具体实施方式

尽管将相对于特定实施方案来描述本技术，但是不以限制意义来解释此描述。

I.定义

在详细描述本技术的示例性实施方案之前，给出对于理解本技术重要的定义。除非另有说明或从定义的性质显而易见，否则这些定义适用于本文描述的所有方法和用途。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一个”和“一种”也包含相应的复数。在本技术的上下文中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解为仍确保所论述特征的技术效果的准确度区间。所述术语通常表示与所指示的数值的偏差为±20％，优选为±15％，更优选为±10％，甚至更优选为±5％。

应理解，术语“包括”不是限制性的。出于本技术的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括至少一定数目的实施方案，则这意指还包括优选地仅由这些实施方案组成的组。

此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似的元素，而不一定用于描述顺序或时间顺序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且除非另有明确指示，否则本文描述的技术的实施方案能够以不同于本文所描述或图示以外的其它顺序来操作。在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等涉及一种方法或用途或测定的步骤的情况下，除非在本申请的上面或下面另有指示，否则这些步骤之间没有时间或时间间隔的连贯性，即，这些步骤可同时执行，也可在这些步骤之间有几秒、几分钟、几小时、几天、几周、几个月甚至几年的时间间隔。

应理解，本技术不限于本文描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制仅限于所附权利要求限制的本技术的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

如本文所用，术语“文库”表示成员的集合，其中文库的至少两个成员在至少一个特征上彼此不同，优选在编码重组表达的蛋白质的核酸序列上彼此不同。在一个实施方案中，文库的每个成员在至少一个特征上与文库的所有其它成员不同。文库的不同成员可具有编码重组表达的蛋白质的相同核酸序列，只要所述文库的至少两个成员在编码重组表达的蛋白质的核酸序列上彼此不同即可。在特定实施方案中，文库的每个成员在编码重组蛋白的核酸序列上与文库的所有其它成员不同。在一个实施方案中，文库的每个成员重组表达亲本蛋白的变体。变体可在一个或多个氨基酸取代、插入或缺失方面与亲本蛋白不同。在一个实施方案中，文库的每个成员重组表达亲本蛋白的不同变体。在一个实施方案中，文库的至少两个成员彼此不同之处在于它们重组表达相同亲本蛋白的不同变体。举例来说，成员1可表达包括氨基酸取代S134A的亲本蛋白A的变体，并且成员2可表达包括氨基酸取代G225C的所述亲本蛋白A的变体。

文库通常包括1,000至100,000个成员、5,000至80,000个成员、10,000至60,000个成员或20,000至50,000个成员。

文库可通过诱变蛋白质的氨基酸序列来提供，所述蛋白质也称为亲本蛋白质，从而产生亲本蛋白质的不同变体。优选地，氨基酸序列是随机诱变的。蛋白质随机诱变的技术对技术人员而言是众所周知的，并且包含基因位点饱和诱变(GSSM)，其描述于Kretz等人(2004年)《酶学方法(Methods Enzymol)》.388:3-11中。诱变后，可针对所需功能筛选亲本蛋白质的变体，并且可通过本技术的方法仅进一步分析具有所需功能的那些变体。如下面进一步详细论述的，所需功能包含酶活性、底物特异性、酶稳定性和表达滴度。

在本技术内，文库的“成员”包括重组表达蛋白质的一个或多个细胞。优选地，成员的一个或多个细胞从相同的细胞克隆获得。优选地，成员仅在一个方面变化，所述方面优选与重组表达的蛋白质有关。也就是说，文库的成员优选全部是相同的细胞类型，并且仅在例如重组表达的蛋白质的序列或编码重组表达的蛋白质的核酸序列上变化。

由成员或文库包括的一个或多个细胞可为原核细胞或真核细胞。

示例性原核细胞是细菌细胞。示例性细菌细胞是大肠杆菌细胞和芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞或地衣芽孢杆菌细胞。

示例性真核细胞选自由真菌细胞、动物细胞和植物细胞组成的组。示例性真菌细胞是酵母细胞、木霉菌细胞(例如，里氏木霉)、曲霉菌细胞(例如，黑曲霉细胞)和热霉菌细胞(例如，嗜热菌)。示例性酵母细胞是驹形氏酵母细胞(例如，法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffi))(也称为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))细胞，和酵母属细胞(例如，酵母细胞)。

