具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了247种 药物活性成分可有效抑制新型冠状病毒PL^pro蛋白。实验表明，本发明的活性成分(以 CD0945-G005、CD0946-B009、CD3226-D010、CD3531-C011为代表)，可高效地抑新 型冠状病毒PL^pro蛋白的活性。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明揭示了选自下组的药物性活性成分及其药物组合物： CD0945-G005在抗新型冠状病毒中的用途。本发明的药物活性成分具有优良的抑制 新型冠状病毒PL^pro蛋白活性的作用从而抑制新型冠状病毒的复制，具有良好的临 床应用前景。

术语

如本文所用，、“本发明的活性成分”、“本发明的抑制新型冠状病毒PL^pro蛋白的活性成分”、“247种化合物”“247种活性成分”、“本发明的有效成分” 可互换使用，指具有优异的抑制冠状病毒PL^pro蛋白活性的任一活性成分，包括选 自表1的247种的化合物中任一化合物及其组合。

如本文所用，“本发明的制剂”指含有本发明活性成分的制剂。

如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被 理解为包括所述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCov”或“SARS-CoV-2”可互 换使用，该2019新型冠状病毒是已知感染人的第7种冠状病毒，并且造成新冠肺 炎(COVID-19)，是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。

冠状病毒

冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。

目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病 毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病 毒。SARS-CoV-2也被称为2019-nCov。

高致病性冠状病毒“非典”SARS-CoV和“中东呼吸综合征”MERS-CoV均属于 β属冠状病毒。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与 MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。

该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码 包括复制酶、PL^pro蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶 段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(Polyprotein)， 随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白 (如PL^pro蛋白)及辅助蛋白。

本发明的活性化合物和活性成分

在本发明中，提供了可有效抑制冠状病毒PL^pro蛋白活性的活性成分。该活性 成分为选自如下所示的表1化合物或其药学上可接受的盐、或其组合。

表1 247种化合物

试验表明，本发明的活性成分可有效地抑制新型冠状病毒的PL^pro蛋白活性， 从而预防、治疗和/或缓解新型冠状病毒的相关疾病。

如本文所用，“本发明的活性成分”“本发明的活性成分”“本发明的活性 化合物”、“本发明的抑制冠状病毒复制的活性化合物”可互换使用，指具有优异 的抑制冠状病毒复制的活性的化合物。

应理解，本发明的活性成分包括表1中的任一化合物及其组合。

或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体、或其前药。 应理解，本发明的活性成分还包括本发明的活性化合物的晶型、无定形化合物、以 及氘代化合物等形式。

所述“药学上可接受的盐”为本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应形 成常规的无毒盐。例如，常规的无毒盐可通过本发明的活性化合物与无机酸或有机 酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，所 述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺 酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙 酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷 氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者本发明的 活性化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒 石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、锌盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者本发明的活性化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后 再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、 乙酸、苦味酸、甲磺酸或乙磺酸形成的对应的有机酸盐；或者本发明的活性化合物 分子中的羧基/酚羟基与无机碱形成的钠盐、锌盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐。

此外，本发明的活性成分还特别适合与其他抗冠状病毒的药物联用。代表性 的其他的抗冠状病毒药物包括(但并不限于)：干扰素、RNA依赖的RNA聚合酶抑制 剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734)、法匹拉韦(favipiravir)、Galidesivir、 GS-441524)；3CL蛋白酶抑制剂(如GC-376)、洛匹那韦(Lopinavir)、利托那韦 (Ritonavir)、奈非那韦(Nelfinavir)；氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)、羟氯喹、 环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(Carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素 (baicalein)、萘酚喹(Naphthoquine)、环索奈德(Ciclesonide)、利巴韦林 (Ribavirin)、喷昔洛韦(Penciclovir)、来氟米特(Leflunomide)、特立氟胺 (Teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦 (Darunavir)、阿比多尔(Arbidol)、卡莫司他(Camostat)、氯硝柳胺(Niclosamide)、 巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(Ruxolitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、沙奎 那韦(Saquinavir)、Beclabuvir、司美匹韦(Simeprevir)、或其药学上可接受的盐、 或其组合。所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素 α-n3、干扰素β-1a、干扰素β-1b中的一种或多种。

