一种磷酸钙前驱体、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种磷酸钙前驱体、制备方法及其应用 (Calcium phosphate precursor, preparation method and application thereof ) 是由 曹颖 周庆丽 李全利 郭梦茜 王政 于 2021-02-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物材料技术领域,具体涉及一种磷酸钙前驱体、制备方法及其应用。通过将可溶性淀粉与钙试剂混合后加热糊化,得到含钙的淀粉溶液,将可溶性淀粉与磷试剂混合后加热糊化,得到含磷的淀粉溶液,在搅拌下,将含钙的淀粉溶液缓慢滴加入含磷的淀粉溶液或者将含磷的淀粉溶液缓慢滴加入含钙的淀粉溶液,将得到的混合溶液离心,得到含磷酸钙前驱体的上清液,该制备方法简单方便,经济安全,控制性好,环境友好,合成的磷酸钙前驱体尺寸小,大小均一,分布均匀,可长时间稳定存在,不掺杂其它离子。此外,通过添加α-淀粉酶水解淀粉后,前驱体可作为矿物源释放,并在矿化基质上再生釉质样结构,修复牙齿组织缺损。(The invention relates to the technical field of biological materials, in particular to a calcium phosphate precursor, a preparation method and application thereof. The preparation method is simple, convenient, economical and safe, good in controllability and environment-friendly, and the synthesized calcium phosphate precursor is small in size, uniform in size and distribution, can stably exist for a long time and is not doped with other ions. In addition, by hydrolyzing starch with the addition of alpha-amylase, the precursor can be released as a mineral source and regenerate enamel-like structures on a mineralized matrix, repairing tooth tissue defects.)
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种磷酸钙前驱体、制备方法及其应用。
背景技术
经过数十亿年，生物系统通过进化和自然选择来优化他们复杂的组织结构和层次结构。 其中，牙齿、骨骼和贝壳等因为表现出远远超出了其构成成分总和的显著的强度和韧性而引 起科学家们的关注。因此，有大量的仿生策略来复制这种复杂的等级结构，促进了再生医学和 仿生材料的发展。
为了复制独特的复杂层次结构，预成核簇(prenucleation clusters，PNCs)和无定形磷酸 钙(amorphous calcium phosphate，ACP)纳米颗粒在内的磷酸钙前驱体被体外合成，作为钙 和磷离子的储库，为生物矿化提供矿物来源。然而，这些PNCs或ACP纳米颗粒非常不稳定， 可以自发聚合，甚至在几秒钟内生长成核。因此，通常使用添加剂来稳定PNCs或ACP纳米 颗粒，其中使用聚电解质稳定PNCs的聚合物诱导的液态前驱体(PILPs)近些年来引起了众 多关注。然而，PILPs中钙离子的含量通常是有限的(一般不超过5mM)，而且PILPs中不可 去除的有机模板阻碍了PNCs向HA的转化。因此，如果没有有效的方法来去除前驱体中的有 机模板来释放PNCs，可能会显著降低矿化率。
