B7-h4+单核细胞型mdsc在制备ins激素治疗疗效预测试剂中的应用
阅读说明：本技术 B7-h4+单核细胞型mdsc在制备ins激素治疗疗效预测试剂中的应用 (B7-H4+Application of monocyte type MDSC in preparing INS hormone treatment efficacy prediction reagent ) 是由 李丽民 张明超 陈麒麟 曾科 于 2021-01-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了B7-H4～+单核细胞型MDSC在制备INS激素治疗疗效预测试剂中的应用。外周血中B7-H4～+单核细胞型MDSC作为检测靶点在制备预测激素治疗特发性肾病综合征疗效的试剂中的应用。检测外周血中B7-H4～+单核细胞型MDSC的试剂在制备预测激素治疗特发性肾病综合征疗效的试剂中的应用。B7-H4～+单核细胞型MDSC作为激素敏感型特发性肾病综合征分型标志物的应用。INS患者治疗早期出现B7-H4～+单核细胞型MDSC的升高与激素治疗敏感有关,早期观测INS患者激素治疗后B7-H4～+单核细胞型MDSC的变化可以有效预测激素疗效。(The invention discloses B7-H4 + Application of monocyte type MDSC in preparing INS hormone treatment efficacy prediction reagent. Peripheral blood B7-H4 + Application of the monocyte type MDSC as a detection target in preparing a reagent for predicting the curative effect of hormone therapy idiopathic nephrotic syndrome. Detection of B7-H4 in peripheral blood + Use of an agent for monocyte-type MDSC in the preparation of an agent for predicting the efficacy of hormone therapy for idiopathic nephrotic syndrome. B7-H4 + The application of the monocyte type MDSC as a hormone sensitive idiopathic nephrotic syndrome typing marker. Early appearance of INS patients treated with B7-H4 + The increase in monocyte-type MDSC is associated with hormone therapy sensitization, with early observation of post-hormone therapy B7-H4 in INS patients + Changes in monocyte-type MDSCs can be effective in predicting hormonal efficacy.)
技术领域
本发明属于医药生物领域，涉及B7-H4+单核细胞型MDSC在制备INS激素治疗疗效预测试剂中的应用。
背景技术
特发性肾病综合征(INS)是一类以水肿、低蛋白血症和蛋白尿为主要临床表现的肾小球疾病，根据病理表现可分为微小病变肾病(MCD)与局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)。以糖皮质激素(GCs)为主的免疫抑制性治疗是目前INS患者的一线治疗选择，足量GCs治疗8周至16周后根据尿蛋白情况判定激素治疗疗效，分为激素治疗敏感(SSNS)患者与激素抵抗患者(SRNS)。随着基因测序技术的大量运用，疾病模型的改进，临床注册研究系统的扩大与肾脏移植研究的深入，人们有能力对INS进行基于疾病发病机制的分子分型。单基因突变相关的INS患者对于免疫抑制治疗通常不敏感，很快进展为ESRD且移植后复发的概率很小。非单基因相关INS患者目前可以分为两个亚型：免疫抑制治疗敏感，很少进展为ESRD的免疫相关性INS；免疫抑制治疗疗效欠佳并逐渐发展为ESRD，并且移植后复发率高的循环致病因子相关性INS。通过病理表现与激素疗效对其进行描述性分型已经限制了INS诊疗方法的进步。尽管已有部分研究尝试通过靶向分子药物对INS进行治疗，但宽泛的疾病分型使得很多干预性研究很难表现出整体有效性，产生假阴性结果。进行基于发病机制的疾病分型将有效推进此类疾病的认识，并有可能诞生新的治疗药物。我们需要寻找不同亚型INS的特征性分子改变，并据此进行疾病分型，这将极大的推动对于INS的认识和理解。