如本文所用，术语“蛋白质”是指肽、多肽、酶、抗体或其抗原结合片段、蛋白质抗生素、融合蛋白、疫苗或疫苗样蛋白质或颗粒、生长因子、激素或细胞因子。所有蛋白质均具有由核酸序列编码的氨基酸序列。蛋白质是通过翻译和转录过程从基因产生的，可进一步进行翻译后修饰。蛋白质可含有标签、前导肽和/或其它附加序列。“酶”是催化化学反应的蛋白质。优选地，酶是水解酶。水解酶是一类酶，通常用作利用水破坏化学键的生化催化剂。示例性酶是植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶。

“重组表达的”蛋白质是指通过重组DNA技术产生的蛋白质，例如，由用编码所需蛋白质的外源DNA构建体转化的细胞产生的蛋白质。同一文库的不同成员的重组表达蛋白可在功能上或结构上相关。同一文库的不同成员的重组表达蛋白可由同一基因的不同等位基因编码。同一文库的不同成员的重组表达蛋白可为彼此的同源物或直系同源物。同一文库的不同成员的重组表达的蛋白质可为亲本蛋白质的变体，例如，通过定向进化生成的变体。变体可在一个或多个氨基酸方面与亲本蛋白不同，并且与亲本蛋白相比可包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。

如本文所用，术语“阵列”是指特征在基板表面上的二维布置。“特征”可为文库、文库成员或单元。琼脂表面的基质是托盘。阵列通常由规则的、有序的特征组成，如直线网格或平行条纹；然而，这些特征也可为无序或随机阵列。

如本文所用，术语“排列”表示将文库的成员以定义的二维图案和/或顺序布置在微量滴定板中或琼脂托盘的表面上。阵列的每个定义的孔或斑点均与文库的特定成员相关。优选地，每个定义的孔或斑点也与其相关的特定成员的稀释值相关，未稀释的成员的稀释值为零。也就是说，可将每个孔或斑点鉴定为特定稀释度下的特定成员。排列可手动或通过自动化(例如，通过机器人)来执行。在本技术的上下文中，自动化排列是优选的。用于自动化排列的示例性机器人包含例如液体处理机，如汉密尔顿(Hamilton)的8通道Vantage液体处理机。

术语“微板”、“微量滴定板”、“微孔板”或“多孔板”在本文中可互换使用，并且是指具有多个“孔”的平板，用作小型测试容器。微量滴定板已成为分析研究和临床诊断测试实验室的标准工具。微板通常具有以2:3矩形矩阵布置的6、12、24、48、96、384、1536、3456或9600个样品孔。微板的每个孔通常容纳数十纳升至几毫升的液体。孔的横截面可为圆形或正方形，并且具有平底、圆形或尖头底部。微量滴定板由玻璃或塑料制成，可为透明或不透明的。在一个实施方案中，微量滴定板是透明玻璃板。微量滴定板与声学分配器兼容。示例性微量滴定板包含例如384Greiner 781090。

“琼脂托盘”是玻璃或塑料托盘，其大小对应于微量滴定板的大小，并且填充有用琼脂糖固化的合适的培养基。用适当量的琼脂糖固化培养基，使得当琼脂托盘倒置时，没有培养基从琼脂托盘掉落。琼脂托盘中琼脂的高度在1至15mm之间，优选在2至13mm之间，更优选在3至10mm之间，且甚至更优选在4至8mm之间。在一个实施方案中，琼脂托盘中的琼脂的高度为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm。选择琼脂托盘内琼脂的高度，使得琼脂形成基本上均匀的表面和/或在将细胞转移到琼脂托盘期间基本上不干燥的表面。琼脂的高度会影响在本技术方法的步骤(d)中形成的单个菌落的质量。用于填充固化介质的示例性托盘包含，例如，Nunc OmniTrays。

“培养基”是指包括支持培养基上或其内的细胞生长所必需的任何营养物或其它组分的培养基。培养基可为液体(本文称为“液体培养基”)、半固体或固体(例如用琼脂糖固化的液体培养基，如0.5％、0.8％、1.0％、1.3％、1.5％、1.8％或2.0％的琼脂糖)。培养基的选择将取决于文库中存在的一种或多种细胞类型，并且是本领域技术人员已知的。培养基可含有选择剂，以选择那些含有表达重组表达的蛋白质的重组核酸分子的细胞。用于巴斯德毕赤酵母的示例性培养基包含例如YPD，其含有1％的酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的葡萄糖。

