一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法
阅读说明：本技术 一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法 (Preparation method of photoelectrochemical immunosensor for detecting collagen ) 是由 王秉 周晴晴 傅悦悦 彭志勤 万军民 于 2021-01-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及光电化学传感领域,公开了一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法,本发明首先提取胶原蛋白并合成g-C-3N-4-MoS-2纳米复合半导体材料,接着进行锰卟啉的制备,并使IMAs负载Ab-2,然后逐层自组装制备间接型传感器。卟啉纳米管具有较大的比表面积,可增强电信号,提高催化能力。g-C-3N-4-MoS-2构成了2D-2D异质结,通过能带的匹配,来增大光电流信号的响应,可以有效的抑制光生电子空穴对的重组并且增强其光捕获能力。含有聚苯乙烯微球为核心MPS100/羧基珠粒,其高分子聚合物表面带有丰富的羧基,可以与活性氨基共价偶联。(The invention relates to the field of photoelectrochemical sensing, and discloses a preparation method of a photoelectrochemical immunosensor for detecting collagen 3 N 4 ‑MoS 2 Nano composite semiconductor material, preparing manganese porphyrin and loading IMAs with Ab 2 And then self-assembling layer by layer to prepare the indirect sensor. The porphyrin nanotube has large specific surface area, and can enhance electric signals and improve catalytic capability. g-C 3 N 4 ‑MoS 2 A 2D-2D heterojunction is formed,by matching energy bands, the response of a photocurrent signal is increased, the recombination of photo-generated electron-hole pairs can be effectively inhibited, and the light capture capability of the photo-generated electron-hole pairs can be enhanced. The MPS 100/carboxyl bead with polystyrene microsphere as core has rich carboxyl on the surface of polymer and can be covalently coupled with active amino.)
技术领域
本发明涉及光电化学传感领域，尤其涉及一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法。
背景技术
胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病，在肿瘤的发生与转移中，胶原的分布和类型也发生改受因此在提取时常将各型分别提取。胶原不仅作为组织的支持物，而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越性，因此近20年来已被广泛用于临床.近年来，世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损，覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽再建及颌骨空腔修复。
