阅读说明：本技术 用于检测毛油中磷脂的三维双酶光电化学生物传感器的制备及检测方法 (Preparation and detection method of three-dimensional double-enzyme photoelectrochemical biosensor for detecting phospholipids in crude oil ) 是由 王立琦 宋旸 罗淑年 姚静 王睿莹 隋玉林 于殿宇 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及光电化学生物传感器领域,公开了一种用于毛油中磷脂检测的三维双酶光电化学生物传感器的制备及检测方法。首先采用水热法合成三维SnO-2纳米花,利用用电聚合法制备了聚硫堇修饰SnO-2纳米花光敏电极,采用交联法将胆碱氧化酶修饰在聚硫堇修饰光敏电极表面,然后再利用戊二醛交联磷脂酶D构建了双酶修饰光敏电极,该修饰光敏电极具有较好的选择性和较高的灵敏度。以获得的修饰光敏电极为工作电极,银/氯化银电极为参比电极,铂电极为对电极,构成三电极体系,可见光作为激发光源,可用碘钨灯作为光源。利用光电流制备在一定浓度范围内检测毛油中磷脂的光电生物传感器,将光电化学生物传感器用于毛油中磷脂的检测。(The invention relates to the field of photoelectrochemical biosensors, and discloses a preparation method and a detection method of a three-dimensional double-enzyme photoelectrochemical biosensor for detecting phospholipids in crude oil. Firstly, synthesizing three-dimensional SnO by adopting a hydrothermal method 2 Nanometer flower, prepared into polysulfide cordierite modified SnO by using electric polymerization method 2 The nano-flower photosensitive electrode is characterized in that choline oxidase is modified on the surface of a polyitaconide modified photosensitive electrode by adopting a cross-linking method, and then a double-enzyme modified photosensitive electrode is constructed by utilizing glutaraldehyde cross-linked phospholipase D, and the modified photosensitive electrode has good selectivityHigh sensitivity. The obtained modified photosensitive electrode is used as a working electrode, a silver/silver chloride electrode is used as a reference electrode, a platinum electrode is used as a counter electrode to form a three-electrode system, visible light is used as an excitation light source, and an iodine tungsten lamp can be used as a light source. A photoelectric biosensor for detecting phospholipids in the crude oil within a certain concentration range is prepared by utilizing photocurrent, and the photoelectric chemical biosensor is used for detecting the phospholipids in the crude oil.)

用于检测毛油中磷脂的三维双酶光电化学生物传感器的制备 及检测方法

技术领域

本发明涉及一种三维双酶光电化学生物传感器的制备方法，尤其涉及一种用于毛油中磷脂的检测方法。

背景技术

我国是世界上最大的食用植物油生产国和消费国，油脂的质量安全关系到民众的身体健康。随着“中国好粮油行动计划”战略的实施，人们对植物油脂的品质要求越来越高。

在油脂精炼脱胶过程中，不仅化学精炼涉及毛油中残磷量的检控，生物酶法精炼过程中毛油残磷量的评判，更是决定生物酶解反应进程的主要参数，可有效阻止油脂的过度酶解。油脂残磷量影响油脂的品质和加工成本，现有检测方法，普遍存在分析速度慢滞后于生产过程。因此，需快速检测及监控毛油中的残磷量，实现油脂的精准适度加工。

近年来，电化学分析在植物油品质检测方面的研究逐渐受到关注，具有较好的发展空间，但还存在灵敏度低、选择性差等问题制约了在实际中应用。光电化学生物传感器是一种结合了光电化学分析及生物传感而发展起来的新型检测技术，比传统的电化学方法具有更低背景噪声，更高的灵敏度、更低的检测限，酶修饰电极能进一步增强反应分子间特殊的生物亲和性，简化了检测过程，三维双酶光电化学生物传感器的构建可以突破光电转化效率低的瓶颈问题，使实际应用成为可能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测毛油中磷脂的三维双酶光电化学生物传感器以及检测方法。所述光电化学生物传感器能够方便快捷地对毛油中磷脂进行测定，该光电化学生物传感器PC含量在4~28mg/L范围内与光电流呈线性关系。方法检出限为2 mg/L(S/N=3)。结果灵敏度高、检测限低、选择性好，具有较高的应用价值。制得的三维双酶光电化学生物传感器的SEM图如说明书附图1和2所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测毛油中磷脂的三维双酶光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）三维SnO₂纳米阵列的制备

氧化铟锡（ITO）导电玻璃进行超声清洗，干燥。采用水热法合成三维SnO₂纳米阵列。反应结束后，将高压釜自然冷却至室温。然后沉积的衬底用去离子水反复漂洗，然后在空气中烘干。图1为二氧化锡纳米材料表征图。

（2）聚硫堇光敏电极的制备

将处理后的ITO电极放入硫堇电解池中电沉积，在1.2V电位下沉积2400s后，用水清洗掉表面吸附的Th单体后，再用pH5.5的PBS清洗。所得电极即为制备好聚硫堇（PTh）光电极。

