮料的pH为3.6，活菌数可达l.5×109CFU/mL。
将此含有罗伊氏乳杆菌FN041活菌的发酵果蔬饮料连续一周给特应性皮炎儿童患者服用，可有效缓解患者皮炎患处肿胀，也可有效降低患者SCORAD指数，使患者症状与生活质量出现明显的改善。
实施例5：含有罗伊氏乳杆菌FN041的发酵乳的制备
具体步骤如下：
先将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)添加2％酪蛋白肽，后经95℃、20min或140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至40℃，然后将罗伊氏乳杆菌FN041按照体积百分比3～5％的接种量接种到灭菌后的原料乳，再在接种了罗伊氏乳杆菌FN041的原料乳中按照体积百分比3～5％的接种量接种可共生的制备酸奶的商业发酵剂保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌，最后将接种后的原料乳于42℃混菌发酵4h，即得到含有本发明罗伊氏乳杆菌FN041活菌的发酵乳。
经检测，此含有罗伊氏乳杆菌FN041活菌发酵乳的滴定酸度达到了75°T，活菌数达到了1×109CFU/mL。
将此含有罗伊氏乳杆菌FN041活菌的发酵乳连续一周给特应性皮炎患者服用，可有效缓解患者皮炎患处肿胀，也可有效降低患者SCORAD指数，使患者症状与生活质量出现明显的改善。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：包含酪蛋白的组合物及其生产方法