“声学分配器”是指一种机器，在所述机器中，在与微量滴定板下方的微量滴定板中的一个或多个孔位置相对应的特定位置处生成局部声能。声能从下面生成的孔中转移出指定体积的液体。体积通常约为1至30纳升，例如1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL。置换后的液体被声能向上推动，在此处与琼脂托盘相遇，琼脂托盘位于微量滴定板上方，琼脂面朝向微量滴定板的开口孔。微量滴定板和琼脂托盘之间的距离可为1至20mm，例如1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。将琼脂托盘和微量滴定板的边缘对齐，使得琼脂托盘上的每个斑点均可直接与微量滴定板的孔相关，并且因此，与特定的文库成员直接相关，优选在特定的稀释度下。图1显示了图示声学分配器的基本操作的示例性设置。示例性声学分配器包含例如EDC生物系统公司的ATS Gen5或Labcyte的Echo液体处理机。

术语“菌落”是指生长在固体培养基的表面或内部的可见细胞簇。在一个实施方案中，菌落通过细胞分裂衍生自单个起始细胞。“单个菌落”是指不与相邻菌落接触或重叠的菌落。对于单个菌落，菌落起源于单个细胞而不是多个细胞的可能性要高得多。因此，对于后续分析，例如通过核酸测序，单菌落是优选的，因为单个菌落中可能仅存在一种形式的待分析分子。为了获得单个菌落，可进行稀释，直到一定体积的液体中没有足够的细胞，这些液体转移到琼脂托盘上时，由单个细胞产生的菌落之间的间距应足够远，以免接触或重叠。

“温育”是指将接种的固体或液体培养基，例如在琼脂托盘或微量滴定板中，在促进细胞生长和分裂的条件下放置一段时间。特定的一组条件，例如特定的温度、湿度、CO₂浓度等，将取决于文库中包括的一种或多种细胞类型。在一个实施方案中，温育温度为15℃至50℃，优选在20℃至45℃之间，更优选在25℃至40℃之间，且最优选在30℃至37℃之间。类似地，温育期将取决于细胞在给定的一组条件下的生长和/或分裂速率。在一个实施方案中，温育时间为12至120小时，更优选15至100小时，甚至更优选20至70小时，且最优选24至48小时。在一个实施方案中，温育温度为15℃至50℃，并且温育时间为12至120小时。在另一个实施方案中，温育温度为20℃至45℃，并且温育时间为12至120小时。在另一个实施方案中，温育温度为25℃至40℃，并且温育时间为12至120小时。在另一个实施方案中，温育温度为30℃至37℃，温育时间为12至120小时。在一个实施方案中，温育温度为15℃至50℃，并且温育时间为15至100小时。在另一个实施方案中，温育温度为20℃至45℃，并且温育时间为15至100小时。在另一个实施方案中，温育温度为25℃至40℃，并且温育时间为15至100小时。在另一个实施方案中，温育温度为30℃至37℃，并且温育时间为15至100小时。在一个实施方案中，温育温度为15℃至50℃，并且温育时间为20至70小时。在另一个实施方案中，温育温度为20℃至45℃，并且温育时间为20至70小时。在另一个实施方案中，温育温度为25℃至40℃，并且温育时间为20至70小时。在另一个实施方案中，温育温度为30℃至37℃，并且温育时间为20至70小时。在一个实施方案中，温育温度为15℃至50℃，并且温育时间为24至48小时。在另一个实施方案中，温育温度为20℃至45℃，并且温育时间为24至48小时。在另一个实施方案中，温育温度为25℃至40℃，并且温育时间为24至48小时。在另一个实施方案中，温育温度为30℃至37℃，并且温育时间为24至48小时。示例性温育时间和温度包含例如对于大肠杆菌为30℃下过夜，并且对于巴斯德毕赤酵母为30℃下48小时。

“挑选菌落”是指将菌落的一些或全部细胞，优选单个菌落，转移到新鲜的固体或液体培养基中进行繁殖，或转移到培养基和甘油的混合物中进行贮藏。这通常通过用环形物刮擦或用棍子或移液管尖蘸取来实现。在本技术的方法中，使用机器人挑选菌落，所述机器人鉴定菌落，挑选它们并将它们转移到新培养基中。可从不同的公司获得用于挑选菌落的机器人，并且包含哈德逊机器人公司(Hudson Robotics)的RapidPick^TM自动化菌落挑选系统、辛格仪器公司(Singer Instruments)的毒刺机、Scrobobotics的Pickolo^TM菌落挑选机以及美谷分子仪器公司(Molecular Devices)的Qpix 400系列微生物菌落挑选机