古代胶粘剂作为一种有机高分子材料，常包含大量的胶原，Ⅰ型胶原是结缔组织间质中最主要的成分，一般制品多以Ⅰ型胶原为材料。对胶粘剂进行胶原检测，可以对文物发展进行溯源。但是，由于常年处于地下墓葬环境中易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，另一方面，文物出土的时候往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。所以常规的检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对文物进行检测。
国内外报道的纺织品残留物的分析方法主要有化学降解法和生物质谱法等。然而，古代纺织品成分复杂，微小的成分变化就会导致质谱测定的较大误差，而且整个实验过程也必须经过残留物提取、酶切、质谱分析、结果分析等实验步骤，很是繁琐。因此，寻找一种灵敏度极高、特异性极强、快速、高效的方法对纺织品残留物进行鉴定显得尤为重要。将光激发过程与电化学检测相结合使得 PEC 传感器极大地减少了背景信号的干扰，此外，设备简单、成本低廉、灵敏度高。
卟啉卟啉是一类具有诸多重要酶活性点的仿生性质的大π结构的化合物，也是自然界众多蛋白质和酶的活性中心，因具有独特的结构和优越的性质，被各领域广泛研究。当胶原文物与铜和铁之类的金属器皿一起埋入地下时，金属离子会与胶原相互作用，形成矿化的纺织品，但传统检测技术无法有效解决矿化纺织品的材质问题。IMB可以从矿化样品中检测到胶原蛋白。免疫配基的功能基可以是羟基（-OH），氨基（-NH2），羧基（-COOH），醛基（-CHO），从而使载体微球表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同的物理性质。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，本发明首先进行胶原蛋白的提取和锰卟啉纳米材料的制备，然后进行g-C3N4-MoS2纳米复合材料和免疫磁珠的制备，最后通过逐层自组装工艺，制备间接型[email protected]2/ Ab1/collagen 1/g-C3N4-MoS2/ITO光电化学免疫传感器。
本发明的具体技术方案为：
一种用于检测胶原蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：胶原蛋白的提取：将15-20g新鲜牛皮切成0.5-1cm的小块，清水清洁，加入8-12ml 质量分数为5-10%的碳酸钠溶液作为脱脂液，继续加入40-50ml的35-45℃温水，搅拌10-15min，过滤并再重复一次上述操作；放入20-25ml 3%醋酸中40-50h后离心1-3h，离心速率为7000-8000r/min，吸取上清加入25-35%浓盐水10-15ml，盐析25-30min后，将沉淀溶入15-20ml 0.1%醋酸内，置透析袋内，用截留分子量为7000-13000的纤维素透析袋在20-25ml 1mol/l的HCl溶液中透析2-3天，并每隔4-5h换一次水，其间换水4-6次；向透析所得产物加入氯仿，敞开容器口，用无菌纱布包住，置无菌工作台使氯仿挥发，得到胶原溶液，真空冷冻干燥，备用。
胶原蛋白主要以Ⅰ型为主，分子量在80kDa-130kDa之间，过滤并再重复两次操作，有利于提高胶原的纯度，抽提的次数不应太少，否则纯度不够，抽提次数太多则易发生胶原变性，所以所用抽提次数为3-4次。
步骤2：锰卟啉纳米材料的制备：往反应容器中通入氮气进行脱气，8-10 min后加入100-120 ml的N，N-二乙基甲酰胺，加热至微沸回流，然后加入80 -90mg的四磺酸苯基卟啉，搅拌8-10 min至澄清透明，再加入90-100 mg氯化锰，在100-110℃、氮气气氛下机械搅拌，6-10 h后将反应产物冷却至室温，并倾入120-130 ml的去离子水中，静置3-5 h，过滤，滤饼依次用水和乙醇分别洗涤；所得粗产物以试剂级硅胶为吸附剂，三氯甲烷/甲醇溶液为淋洗剂，收集第一粉色带，真空旋蒸得到锰卟啉纳米管，放入干燥器中，保存备用。
卟啉纳米管具有较大的比表面积，可增强电信号，提高催化能力。卟啉纳米管与g-C3N4-MoS2异质结的优异性质，二者的复合将有助于降低氧化或还原过电位，提高材料对光的灵敏性，材料巨大的比表面积可增加电子的迁移率，有助于将光信号转化为电信号。
步骤3：g-C3N4-MoS2纳米复合材料的制备：将盛有4.8-5.0g白色三聚氰胺粉末的带盖坩埚放入马弗炉中，在500-550℃下煅烧3-5h，待自然冷却到室温，将黄色g-C3N4产物研磨成粉末，然后将1g g-C3N4粉末放入80-120ml 5M的HNO3溶液中，在120-125℃下回流20-30h冷却后，离心，并用去离子水清洗至pH为6.8-7.2；最后在30-35℃的真空烘箱中干燥101-5h，制得羧基化g-C3N4；通过在40-50ml超纯水中溶解摩尔比为1:4-6的钼酸钠和硫脲来制备MoS2，取羧基化的g-C3N4加入MoS2溶液中，并进行水热反应；最后，收集冷却的样品，用超纯水洗涤，并在氮气保护下进行干燥，备用。