鉴于上述问题，有机分子三乙胺被用作模板稳定磷酸钙离子簇，并在应用过程中，利用 乙醇挥发去除三乙胺，以启动磷酸钙晶体的形成。然而，尽管研究表明三乙胺最终与乙醇一 起挥发了，但三乙胺的安全性有待商榷。更重要的是，三乙胺合成的PNCs的稳定性随着乙 醇的挥发而降低。乙醇的挥发与环境有关，不能精确调节前驱体的稳定或促进其成核矿化。 因此，很难转化为临床应用。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术不能精确调节磷酸钙前驱体的温度或促进成核矿化，从 而很难应用于临床的问题，提供了一种磷酸钙前驱体、制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种磷酸钙前驱体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将可溶性淀粉与钙试剂混合后加热糊化，得到含钙的淀粉溶液；
S2：将可溶性淀粉与磷试剂混合后加热糊化，得到含磷的淀粉溶液；
S3：，将含钙的淀粉溶液在剧烈搅拌下缓慢滴加入含磷的淀粉溶液或者将含磷的淀粉溶液 缓慢滴加入含钙的淀粉溶液；
S4：将步骤S3得到的混合溶液离心，离心转速为14000rpm，得到含磷酸钙前驱体的上 清液。
所述步骤S1钙试剂中钙的浓度大于4.5mmol/L，淀粉的浓度为1wt％～7wt％。
所述步骤S2磷试剂中磷的浓度大于3mmol/L，淀粉的浓度为1wt％～7wt％。
所述步骤S3得到的混合溶液中钙磷离子浓度比为3∶2。。
所述步骤S3中得到的钙磷混合液的pH为6。
所述磷酸钙前驱体合成时以液体状态存在，通过冷冻干燥的技术保存。
本发明还公开了一种采用上述方法制备的磷酸钙前驱体，所述磷酸钙前驱体的尺寸为 0.1nm～5nm。
本发明还公开了上述磷酸钙前驱体在制备再矿化牙科用品中的应用。
鉴于可溶性淀粉中丰富的羟基竞争性地与钙离子结合的化学作用以及淀粉糊化后形成局 部的空间限制作用，可以抑制钙磷的快速结合，进而合成稳定的磷酸钙前驱体。在α-淀粉酶 水解淀粉模板后，糊化淀粉的局部空间限制作用消失，前驱体从淀粉模板中释放出来进而促 进前驱体在矿化基质上的再矿化。
与现有技术比较本发明的有益效果在于：(1)本发明制得的磷酸钙前驱体经济安全，操 作简单，控制性好，环境友好，生物相容性好；(2)制得磷酸钙前驱体尺寸小，大小一致， 分布均匀，矿化活性高；(3)以可溶性淀粉作为模板，可溶性淀粉可以由人工通过添加淀粉 酶精准去除或经由唾液中富含的淀粉酶持续降解，便于磷酸钙前驱体的应用；(4)磷酸钙前 驱体以冷冻干燥技术进行处理，可长时间稳定保存。
附图说明
图1为实施例1制得的磷酸钙前驱体的透射电镜(TEM)图；
图2为实施例1制得的磷酸钙前驱体动态光散射(DLS)结果；
图3为实施例1中酶解淀粉后的磷酸钙前驱体的TEM图；
图4为实施例1中酶解淀粉后的磷酸钙前驱体的DLS结果；
图5为实施例1中牙釉质再矿化的对照组釉质表面的扫描电镜(SEM)图：
图6为实施例1中的牙釉质再矿化实验组釉质表面的SEM图；
图7为实施例1中的牙釉质再矿化的对照组釉质剖面的SEM图；
图8为实施例1中的牙釉质再矿化实验组釉质剖面的SEM图；
图9为实施例2中应用的磷酸钙前驱体酶解后的TEM图；
图10为实施例2中应用的磷酸钙前驱体酶解后的DLS图；
图11为实施例2中的再矿化的牙本质对照组(左)和实验组(右)表面的SEM图；
图12为实施例2中的再矿化的牙本质对照组(左)和实验组(右)表面的高倍数放大SEM图；
图13为实施例2中的再矿化的牙本质对照组(左)和实验组(右)剖面的SEM图；