短语“核酸”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其中任何一种的片段、基因组、重组或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)，其可为单链或双链，并且可代表有义或反义链、肽核酸(PNA)或任何天然或合成来源的DNA样或RNA样材料，包含例如iRNA(如miRNA或siRNA)、核糖核蛋白(例如，iRNP)。所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。术语“核酸序列”是指核酸分子内核苷酸的序列，所述核苷酸分子定义了所编码蛋白质的氨基酸序列。“分离DNA”是指例如通过酶法、机械法或渗透法等方式破坏文库成员的一个或多个细胞，以释放细胞内容物，并且使用本领域可用的标准方法或试剂盒去除不溶性物质、脂质、蛋白质、RNA和其它非DNA分子。

“测序DNA”是指确定一段DNA，例如一个基因的核酸序列。标准方法和商业服务是本领域已知的。DNA测序的基本方法包含Maxam-Gilbert方法和链终止方法。还已开发了高通量技术，并且优选将其用于本技术的方法中。这些高通量技术包含但不限于大规模并行签名测序(MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、组合探针锚定合成(cPAS)、SOLiD测序、离子激流半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序和纳米孔DNA测序。

本技术的方法可包括在对DNA进行测序后的另外的步骤。举例来说，可将亲本蛋白的变体的DNA序列与所述亲本蛋白的DNA序列进行比较。

目的蛋白质可具有选自由酶活性、底物特异性、酶稳定性和表达滴度组成的组中的所需功能。酶活性可包括在升高的温度(如70℃、75℃、80℃或85℃的温度)下或在低pH(如5.5、5.0、4.5或4.0的pH)下的活性。酶活性也可包括不受反馈抑制作用抑制的酶活性。底物特异性可包括对一种特定底物的特异性，使得不会通过与其它底物反应而产生副产物。酶稳定性可包括酶在高温(例如温度为70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃)下的稳定性，或在低pH(例如5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1或4.0)下的稳定性。表达滴度意指目的蛋白质在高水平上表达。

在指定本技术的方法“依次”包括某些步骤的情况下，其它步骤当然也可包括在所列步骤之前、之间或之后的这种方法中。列出的顺序仅与彼此相关的列出的步骤有关，而与任何其它步骤无关。

II.用于鉴定目的蛋白质的方法

A.概述

本技术涉及用于筛选文库以鉴定目的蛋白质的方法中的全自动化工作流程的开发。本技术的方法的自动化工作流程包含：(i)自动化随机挑选和稀释(例如使用自动化液体处理机)；(ii)在平板大小的琼脂托盘上进行自动化铺板(例如，使用声转移系统)；以及(iii)自动化菌落挑选(例如，使用自动化菌落挑选机)。与先前的工作流相比，本技术的方法在成本、效率和用户依赖性方面提供了改进。原始的工作流程需要手动随机挑选(从多个384孔板中挑选几个孔)，在小琼脂托盘上手动铺板(每个琼脂板1个样品)和手动菌落挑选(每个琼脂板3个菌落，放入384孔板中)。本公开的自动化工作流程提供了自动化随机挑选和稀释、在平板大小的琼脂托盘上的自动化声学铺板，并且经过训练以鉴定同一文库成员的三种不同稀释液作为琼脂托盘上的一个区域，并且准确地找到和挑选三个菌落因此，本技术的方法提供了许多益处，包含：

1.降低成本。

2.减少时间。

3.减少误差：通过消除手动挑选菌落的人为可变性，消除了人工干预(例如，手动移液)的要求，并且提高了准确度。挑选菌落并将其转移到液体培养基(即平板定位)之前是由人手完成的，且高度可变。

4.准确度提高：声学分配器是一种更准确的定位方法，准许挑选单个细胞菌落，而不是含有例如多种酶的混合细胞群体，从而实现更准确的基因测序。本技术的方法还提供了对网格大小和点间距的控制。举例来说，每次随机可能有来自3种稀释液的75个20nL斑点，从而增加了单个菌落的可能性。