作为一种非金属半导体光活性材料，g-C3N4的光电性能受到了人们的广泛关注，例如较低的禁带宽度(2.69eV)、高化学稳定及热稳定性、良好的生物相溶性、环境友好及原料充足等。尽管g-C3N4有上述这些优点，但是由于它具有很高的光生电子空穴对重组率，使其在光电化学中的应用受到了很大限制，必须对g-C3N4进行改性处理。MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。尽管MoS2纳米材料具有相对较低的禁带宽度，但是其本身也如同g-C3N4一样具有很多不足。将g-C3N4与MoS2纳米材料结合起来，g-C3N4-MoS2构成了2D-2D异质结，2D/2D异质结相较于OD/2D、1D/2D异质结来说，电子的扩散距离相对短，通过能带的匹配，光电转换效率高，光电流较稳定，可以有效的抑制光生电子空穴对的重组并且增强其光捕获能力。
步骤4：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取1-1.2 mg羧基磁珠于离心管中，用180-200 µl去离子水洗一次，除去上清；接着用150-250 µl 100 mM MES洗1-2次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，800-1000 rpm/min反应1.5-2.5h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用PBST清洗， PBS清洗，加入400-600 µL TTbuff震荡反应20-40 min，去除上清，用PBS清，后用BSA溶液封闭4-6 h；加入0.8-1.2 ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀即得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
含有聚苯乙烯微球为核心的MPS100 /羧基珠粒，其高分子聚合物表面带有丰富的羧基，可以与活性氨基共价偶联。抗体是一种具有游离活性氨基的蛋白质，可以与羧基结合形成稳定的酰基铵键。免疫磁珠还可以增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
步骤5：ITO导电玻璃电极预组装：分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10-20min，氮气吹干，之后用氟化密封胶带包裹ITO电极使之有效面积固定为0.14-0.18cm2，向电极上滴加步骤2所得锰卟啉、步骤3所得g-C3N4-MoS2与CS乙酸溶液；再将该电极放入硅胶干燥盒中室温下干燥，烘干，得到g-C3N4-MoS2/ITO电极，用超纯水蘸洗以除去表面未结合的锰卟啉、g-C3N4 -MoS2和CS，接着将10-15ul的1%GA溶液滴在电极上并在室温下保持0.5-1.5h，之后用去离子水洗掉过量的GA；将8-12ul的10ul/ml步骤1所得胶原蛋白的CB溶液滴加到电极表面，使其端氨基与GA的醛基结。
步骤6：构建间接型免疫探针：用PBS缓冲液彻底清洗去除步骤5中未与电极表面结合的抗原后，再用10-15 ul 的1 % BSA在35-40 ℃下将电极封闭20-40 min，随后，用1%的BSA封闭0.5-1.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加5-10ul 1ul/ml的兔抗胶原蛋白抗体溶液，即Ab1溶液，置于25-35℃中50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1，最后滴加8-12ul的步骤4所得负载Ab2的免疫磁珠，置于30-35℃中50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，将电极置于检测底液中，即完成光电化学免疫传感器的组装。
作为优选，步骤1中，向透析所得产物加入0.05-0.1ml氯仿，敞开容器口，用无菌纱布包住，置无菌工作台40-50h使氯仿挥发，得到胶原溶液，真空冷冻干燥2-3天，备用。
作为优选，步骤2中，滤饼依次用水和乙醇各洗两次，以150-250目的试剂级硅胶为吸附剂，体积比为（4-6）:2的三氯甲烷/甲醇溶液为淋洗剂。
作为优选，步骤3中，取0.8-1.2g羧基化的g-C3N4加入3 ml MoS2溶液中，并在180-190℃下进行20-30h的水热反应。