此外，由于SARS-CoV-2感染可引起急性肺损伤、炎症反应甚至细胞因子风暴， 本发明的活性成分还特别适合与具有改善急性肺损伤、抗炎作用或调节免疫作用的 药物联用。代表性的药物包括但不限于锌(Zinc)、芬戈莫德(Fingolimod)、维生素 C(Vitamin C)、奥美沙坦酯(Olmesartan Medoxomil)、缬沙坦(valsartan)、氯沙 坦(Losartan)、沙利度胺(Thalidomide)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、青蒿素 (Artemisinin)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)、青蒿琥酯(Artesunate)、青 蒿酮(Artemisone)、阿奇霉素(Azithromycin)、七叶皂苷(Escin)、萘普生 (Naproxen)。

优选地，本发明的活性成分与青蒿素类药物(青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、 青蒿酮中的一种或多种)联用。大量研究显示青蒿素类药物具有多重的抗炎、免疫 调节机制，通过抑制T细胞增殖与活化，抑制B细胞活化和抗体产生，增加调节性 T细胞以及减少致炎细胞因子的释放来实现抗炎、免疫调节功能，预期能够缓解新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的免疫损伤症状。

优选地，本发明的活性成分与青蒿素类药物(青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、 青蒿酮中的一种或多种)、阿奇霉素联用。

本发明的活性成分可抑制SARS-CoV-2等新型冠状病毒的感染活性。因此，当 在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制2019新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的感染，进而达到抗病毒作用。

药物组合物和应用

本发明还提供了以本发明的抑制冠状病毒复制的活性化合物、或其药学上可 接受的盐、或其前药的一种或多种的混合物为有效成分，在制备治疗和/或预防、 缓解由2019新型冠状病毒等冠状病毒感染引起的呼吸道感染、肺炎等相关疾病的 药物中的用途。

本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是本发明的活性化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％或1wt％～50wt％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。

需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、 糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释 液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。

本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制 剂配方的单位计量中通常包含0.05-400mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配 方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。

本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以 通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为 0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何 种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始， 逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、 滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、 静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。

典型地，本发明活性成分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药 途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘 膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括 水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包 括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括 硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、 气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明活性成分可以被制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向 制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明活性成分被制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂， 包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、 糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷 酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、 糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯 烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交 联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚 氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片， 或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明活性成分与稀释剂、助流 剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合 剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明片剂的各 稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明的胶囊剂。

为将本发明活性成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的 混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、PH调剂剂、渗透压调节 剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；PH调剂剂 可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、 葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为 支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或 其他添加剂。

本发明的活性成分或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。

当本发明的活性成分与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整 它的剂量。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明活性化合物可高效地抑制SARS-CoV-2(新型冠状病毒),具有明显的 抗病毒效应。其中WNN3369-C011抑制SARS-CoV的IC₅₀值约为0.18μM； NCRW0370-F002抑制SARS-CoV-2的IC₅₀值仅为0.28μM；RUS0093-G006抑制 SARS-CoV-2的IC₅₀值约为0.32μM；WNN3768-D008抑制SARS-CoV-2的IC₅₀值约为 0.5μM；PC0003-B003抑制SARS-CoV-2的IC₅₀值约为0.51μM。

(b)本发明活性化合物的毒副作用低，成药性好。提示着本发明活性成分在抗 新冠肺炎领域有很好的药用前景。其中代表化合物CD0945-G005抑制SARS-CoV活 性94.26％时，细胞毒性仅为6.03％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.抗SARS-CoV-2病毒表面PL^pro蛋白-活性实验

本实施例采用的实验仪器：酶标仪EnvisionTM(PerkinElmer,USA)，实验 材料：重组SARS-CoV2 PL^pro全长蛋白，利用大肠杆菌表达系统表达并纯化获 得；多肽底物Z-RLRGG-AMC由吉尔生化公司合成。

测试原理：基于SARS-CoV-2PL^pro蛋白是一种蛋白水解酶的基本特点，建 立荧光法检测SARS-CoV-2PLpro蛋白活性的筛选体系。SARS-CoV-2PL^pro蛋 白可特异性识别并剪切双甘氨酸多肽，其活性检测可采用荧光多肽为底物，通 检测荧光信号的生成来反应其蛋白水解酶的活性。