B.示例性实施方案

本文描述了本技术的各种示例性实施方案。在非限制性意义上引用这些示例。提供它们是为了说明本技术的更广泛的适用方面。在不脱离本技术的真实精神和范围的情况下，可对所描述的技术进行各种改变，并且可替换等效物。

在一个方面，本公开提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包含筛选表达蛋白质的细胞的文库，然后鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞。所需功能可为酶活性、底物特异性、表达滴度或其任何组合。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包含筛选表达酶的细胞的文库，然后鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；其中所需功能是酶活性、底物特异性、表达滴度或其任何组合。

另一个实施方案是用于鉴定选自脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶的酶的方法；包含筛选表达酶的细胞的文库，然后鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；其中所需功能是酶活性、底物特异性、表达滴度或其任何组合。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；以及生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库。另一个实施方案是用于鉴定目的蛋白质的方法，其中第二文库包括选自由以下组成的组的细胞：大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、里氏木霉、法夫驹形氏酵母、黑曲霉、嗜热菌和酵母菌。另一个实施方案是用于鉴定目的蛋白质的方法，其中第二文库包括选自由以下组成的组的细胞：大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、里氏木霉、法夫驹形氏酵母、黑曲霉、嗜热菌和酵母菌；其中所述细胞表达酶，并且所述酶选自由脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶组成的组。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；以及将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中。

另一个实施方案是用于鉴定目的蛋白质的方法，其中微量滴定板包括孔，并且孔的数目选自：6、12、24、48、96、384和1536。另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中微量滴定板包括孔，并且孔的数目选自：6、12、24、48、96、384和1536。另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中目的酶是脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶；并且其中微量滴定板包括孔，并且孔的数目选自：6、12、24、48、96、384和1536。

另一个实施方案是用于鉴定目的蛋白质的方法，其中液体稀释液是连续稀释液，并且连续稀释液重复5次、4次、3次和2次。另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中液体稀释液是连续稀释液，并且连续稀释液重复5次、4次、3次和2次。另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶是脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶，并且液体稀释液是连续稀释液；其中连续稀释液重复5次、4次、3次和2次。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；以及将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中，并且液体稀释液是包括甘油储备液的液体。

另一个实施方案是一种用于鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；以及将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中，并且液体稀释液是包括甘油储备液的液体。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素组成的组，并且所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；以及将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中，并且液体稀释液是包括甘油储备液的液体。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；并且然后将第二文库从微量滴定板转移到具有声学分配器的琼脂托盘上。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；并且然后将第二文库从微量滴定板转移到具有声学分配器的琼脂托盘上。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶组成的组；包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；并且然后将第二文库从微量滴定板转移到具有声学分配器的琼脂托盘上。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶组成的组；包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；并且然后将第二文库从微量滴定板转移到具有声学分配器的琼脂托盘上，其中声学分配器将第二文库中的1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL、30nL或更多从微量滴定板转移到琼脂托盘上。

本技术的公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；以及在琼脂托盘上温育并生长菌落。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；以及在琼脂托盘上温育并生长菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；以及在琼脂托盘上温育并生长菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；并且温育至少12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时，33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时，68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、101小时，102小时、103小时、104小时、105小时、106小时、107小时、108小时、109小时、110小时、111小时、112小时、113小时、114小时、115小时、116小时、117小时、118小时、119小时和120小时；以及琼脂托盘上不断增长的菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；并且在至少15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃或以上的温度下温育；以及在琼脂托盘上生长菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；并且在12小时至120小时的时间内温育；以及在琼脂托盘上生长菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；并且在15℃至50℃的温度下温育；以及在琼脂托盘上生长菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；并且在12小时至120小时的时间内温育且温育温度为15℃至50℃；以及在琼脂托盘上生长菌落。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；并且使用机器人挑选菌落。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；以及使用机器人挑选菌落。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶；并且所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；以及使用机器人挑选菌落。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；以及将菌落转移到液体培养基中。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；以及将菌落转移到液体培养基中。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶；并且所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；以及将菌落转移到液体培养基中。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达所述蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；以及在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的蛋白质的DNA。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；以及在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的酶的DNA。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶；并且所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；以及在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的酶的DNA。

本公开还提供了一种用于鉴定目的蛋白质的方法，所述方法包括：筛选表达蛋白质的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的蛋白质的细胞；生成包括表达具有所需功能的蛋白质的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的蛋白质的DNA；以及对目的蛋白质的DNA进行测序。

另一个实施方案是一种鉴定目的酶的方法，所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的蛋白质的DNA；以及对目的酶的DNA进行测序。