作为优选，步骤4中，加入35-40 µl 100 mM MES重悬，加入稀释1000倍的Ab2，震荡反应20-40 min；加入40-50 µl 10 mg/ml EDC溶液，800-1000 rpm/min反应1.5-2.5 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；所述Ab2为羊抗兔抗1型胶原蛋白。
作为优选，步骤5中，向电极上滴加比例为1:1:2.5-3.5的步骤2所得锰卟啉、步骤3所得g-C3N4-MoS2与0.05wt%的CS乙酸溶液10-15ul；再将该电极放入硅胶干燥盒中室温下干燥10-15小时，70-80℃烘干1.5-2.5h，得到g-C3N4-MoS2/ITO电极。
作为优选，所述CB溶的pH=9.6，所述PBS缓冲液的pH=7.4。
作为优选，步骤5中，本发明检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，作为光电阳极电流的电子供体。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）胶原蛋白主要以Ⅰ型为主，分子量在80kDa-130kDa之间，过滤并再重复两次操作，有利于提高胶原的纯度，抽提的次数不应太少，否则纯度不够，抽提次数太多则易发生胶原变性，所以所用抽提次数为3-4次。
（2）卟啉纳米管具有较大的比表面积，可增强电信号，提高催化能力。卟啉纳米管与g-C3N4-MoS2异质结的优异性质，二者的复合将有助于降低氧化或还原过电位，提高材料对光的灵敏性，材料巨大的比表面积可增加电子的迁移率，有助于将光信号转化为电信号。
（3）作为一种非金属半导体光活性材料，g-C3N4的光电性能受到了人们的广泛关注，例如较低的禁带宽度(2.69eV)、高化学稳定及热稳定性、良好的生物相溶性、环境友好及原料充足等。尽管g-C3N4有上述这些优点，但是由于它具有很高的光生电子空穴对重组率，使其在光电化学中的应用受到了很大限制，必须对g-C3N4进行改性处理。MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。尽管MoS2纳米材料具有相对较低的禁带宽度，但是其本身也如同g-C3N4一样具有很多不足。将g-C3N4与MoS2纳米材料结合起来，g-C3N4-MoS2构成了2D-2D异质结，2D/2D异质结相较于OD/2D、1D/2D异质结来说，电子的扩散距离相对短，通过能带的匹配，光电转换效率高，光电流较稳定，可以有效的抑制光生电子空穴对的重组并且增强其光捕获能力。
（4）含有聚苯乙烯微球为核心的MPS100 /羧基珠粒，其高分子聚合物表面带有丰富的羧基，可以与活性氨基共价偶联。抗体是一种具有游离活性氨基的蛋白质，可以与羧基结合形成稳定的酰基铵键。免疫磁珠还可以增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
（5）本发明检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，作为光电阳极电流的电子供体。
附图说明
图1为实施例3所得MoS2的不同放大倍数的高分辨SEM图；
图2为实施例3自组装阻抗图： a为裸ITO电极；b为锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；c为抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；d为Ab1/抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；e为[email protected]2/Ab1/抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
步骤1：胶原蛋白的提取：将15g新鲜牛皮切成0.5cm的小块，清水清洁，加入10ml质量分数为5%的碳酸钠溶液作为脱脂液，继续加入40ml的35℃温水，磁力搅拌10min，过滤并再重复一次上述操作，放入20ml 3%醋酸中48h后离心2h， 速率为7000r/min，吸取上清加入30%浓盐水10ml ，盐析25min后，将沉淀溶入15ml 0.1%醋酸内，置透析袋内，用截留分子量为7000的纤维素透析袋在20ml 1mol/l的HCl中透析2天，并每隔4h换一次水，其间换水5次，加入0.05ml氯仿，敞开瓶口，用无菌纱布包住，置无菌工作台48h使氯仿挥发，得到胶原溶液，真空冷冻干燥2天，备用；
步骤2：锰卟啉纳米材料的制备：往反应瓶中通入氮气进行脱气，8min后加入100ml的N，N-二乙基甲酰胺，加热至微沸回流，然后加入80 mg的四磺酸苯基卟啉，搅拌8 min至澄清透明，再加入90mg氯化锰，100℃在氮气气氛下机械搅拌，8 h后将反应产物冷却至室温，并倾入120 ml的去离子水中，静置4 h，过滤，滤饼依次用水和乙醇各洗两次。得到的粗产物用200目的试剂级硅胶为吸附剂，三氯甲烷/甲醇（V1:V2=5:2）溶液为淋洗剂，收集第一粉色带，真空旋蒸得到锰卟啉纳米管，放入干燥器中，保存备用；