（3）光电化学生物传感器的制备

壳聚糖溶于1%醋酸溶液屮，室温下搅拌一个小时直至完全溶解，得透明的壳聚糖胶体。胆碱氧化酶（CHOx）溶于pH8.0的Tris-Hcl中，搅匀溶解，直到变为透明清澈溶液，储存于4℃的冰箱屮。5%的戊二醛稀释至0.25%，储存备用。用微量注射器移取壳聚糖溶液滴涂在聚硫堇光敏电极表面，并于室温下自然晾干成膜，PBS清洗，晾干。取戊二醛滴于电极表面反应30min，PBS清洗后，再滴加胆碱氧化酶溶液，室温反应1 h。将5~10 μL磷脂酶D（PLD）滴于光敏电极上。当电极表面变薄时，将戊二醛滴在电极表面交联，用PBS缓冲液清洗电极表面，除去电极表面的游离磷脂酶D。获得的生物酶光敏电极在用N₂吹干后保存在4℃的冰箱中。

附图说明

图1为三维二氧化锡纳米材料表征图；

图2为胆碱氧化酶表征图。

具体实施方式

：

具体实施方式一：

本发明的三维SnO₂纳米阵列，通过以下方法制备得到：将ITO导电玻璃切成5.0×1.0cm的长条，依次用乙醇，丙酮，水分别超声清洗5min，干燥。然后在一端留出1.0cm的一段作为电极端子，在另一段用绝缘漆封住并在表面留出直径为6.0mm的空白作为ITO电极。采用水热法合成三维SnO₂纳米阵列。图1为二氧化锡纳米材料表征图；前驱液(30~40ml)由0.03mol L^-1SnCl₄·5H₂O和0.3mol L^-1NaOH组成，加入5~10ml(0.12molˑ L^-1)NaCl和0.6~0.8g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。先将前驱体溶液搅拌1h，然后在密封的聚四氟乙烯衬里高压釜中将氧化铟锡(ITO)玻璃衬底浸泡在前驱体溶液中，在200℃下进行12h的水热生长。反应结束后，将高压釜自然冷却至室温。然后沉积的衬底用去离子水反复漂洗，然后在空气中烘干。

具体实施方式二：

聚硫堇光电极的制备：称取3.9mg的硫堇溶于3mL的pH为1.9的醋酸溶液（4.4molˑL^-1）中，配制得到的硫堇浓度为4mmolˑL^-1。将具体实施方式一中处理后的ITO电极放入含有4mmolˑL^-1的硫堇电解池中电沉积，在1.2V电位下沉积2400s后，用水清洗掉表面吸附的Th单体后，再用pH5.5的PBS清洗。所得电极即为制备好聚硫堇光敏电极。

具体实施方式三：

光电化学生物传感器的制备：准确称取10.0mg壳聚糖溶于1%醋酸溶液屮，室温下搅拌一个小时直至完全溶解，得透明的壳聚糖胶体，浓度为10.0mgˑmL^-1。5%的戊二醛稀释至0.25%，储存备用。用微量注射器移取5~10 μL壳聚糖溶液滴涂在聚硫堇光敏电极表面，并于室温下自然晾干成膜，PBS清洗，晾干。取5 μL、0.25%戊二醛滴于电极表面反应30min，PBS清洗后，再滴加5~10 μL浓度为0~1.7gˑL^-1胆碱氧化酶，室温反应1h，。磷脂酶D(0~6gˑL^-1)滴于光敏电极上。当电极表面变薄时，将5~10 μL戊二醛滴在电极表面，37°C交联30min，用PBS缓冲液清洗电极表面，除去电极表面的游离磷脂酶D。获得的生物酶光敏电极在用N₂吹干后保存在4℃的冰箱中。图2为胆碱氧化酶表征图。

具体实施方式四：

本实施方式与具体实施方式三的不同点在于胆碱氧化酶的添加量为0~1.7 gˑL^-1，在此条件制备光电化学生物传感器其它步骤与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：

本实施方式与具体实施方式三的不同点在于磷脂酶D的添加量为0~6 gˑL^-1，在此条件制备光电化学生物传感器其它步骤与具体实施方式三相同。

具体实施方式六：

PC含量的光电化学检测：采用自制的光电化学系统进行光电检测。所有光电化学实验均在chi660b电化学工作站进行。PEC检测采用经典的三电极系统。以三维双酶光敏电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。所有电化学测试均在室温光电化学反应池中进行。以20~40 10mmol/L的pH5.5~7.5磷酸缓冲液作为电解液，50W碘钨灯作为照射源，光照强度在6 mWˑcm^-2 ~15 mWˑcm^-2，在光电界面施加0.10V~0.50V偏置电压。向电解池中注入PC在5~25mg/L浓度范围可获得线性响应 (样品并同时启动电流检测，待催化反应8 min时，开启光闸，每20s切换1次，形成光电流-时间图谱。

具体实施方式七：

本实施方式与具体实施方式六的不同点在于施加的偏置电压范围0.10V~0.50V，在此条件进行光电化学检测其它步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：

本实施方式与具体实施方式六的不同点在于光照强度在6mWˑcm^-2~15 mWˑcm^-2范围内，在此条件进行光电化学检测其它步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式九：

本实施方式与具体实施方式六的不同点在于包含PC缓冲溶液的pH在5.5~7.5范围内，在此条件进行光电化学检测其它步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式十：

大豆毛油中PC含量的测定：将PC(40~60 mg)加入装有90~110mL一级大豆油的容器中，充分搅拌，制备大豆毛油。然后，样品稀释成不同浓度的PBS缓冲液。制备了一定PC含量的大豆原油样品，加入1%Triton-X100作为乳化剂，在37℃下搅拌30min，在最佳条件下，将三维双酶光敏电极加入10~30mL大豆毛油中测定其光电流，得到样品的PC含量。

生物传感器	检测范围（mM）	检测限（mM）
			ChOx-SnO2 -PTh /ITO	0.05-2.0	0.03