本研究团队首次在FSGS激素敏感患者外周血中发现骨髓来源免疫抑制性细胞(MDSC)的特异性扩增，该研究提出免疫抑制性细胞可能是FSGS患者激素疗效的分子标志物。骨髓来源的免疫抑制性细胞在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、肥胖和妊娠中发挥重要的免疫调节作用，目前认为此类细胞由单核样细胞与多形核样细胞组成。两类细胞在分化来源与功能途径等方面存在较大差异，同时单核样细胞免疫抑制能力显著强于多形核样细胞。这提示具有显著抑炎功能的单核样细胞可能在INS患者中发挥更为重要的作用。
B7-H4也被称为B7x，B7S1或VTCN1，是在2003年由三个独立实验室通过生物信息学方法近乎同时共同发现，其作为B7蛋白超家族成员发挥与CTLA-4和PD-1类似的抑制性调控作用。编码人B7-H4的DNA位于1号染色体1p12/13.1，拥有6个外显子和5个内含子，共计66kb，第6个外显子为可变剪接，能够产生两种不同转录体。B7-H4蛋白由282个氨基酸组成，分为胞外段，疏水性跨膜段以及极短的胞内段(只由两个氨基酸组成)。胞外段与其他B7家族类似，具有抗体样的结构。B7-H4蛋白在其N端拥有具有信号肽的I型跨膜蛋白的全部完整结构，胞外区为IgV和IgC样结构域，具有4个保守的半胱氨酸残基，7个N样糖基化位点。B7-H4蛋白与其他B7家族成员相比，同源蛋白只占25％，这说明B7-H4与其他B7家族成员存在较大差异，其生物学功能可能存在较大不同。啮齿类动物与人的B7-H4同源序列接近87％，提示B7-H4在进化上高度保守。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供B7-H4+单核细胞型MDSC在制备INS激素治疗疗效预测试剂中的应用。
发明人前期研究研究发现激素能诱导单核细胞型MDSC表达B7-H4。B7-H4-/-小鼠在炎性刺激下肾损伤加重，给予B7-H4-Ig能改善模型小鼠的肾损伤表现，表明具有免疫抑制功能的B7-H4在肾损伤中发挥保护作用，提示B7-H4+单核细胞对于预测激素治疗INS疗效具有潜在的临床价值。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
外周血中B7-H4+单核细胞型MDSC作为检测靶点在制备预测激素治疗特发性肾病综合征疗效的试剂中的应用。
检测外周血中B7-H4+单核细胞型MDSC的试剂在制备预测激素治疗特发性肾病综合征疗效的试剂中的应用。
B7-H4+单核细胞型MDSC作为激素敏感型特发性肾病综合征分型标志物的应用。
检测外周血中B7-H4+单核细胞型MDSC的试剂在制备激素敏感型特发性肾病综合征分型试剂中的应用。
B7-H4+单核细胞型MDSC作为检测靶点在制备治疗特发性肾病综合征药物中的应用。
本发明所述的B7-H4+单核细胞型MDSC还可表述为CD11b+CD14+CD16+B7-H4+单核细胞、B7-H4+CD14+CD16+细胞。
有益效果：
本发明利用按照标准纳入INS患者进行前瞻性临床观察，观察患者激素治疗后第1、3、7、14天的外周血中B7-H4+单核细胞型MDSC(B7-H4+CD14+CD16+)的变化情况，最后根据激素治疗后第8周的蛋白尿情况判定患者激素治疗的疗效。激素治疗完全缓解的INS患者外周血中B7-H4+单核细胞型MDSC(B7-H4+CD14+CD16+)在治疗一周内出现显著扩增，激素治疗部分缓解患者该群细胞未出现显著变化。INS患者治疗早期出现B7-H4+单核细胞型MDSC的升高与激素治疗敏感有关，早期观测INS患者激素治疗后B7-H4+单核细胞型MDSC的变化可以有效预测激素疗效。B7-H4+单核细胞型MDSC可以作为激素敏感型INS患者的候选疾病分型标志物。
附图说明
图1糖皮质激素治疗特发性肾病综合征靶向细胞群临床患者研究流程示意图