步骤3：g-C3N4-MoS2纳米复合材料的制备：将盛有4.8g白色三聚氰胺粉末的带盖坩埚放入马弗炉中，在500℃下煅烧4h待自然冷却到室温，将黄色g-C3N4产物研磨成粉末，然后将1g g-C3N4粉末放入100ml的HNO3(5M)中，在120℃下回流24h冷却后，离心，并用去离子水清洗至pH为7.0。最后将产品在30℃的真空烘箱中干燥12h，制得羧基化g-C3N4，通过在40ml超纯水中溶解钼酸钠和硫脲(1:5摩尔比)来制备MoS2，取1.0g羧基化的g-C3N4加入3 mlMoS2溶液中，并在180℃下进行24h的水热反应。最后，收集冷却的样品，用超纯水洗涤，并在N2保护下进行干燥，备用；
步骤4：免疫磁珠的制备：取1mg羧基磁珠(MB)于离心管中，用180µl去离子水洗一次，除去上清；接着用200 µl 100 mM MES洗1-2次，除去上清；加入35 µl 100 mM MES重悬，加入稀释1000倍的Ab2(羊抗兔抗1型胶原蛋白)，震荡反应30 min；加入40µl 10 mg/ml EDC溶液(现配现用)，900rpm/min反应2 h，去除上清；得到负载Ab2的免疫磁珠，用1ml PBST洗2-4次，1ml PBS洗3次，加入500 µL TT buff震荡反应30 min，去除上清，用100 µL PBS清洗3次，后用1ml BSA溶液封闭5 h左右。加入1 ml PBS(含0.01% Tween 20和0.02% NaN3)溶液震荡混匀即得到1 mg/ml的免疫磁珠混合液，4 ℃保存备用。
步骤5：ITO导电玻璃电极预组装：分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10min，氮气吹干，之后用氟化密封胶带包裹ITO电极使之有效面积固定为0.16cm2，向电极上滴加步骤2锰卟啉、步骤3 g-C3N4-MoS2与CS(0.05wt%，溶于乙酸溶液)比例1：1：3的混合溶液10ul，再将该电极放入硅胶干燥盒中室温下干燥12小时，70-80℃烘干2小时，得到g-C3N4-MoS2/ITO电极，用超纯水蘸洗3次以除去表面未结合的锰卟啉、g-C3N4 -MoS2和CS，接着将10ul的1%GA溶液滴在电极上并在室温下保持1h ，之后用去离子水洗掉过量的GA；将10ul的10ul/ml步骤1胶原蛋白CB液滴加到电极表面，使其端氨基与GA的醛基结；
步骤6：构建间接型免疫探针：用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除步骤5中未与电极表面结合的抗原后，再用10 ul 的1 % BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的胶原蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗胶原蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤4 负载Ab2的免疫磁珠，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的免疫磁珠，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，即完成了光电化学免疫传感器的组装。
如图1所示为实施例3所得MoS2的不同放大倍数的高分辨SEM图；图2为实施例3自组装阻抗图。其中：a为裸ITO电极；b为锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；c为抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；d为Ab1/抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极；e为[email protected]2/Ab1/抗原/锰卟啉/g-C3N4-MoS2/ITO电极。
实施例2
步骤1：胶原蛋白的提取：将18g新鲜牛皮切成0.7cm的小块，清水清洁，加入10ml质量分数为5-10%的碳酸钠溶液作为脱脂液，继续加入45ml的40℃温水，磁力搅拌12min，过滤并再重复一次上述操作，放入23ml 3%醋酸中48h后离心2h， 速率为7500r/min，吸取上清加入30%浓盐水13ml ，盐析28min后，将沉淀溶入17ml 0.1%醋酸内，置透析袋内，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在23ml 1mol/l的HCl中透析2天，并每隔4h换一次水，其间换水5次，加入0.07ml氯仿，敞开瓶口，用无菌纱布包住，置无菌工作台48h使氯仿挥发，得到胶原溶液，真空冷冻干燥3天，备用；