图14为实施例2中的再矿化牙本质实验组剖面的高倍数放大图；
图15为不同淀粉浓度对于合成的磷酸钙前驱体上清液的电感耦合等离子体发射光谱仪 (ICP-OES)图；
图16为实施例3中保存了5个月的磷酸钙前驱体的TEM图；
图17为实施例3中保存了5个月的磷酸钙前驱体体系进行酶解和离心后的DLS结果。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例1
将2.5wt％的可溶性淀粉与9mmol/L的氧化钙悬浊液混合后加热糊化，得到含钙的淀粉溶 液；将2.5wt％的可溶性淀粉与6mmol/L的磷酸溶液混合后加热糊化，得到含磷的淀粉溶液； 以500rpm的转速剧烈搅拌，将冷却至常温的含钙的淀粉溶液缓慢滴加入含磷的淀粉溶液；将 得到的混合溶液离心，得到含磷酸钙前驱体的上清液。取少量进行TEM和DLS表征，结果 如图1、图2所示。图1显示大小均一的磷酸钙前驱体在淀粉模板中合成。电感耦合等离子 体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中的钙浓度约为4mmol/L。该上清液使用α-淀粉酶酶 解淀粉后，取少量进行TEM和DLS表征，结果如图3、图4所示，酶解后的上清液直接用作牙釉质再矿化的矿物源。图3显示淀粉模板消失，仅剩下几纳米大小的磷酸钙前驱体。图4显示磷酸钙前驱体在1nm左右。
(1)制备牙釉质样本，抛光，超声清洗，酸蚀后备用。将牙釉质片一部分涂布指甲油作 对照组，另一部分作实验组。
(2)离心获取酶解后的磷酸钙前驱体。
(3)将制备好的牙釉质片浸泡在酶解后的磷酸钙前驱体中，添加1ppm的氟，每天更换 磷酸钙前驱体上清液，浸泡两周。
将矿化后的牙釉质片超声清洗，干燥后进行扫描电镜(SEM)检测，结果如图6和图8所示。图6显示了与图5对照组完全不同的矿化结果。图6显示釉质表面被再矿化的棒状晶体覆盖，晶体均匀密布。图8的釉质纵断面与图7对照组的釉质纵断面也不同。图8的纵断 面显示再矿化的晶体和天然釉质之间的界限不明显，表明在釉质表面原位再生了类釉质样晶体。
实施例2
将2.5wt％的可溶性淀粉与36mmol/L的氧化钙悬浊液混合后加热糊化，得到含钙的淀粉 溶液；将2.5wt％的可溶性淀粉与24mmol/L的磷酸溶液混合后加热糊化，得到含磷的淀粉溶 液；以500rpm的转速剧烈搅拌，将冷却至常温的含钙的淀粉溶液缓慢滴加入含磷的淀粉溶液； 将得到的混合溶液离心，得到含磷酸钙前驱体的上清液。取少量酶解后进行TEM和DLS表 征，结果如图9、图10所示。电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中的钙 浓度约为7mmol。图9和图10显示尽管提高了磷酸钙前驱体浓度(钙磷浓度)，但磷酸钙前 驱体的形貌与图3和图4没有明显区别，大小仍在1nm左右。该上清液酶解后直接用作牙本 质再矿化的矿物源。
(1)制备牙本质样本，抛光，超声清洗，酸蚀后备用，将牙本质片一部分涂布指甲油作 对照组，另一部分作实验组。
(2)离心获取酶解后的磷酸钙前驱体。
(3)将制备好的对照组和实验组的牙本质片浸泡在酶解后的磷酸钙前驱体中，添加1ppm 的氟，每天更换磷酸钙前驱体上清液，浸泡两周。
将矿化后的牙釉质片超声清洗，干燥后进行扫描电镜(SEM)检测，结果如图11，图12， 图13和图14所示。图11显示对照组(图左)的牙本质小管清晰可见，实验组即矿化组(图右)的牙本质小管上覆盖一层再生晶体。图12放大显示矿化组(图右)的牙本质小管完全被棒状晶体覆盖。图13的纵断面显示对照组(图左)的牙本质小管没有晶体再生，矿化组的牙本质小管被再生晶体填塞了十几微米。图14的纵断面放大显示再生的晶体和天然牙本质之间 无明显界限，再生晶体在牙本质小管中致密再生。
实施例3
淀粉浓度对于合成磷酸钙前驱体体系的影响：