具体地，SARS-CoV2 PL^pro是一种蛋白水解酶，其可特异性可特异性识别 并剪切双甘氨酸多肽，其活性检测可采用荧光多肽Z-RLRGG-AMC为底物，当 SARS-CoV2 PL^pro发挥蛋白酶的活性时，剪切多肽链，使荧光基团AMC得到释 放，从而在355nm激发光的作用下，AMC能够释放出460nm波长的发射光， 通过检测460nm波长荧光信号的生成来反应SARS-CoV2PL^pro的活性。

测试方法：本试验总体积为50μL，具体反应体系为：20mM Tris pH8.0,,0.01％Tween20,0.5mM DTT,40nM PL^pro,50μM底物多肽以及不同浓 度梯度的化合物，同时设置只加DMSO的溶剂对照组。

样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影 响检测活性的范围之内。初筛选择单浓度条件下，例如10μg/mL，对样品的活 性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％Inhibition大 于50，测试活性剂量依赖关系，即IC₅₀值，通过样品活性对样品浓度进行非线 性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 5，拟合所使用的模型为sigmoidal dose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和 顶部设定为0和100。

实验结果：测得247种化合物抑制SARS-Cov-2的活性如表2所示。

表2：247种化合物抑制SARS-Cov-2PL^pro蛋白的活性

实施例2抗SARS-CoV-2病毒细胞毒性实验

测试原理：以感染SARS-CoV-2病毒的细胞作为病毒宿主细胞，测试样品阻断SARS-CoV-2复制的活性，该活性可反应样品干预SARS-CoV-2感染关键靶点的抗病 毒活性。检测指标为假病毒基因组上报告基因活性水平。

测试方法：

感染病毒的细胞提前一天接种于96孔培养板，分别设活性板和细胞毒性板， 置37℃，5％CO₂培养。活性测定板和细胞毒性测定板按同样加样方式，加入不同 稀释浓度的样品和SARS-CoV-2假病毒悬液，设病毒对照、细胞对照和样品对照。 继续培养3天后，细胞毒性板采用MTT法测定细胞存活率。活性板吸去培养液后加 入100μL每孔细胞裂解液，震荡裂解5分钟后，每孔再加入100μL的Luciferase 反应检测液，震荡孵育5分钟后测定化学发光值。

评价方法：

细胞毒性(MTT法)：通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算 细胞的存活率，并进一步计算样品的细胞毒作用。

实验结果：

测得247种化合物抗SARS-CoV-2病毒活性以及细胞毒性的数据如表3所示：

表3 247种化合物抗SARS-CoV-2病毒活性以及细胞毒性

由表3可知，本发明的化合物不仅可以有效地抑制SARS-CoV-2病毒活性， 还能同时保证较低的细胞毒性。尤其地，代表化合物CD0945-G005抗病毒活性 为94.26％的时候，细胞毒性仅仅为6.03％。因此，本发明的优选化合物能够广 泛地应用于临床，有很好的药用前景。

讨论

1.冠状病毒是一种RNA病毒，其增殖依赖于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp) 的对母系RNA的再生，其中SARS-Cov-2是导致新冠肺炎的元凶，SARS-Cov-2 PL^pro蛋白是2019-nCoV关键蛋白RdRp成为活性形式的关键蛋白之一，目前 SARS-Cov-2 PL^pro已被认为是治疗冠状肺炎的药物靶标之一。本发明的表2中的 化合物表现出非常优异的SARS-Cov-2 PL^pro抑制活性。本发明化合物针对 SARS-Cov-2 PL^pro的IC₅₀值可以低至0.18±0.03μM，提示其具有抑制SARS-Cov-2 增殖的能力，从而达到治疗新冠肺炎。

2.冠状病毒作为一种病毒亚种，具有较为相似的发病机制及全生命周期， 目前主要包括重症急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV(Severe acute respiratory syndromecoronavirus，SARS-CoV)、2019新型冠状病毒 (2019-nCoV或SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)或致普通感冒的冠状病毒； 所述的致普通感冒的冠状病毒优选人冠状病毒OC43(Humancoronavirus OC43)、人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E)、人冠状病毒NL63(Humancoronavirus NL63)、人冠状病毒HKUl(Human coronavirus HKUl)等，不同的 冠状病毒具有同源性高的类木瓜蛋白酶PLpro，因此通过SARS-CoV-2Plpro发 现的新型化合物通过可能具有抑制其他冠状病毒的功能，因此本发明化合物同 样为其他冠状病毒提供了新的解决方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。