步骤2：锰卟啉纳米材料的制备：往反应瓶中通入氮气进行脱气，8-10 min后加入110ml的N，N-二乙基甲酰胺，加热至微沸回流，然后加入85mg的四磺酸苯基卟啉，搅拌9min至澄清透明，再加入95 mg氯化锰，105℃在氮气气氛下机械搅拌，8 h后将反应产物冷却至室温，并倾入125 ml的去离子水中，静置4 h，过滤，滤饼依次用水和乙醇各洗两次。得到的粗产物用200目的试剂级硅胶为吸附剂，三氯甲烷/甲醇（V1:V2=5:2）溶液为淋洗剂，收集第一粉色带，真空旋蒸得到锰卟啉纳米管，放入干燥器中，保存备用；
步骤3：g-C3N4-MoS2纳米复合材料的制备：将盛有4.9g白色三聚氰胺粉末的带盖坩埚放入马弗炉中，在525℃下煅烧4h待自然冷却到室温，将黄色g-C3N4产物研磨成粉末，然后将1g g-C3N4粉末放入100ml的HNO3(5M)中，在123℃下回流24h冷却后，离心，并用去离子水清洗至pH为7.0。最后将产品在33℃的真空烘箱中干燥12h，制得羧基化g-C3N4，通过在40-50ml超纯水中溶解钼酸钠和硫脲(1:5摩尔比)来制备MoS2，取1.0g羧基化的g-C3N4加入3 mlMoS2溶液中，并在185℃下进行24h的水热反应。最后，收集冷却的样品，用超纯水洗涤，并在N2保护下进行干燥，备用；
步骤4：免疫磁珠的制备：取1.1 mg羧基磁珠(MB)于离心管中，用190 µl去离子水洗一次，除去上清；接着用200 µl 100 mM MES洗1-2次，除去上清；加入38 µl 100 mM MES重悬，加入稀释1000倍的Ab2(羊抗兔抗1型胶原蛋白)，震荡反应30 min；加入45 µl 10 mg/ml EDC溶液(现配现用)，900rpm/min反应2 h，去除上清；得到负载Ab2的免疫磁珠，用1mlPBST洗2-4次，1ml PBS洗3次，加入500 µL TT buff震荡反应30 min，去除上清，用100 µLPBS清洗3次，后用1ml BSA溶液封闭5 h左右。加入1 ml PBS(含0.01% Tween 20和0.02%NaN3)溶液震荡混匀即得到1 mg/ml的免疫磁珠混合液，4 ℃保存备用。
步骤5：ITO导电玻璃电极预组装：分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗15min，氮气吹干，之后用氟化密封胶带包裹ITO电极使之有效面积固定为0.16cm2，向电极上滴加步骤2锰卟啉、步骤3 g-C3N4-MoS2与CS(0.05wt%，溶于乙酸溶液)比例1：1：3的混合溶液12ul，再将该电极放入硅胶干燥盒中室温下干燥12小时，75℃烘干2小时，得到g-C3N4-MoS2/ITO电极，用超纯水蘸洗3次以除去表面未结合的锰卟啉、g-C3N4 -MoS2和CS，接着将12ul的1%GA溶液滴在电极上并在室温下保持1h ，之后用去离子水洗掉过量的GA；将10ul的10ul/ml步骤1胶原蛋白CB液滴加到电极表面，使其端氨基与GA的醛基结；
步骤6：构建间接型免疫探针：用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除步骤5中未与电极表面结合的抗原后，再用12ul 的1 % BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5-10ul 1ul/ml的胶原蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中60min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗胶原蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤4 负载Ab2的免疫磁珠，置于30-35℃的烘箱中60min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的免疫磁珠，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，即完成了光电化学免疫传感器的组装。
实施例3