分别以2.5wt％、5wt％和7wt％浓度的可溶性淀粉与45mmol/L的氧化钙悬浊液混合后加 热糊化，得到含钙的淀粉溶液；分别以2.5wt％、5wt％和7wt％浓度的可溶性淀粉与30mmol/L 的磷酸溶液混合后加热糊化，得到含磷的淀粉溶液；以500rpm的转速剧烈搅拌，将冷却至常 温的含钙的淀粉溶液缓慢滴加入含磷的淀粉溶液；将得到的混合溶液离心，得到含磷酸钙前 驱体的上清液。因为获取的是上清液，所以上清液中的钙磷离子含量与初始加入的理论值肯 定有差异，所以通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中的钙磷离子含 量，大体反映磷酸钙前驱体的浓度，结果如图15所示。结果显示随着淀粉浓度的增加，钙磷 浓度也相应增加。
实施例4
将2.5wt％的可溶性淀粉与18mmol/L的氧化钙悬浊液混合后加热糊化，得到含钙的淀粉 溶液；将2.5wt％的可溶性淀粉与12mmol/L的磷酸溶液混合后加热糊化，得到含磷的淀粉溶 液；以500rpm的转速剧烈搅拌，将冷却至常温的含钙的淀粉溶液缓慢滴加入含磷的淀粉溶液； 将得到的混合溶液通过冷冻干燥技术转变为固体状常温保存。5个月后将磷酸钙前驱体固体 用去离子水再溶解以及酶解后进行表征，磷酸钙前驱体TEM表征结果如图16所示，保存了 5个月的磷酸钙前驱体体系进行酶解和离心后的DLS结果如图17所示。图16显示在磷酸钙 以冷冻干燥技术保存5个月后，磷酸钙前驱体的形貌没有明显改变。图17显示磷酸钙以冷冻 干燥技术保存5个月后，磷酸钙前驱体的尺寸略有增加，但仍保持在几纳米大小，表明以冷 冻干燥技术可以长时间保存磷酸钙前驱体，且可通过再溶解进行应用。
实施例5
一种含有磷酸钙前驱体成分的能清洁口腔、预防龋齿和酸蚀症等作用的齿科用漱口水， 主要组分为磷酸钙前驱体、香精、表面活性剂、氟化物、氯化锶、酒精和水等。其中磷酸钙 前驱体的浓度为4-18mmol/L。因为唾液中富含淀粉酶，因而应用时可以酶解淀粉，释放其中 的磷酸钙前驱体促进矿化。
使用方法：每日早晚刷牙后或餐后使用，每次使用20mL，持续漱口30秒后吐出。
实施例6
一种含有磷酸钙前驱体成分可以清洁抛光牙面、使口腔清爽并具有再矿化作用的齿科用 牙膏，主要组分为磷酸钙前驱体、摩擦剂、保湿剂、表面活性剂、氟化物、增稠剂、甜味剂、 防腐剂、以及色素、香精等。其中磷酸钙前驱体的浓度为4-18mmol/L。因为唾液中富含淀粉 酶，因而应用时可以酶解淀粉，释放其中的磷酸钙前驱体促进矿化。
使用方法：每日早晚取适量牙膏，使用牙刷清洁牙齿3分钟。
实施例7
一种含有磷酸钙前驱体成分的能去除牙齿表面的食物残渣、增加唾液分泌并具有再矿化 作用的齿科用口香糖，主要组分为磷酸钙前驱体、胶体、糖浆、薄荷、甜味剂等。其中磷酸 钙前驱体的浓度为4-18mmol/L。因为唾液中富含淀粉酶，因而应用时可以酶解淀粉，释放其 中的磷酸钙前驱体促进矿化。
使用方法：饭后或需要时咀嚼口香糖5分钟后吐出。
实施例8
一种含有磷酸钙前驱体成分的能去除口腔异味、清爽口腔并具有再矿化作用的齿科用喷 雾剂，主要成分为磷酸钙前驱体、水、甘油、香精、薄荷醇、麝香草酚等。其中磷酸钙前驱 体的浓度为4-18mmol/L。因为唾液中富含淀粉酶，因而应用时可以酶解淀粉，释放其中的磷 酸钙前驱体促进矿化。
使用方法：饭后或需要时将喷雾对准口腔按压喷雾2-3次。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本 专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改， 甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
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