图2糖皮质激素治疗前后FSGS患者外周血CD14+CD16+和CD15+细胞中B7-H4的表达分析。A表示流式分析示意图；B为B7-H4在各组中表达比例的统计分析。数据代表三次独立性重复实验。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图3地塞米松诱导的外周血B7-H4+CD14+CD16+与B7-H4-CD14+CD16+细胞的T细胞增殖抑制作用；B图表示T细胞抑制能力的统计分析。数据代表三次独立性重复实验。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图4完全缓解INS患者治疗早期B7-H4+单核细胞型MDSC显著扩增
具体实施方式
实施例1
1.实验方法
1.1.患者
选取2018年7月至2019年11月在南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)肾内科经肾活检病理诊断为INS的患者，并按照以下入组与排除标准进行筛选。最终入组患者均接受足量泼尼松治疗，并签署知情同意书。在随访基线(治疗前1周内)，激素治疗后第1天、第3天、第7天、14天和28天分别抽取患者2ml的外周血，用于分析B7-H4+免疫抑制性单核细胞的动态变化情况以及相应时间点的各项临床指标。泼尼松诱导治疗8周后记录患者各项临床指标，判断治疗疗效(如图1)。该研究方案已获得南京大学医学院附属金陵医院伦理委员会批准。
1.1.1.入组标准
1)年龄<65岁；
2)临床表现符合肾病综合征；
3)PAS染色下肾小球数目>7；
4)血清肌酐<3mg/d(265.2umol/L)；
5)肾小球滤过率(eGFR,CKD-EPI公式)≥30ml/min.1.73m2；
6)入组前1个月未使用过糖皮质激素、环孢霉素A、他克莫司、霉酚酸酯、环磷酰胺、来氟米特及CD20单抗等免疫抑制剂。
1.1.2.排除标准
1)已知有明确糖皮质激素治疗绝对禁忌症(对肾上腺皮质激素类药物过敏)；
2)活动性病毒性肝炎，肝炎病毒定量超过正常值，或谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶升高超过正常值上限2倍患者；
3)存在活动性感染、肿瘤、代谢紊乱等肾脏病并发症的患者；
4)2型糖尿病或肥胖患者(起病前BMI超过28kg/m2)；
5)妊娠患者；
6)明确诊断为遗传性肾脏病或存在明确基因突变，继发于金属中毒、药物损伤或其他系统性疾病导致肾病综合征的患者；
7)随访依从性差。
1.2.临床用药方案
研究用药为醋酸泼尼松(强的松)，5mg/片，每天1mg/kg，最大剂量60mg/天，分三次餐后服用，诱导时间为8周，或等剂量甲泼尼龙片。其他用药包括允许使用肾素血管紧张素醛固酮系统抑制剂(RAAS抑制剂)、利尿剂或抗凝剂等。
禁用环孢素A、他克莫司、霉酚酸酯、环磷酰胺及雷公藤多苷片等免疫抑制剂。
1.3.临床观察指标
收集患者的年龄、性别和肾活检基线及随访期间的24小时尿蛋白定量(Upro)、尿红细胞计数(U-RBC)、肾小管功能指标(NAG酶、RB蛋白、C3、α2巨球蛋白)、血白细胞计数(WBC)、血中性粒细胞比例(PMN)、血单核细胞比例(MNC)、血清肌酐(SCr)、血清光抑素C、血清白蛋白(ALB)、谷丙/谷草转氨酶、血清胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、外周血CD3+，CD4+，CD8+T细胞和外周血B7-H4+单核细胞(B7-H4+CD14+CD16+细胞)。
1.4.肾脏病理检查及观察指标
患者取俯卧位，采用B超引导下经皮斜角进针负压吸引法进行肾活检穿刺术。常规送光镜、免疫荧光及电镜检查。光镜包括HE、PAS、PASM-Masson及Masson三色染色。肾组织免疫荧光染色包括直接法染IgG、IgA、IgM、C3、C1q，间接法染κ、λ轻链。电镜组织经前、后固定，染色后置于Hitachi 7500透射电子显微镜下观察。由2名肾脏病理医生对以下指标进行评估，病理评分在PAS切片上进行：肾小球数目、肾小球球性硬化比例、节段肾小球硬化比例、肾小管间质急性损伤(无；轻度：≤25％；中度：26～50％；重度：>50％)、肾小管萎缩间质纤维化(无；轻度：≤25％；中度：26～50％；重度：>50％)、动脉透明变性、动脉硬化，并在电镜下观察足细胞足突融合程度。
1.5.流式细胞仪分析B7-H4+单核细胞