步骤1：胶原蛋白的提取：将20g新鲜牛皮切成1cm的小块，清水清洁，加入10ml 质量分数为10%的碳酸钠溶液作为脱脂液，继续加入50ml的45℃温水，磁力搅拌15min，过滤并再重复一次上述操作，放入25ml 3%醋酸中48h后离心2h， 速率为8000r/min，吸取上清加入30%浓盐水15ml ，盐析30min后，将沉淀溶入20ml 0.1%醋酸内，置透析袋内，用截留分子量为13000的纤维素透析袋在25ml 1mol/l的HCl中透析3天，并每隔5h换一次水，其间换水5次，加入0.1ml氯仿，敞开瓶口，用无菌纱布包住，置无菌工作台48h使氯仿挥发，得到胶原溶液，真空冷冻干燥3天，备用；
步骤2：锰卟啉纳米材料的制备：往反应瓶中通入氮气进行脱气，10 min后加入120ml的N，N-二乙基甲酰胺，加热至微沸回流，然后加入90mg的四磺酸苯基卟啉，搅拌10 min至澄清透明，再加入100 mg氯化锰，110℃在氮气气氛下机械搅拌，8 h后将反应产物冷却至室温，并倾入130 ml的去离子水中，静置4 h，过滤，滤饼依次用水和乙醇各洗两次。得到的粗产物用200目的试剂级硅胶为吸附剂，三氯甲烷/甲醇（V1:V2=5:2）溶液为淋洗剂，收集第一粉色带，真空旋蒸得到锰卟啉纳米管，放入干燥器中，保存备用；
步骤3：g-C3N4-MoS2纳米复合材料的制备：将盛有5.0g白色三聚氰胺粉末的带盖坩埚放入马弗炉中，在550℃下煅烧4h待自然冷却到室温，将黄色g-C3N4产物研磨成粉末，然后将1g g-C3N4粉末放入100ml的HNO3(5M)中，在125℃下回流24h冷却后，离心，并用去离子水清洗至pH为7.0。最后将产品在35℃的真空烘箱中干燥12h，制得羧基化g-C3N4，通过在50ml超纯水中溶解钼酸钠和硫脲(1:5摩尔比)来制备MoS2，取1.0g羧基化的g-C3N4加入3 mlMoS2溶液中，并在190℃下进行24h的水热反应。最后，收集冷却的样品，用超纯水洗涤，并在N2保护下进行干燥，备用；
步骤4：免疫磁珠的制备：取1.2 mg羧基磁珠(MB)于离心管中，用200 µl去离子水洗一次，除去上清；接着用200 µl 100 mM MES洗2次，除去上清；加入40 µl 100 mM MES重悬，加入稀释1000倍的Ab2(羊抗兔抗1型胶原蛋白)，震荡反应30 min；加入50 µl 10 mg/mlEDC溶液(现配现用)，900rpm/min反应2 h，去除上清；得到负载Ab2的免疫磁珠，用1ml PBST洗2-4次，1ml PBS洗3次，加入500 µL TT buff震荡反应30 min，去除上清，用100 µL PBS清洗3次，后用1ml BSA溶液封闭5 h左右。加入1 ml PBS(含0.01% Tween 20和0.02% NaN3)溶液震荡混匀即得到1 mg/ml的免疫磁珠混合液，4 ℃保存备用。
步骤5：ITO导电玻璃电极预组装：分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗20min，氮气吹干，之后用氟化密封胶带包裹ITO电极使之有效面积固定为0.16cm2，向电极上滴加步骤2锰卟啉、步骤3 g-C3N4-MoS2与CS(0.05wt%，溶于乙酸溶液)比例1：1：3的混合溶液15ul，再将该电极放入硅胶干燥盒中室温下干燥12小时，80℃烘干2小时，得到g-C3N4-MoS2/ITO电极，用超纯水蘸洗3次以除去表面未结合的锰卟啉、g-C3N4 -MoS2和CS，接着将15ul的1%GA溶液滴在电极上并在室温下保持1h，之后用去离子水洗掉过量的GA；将10ul的10ul/ml步骤1胶原蛋白CB液滴加到电极表面，使其端氨基与GA的醛基结；
步骤6：构建间接型免疫探针：用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除步骤5中未与电极表面结合的抗原后，再用15 ul 的1 % BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加10ul 1ul/ml的胶原蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中70min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗胶原蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤4 负载Ab2的免疫磁珠，置于30-35℃的烘箱中70min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的免疫磁珠，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，即完成了光电化学免疫传感器的组装。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
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