泼尼松治疗前(基线水平)，治疗后第1天，3天，7天，14天和28天，用EDTA抗凝管收集患者的外周血，并立即由专人将血样置于冰上(4℃)转运到实验室进行处理。确保转运时间少于2小时。根据外周血白细胞数量调整外周血量，在含有1×106白细胞的外周血中加入流式抗体，室温下孵育20分钟。流式抗体孵育完成后，向人外周血中加入红细胞裂解液。室温避光静置10分钟后，进行两次洗涤，最后通过流式细胞仪分析样本。按照相同方法孵育单个流式抗体阳性样本和阴性对照样本进行流式细胞分析。B7-H4+单核细胞比例按照以下方程式计算：B7-H4+CD14++CD16+绝对细胞数/CD14++CD16+绝对细胞数)×100。流式细胞分析使用软件Flow-Jo ver 8.8software(Tree Star,Inc Ashland,OR)进行分析。
1.6.疗效评估
根据2012年KDIGO指南建议进行疗效定义12，完全缓解(CR)：尿蛋白定量≤0.4g/天，且血清白蛋白≥35g/L，肾功能正常；部分缓解(PR)：尿蛋白定量>0.4g/天但<3.5g/天，且下降超过基线50％，肾功能稳定(SCr正常或上升<25％)；治疗无效(NR)：未达CR或PR标准。
1.7.退出指征
入组患者在随访期间若出现以下一种或多种情况，即作为退出病例：
1)各种原因导致的足量激素诱导期强的松连续停药超过1周；
2)随访8周过程中出现治疗方案更改；
3)SCr值倍增且超过正常范围(间隔2周，连续两次测定结果)；
4)严重并发症或药物副作用导致无法耐受激素诱导治疗患者；
5)患者自愿退出或因各种原因导致失随访者。
1.8.统计方法
采用SPSS 25.0软件进行数据分析。对于连续变量数据，符合正太分布计量资料的用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用独立样本的t检验。非正太分布的计量资料用中位数(四分位数间距)表示，组间比较采用曼-惠特尼U检验。计数资料用例和百分数(％)表示，组间比较采用卡方检验或精确概率法。
不同随访时间点的重复测量数据，采用重复测量方差分析。其中，组间比较采用两因素重复测量方差分析方法进行主效应和交互效应分析，判断不同干预措施随着时间的变化对观察指标的影响。通过对学生化残差的分析，经Shapiro-Wilk检验，判断各组数据是否服从正态分布，并通过学生化残差是否超过3倍的标准差判断各组数据无异常值。经Mauchly's球形假设检验判断数据是否符合球形假设，对于交互项，因变量的方差协方差矩阵相等(P>0.05)。然后，针对分组和时间因素依次进行单独效应分析，其中，分组因素单独效应分析需固定时间因素，对每个时间点分别进行独立样本t检验或t’检验(方差不齐时)；时间因素单独效应分析需固定分组因素，采用单因素重复测量方差分析对不同时间点进行比较。所有检验均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。
2.实验结果
2.1.激素对于B7-H4单核细胞的影响
之前的研究已经证明B7-H4+M-MDSC具有显著的免疫抑制功能，同时激素可以显著扩增ADR小鼠B7-H4+M-MDSC，所以我们希望进一步在患者中研究激素对于B7-H4+M-MDSC的影响。我们选取接受激素治疗前的INS患者作为对照组，观察足量激素治疗1周对B7-H4单核细胞的影响。激素治疗FSGS患者的外周血中B7-H4+CD14+CD16+比例显著高于激素治疗前的水平，而B7-H4+CD15+比例与对照组无显著区别(图2)。此外，我们通过流式细胞仪分选了B7-H4+CD14+CD16+与B7-H4-CD14+CD16+进行T细胞扩增实验。结果发现B7-H4+CD14+CD16+细胞亚群的免疫抑制能力强于B7-H4-CD14+CD16+。这一结果提示激素显著扩增FSGS患者B7-H4+CD14+CD16+细胞亚群，而B7-H4+CD14+CD16+细胞亚群发挥显著的免疫抑制功能(图3)。
2.2激素治疗1周内B7-H4+单核细胞型MDSC的扩增能够预测激素治疗8周后的疗效
如图1所示，为了观察INS患者激素治疗与B7-H4+单核细胞的变化情况，我们按照入组排除标准最终对13名INS患者进行临床前瞻性观察。根据患者在激素治疗后第8周尿蛋白水平情况(激素疗效结果)将患者分为两组，24小时尿蛋白低于0.3g/d的为完全缓解患者(CR)，24小时尿蛋白0.3-3.5g/d为部分缓解患者(PR)。在激素治疗前，激素治疗后第1天，第3天，第7天，第14天，第28天对患者外周血进行流式分析，观察B7-H4+单核细胞型MDSV的变化情况。激素治疗后第三天，CR患者B7-H4+CD14+CD16+细胞显著高于PR患者的水平(图4)，表明激素治疗1周内B7-H4+单核细胞的扩增能够预测激素8周治疗疗效。
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