另一个实施方案是用于鉴定目的酶的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶或纤维素酶；并且所述方法包括：筛选表达酶的细胞的第一文库；鉴定并挑选表达具有所需功能的酶的细胞；生成包括表达具有所需功能的酶的细胞的第二文库；将第二文库排列到具有液体稀释液的微量滴定板中；用声学分配器将第二文库从微量滴定板转移到琼脂托盘上；在琼脂托盘上温育并培养菌落；使用机器人挑选菌落；将菌落转移到液体培养基中；在液体培养基中生长培养物并分离编码具有所需功能的目的蛋白质的DNA；以及对目的酶的DNA进行测序。

在另一方面，本技术提供了一种用于分析文库的方法，所述方法依次包括以下步骤：

(a)提供包括多个成员的文库，其中每个成员包括一个或多个细胞，并且其中每个成员重组表达蛋白质；

(b)将文库的成员的溶液排列在一个或多个微量滴定板中；

(c)使用声学分配器将指定体积的每种溶液从一个或多个微量滴定板转移到一个或多个琼脂托盘上；

(d)温育一个或多个琼脂托盘直至形成菌落；

(e)使用机器人为每个成员挑选一个或多个单个菌落；

(f)将每个挑选出的菌落接种到液体培养基中；

(g)温育含有挑选出的菌落的接种液体培养基，允许挑选出的菌落中存在的细胞繁殖；

(h)在液体培养基中从细胞中分离DNA；以及，

(i)对编码目的蛋白质的DNA进行测序。

在一些实施方案中，蛋白质选自由酶、肽、抗体或其抗原结合片段、蛋白质抗生素、融合蛋白、疫苗或疫苗样蛋白质或颗粒、因子、激素和细胞因子组成的组。

在一些实施方案中，所述酶选自由植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的组。

在一些实施方案中，一种或多种细胞可选自原核细胞和真核细胞组成的组。也就是说，待分析文库的每个成员包括一个或多个原核细胞或真核细胞。在一个这类实施方案中，一种或多种细胞是原核细胞，并且原核细胞是细菌细胞，即，待分析文库的每个成员均包括一个或多个细菌细胞。在另一个这类实施方案中，一个或多个细胞是真核细胞，并且真核细胞选自由真菌细胞、酵母细胞、动物细胞和植物细胞组成的组，即，待分析文库的每个成员均包括一种或多种真菌细胞、酵母细胞、动物细胞或植物细胞。

在另一个实施方案中，所述一种或多种细胞选自由大肠杆菌细胞、芽孢杆菌细胞、木霉菌细胞、驹形氏酵母细胞、曲霉菌细胞、热霉菌细胞和酵母菌细胞组成的组。

在一些实施方案中，每个成员包括一个或多个大肠杆菌细胞、芽孢杆菌细胞、木霉菌细胞、驹形氏酵母细胞、曲霉菌细胞、热霉菌细胞或酵母菌细胞，其中每个成员重组表达选自由植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的组的酶。

在一些实施方案中，每个成员包括一个或多个大肠杆菌细胞，其中每个成员重组表达选自由植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的组的酶。

在一些实施方案中，每个成员包括一个或多个法夫驹形氏酵母细胞，其中每个成员重组表达选自由植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的组的酶。

在一些实施方案中，每个成员包括一个或多个芽孢杆菌细胞，其中每个成员重组表达选自由植酸酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的组的酶。

在一些实施方案中，蛋白质具有选自由酶活性、底物特异性、酶稳定性、表达滴度及其任何组合组成的组的所需功能。

在又一个实施方案中，微量滴定板包括孔，使得文库成员溶液的排列发生在包括孔的一个或多个微量滴定板中。

本文描述的方法或实施方案中的任一个的一个或多个微量滴定板中，其中一个或多个微量滴定板中的孔的数目可为例如6、12、24、48、96、384或1536。

在一个实施方案中，在本文描述的方法和实施方案中的任一个的步骤(b)中，在排列成员之前制备溶液的一种或多种稀释液，任选地其中所述稀释液是连续稀释液。在一个实施方案中，将一种或多种稀释液与未稀释的溶液一起排列。可在液体生长培养基、缓冲液或超纯水(例如Milli-Q水)中进行稀释。这类介质、缓冲液和超纯水是本领域已知的。在一个实施方案中，制备一至十份稀释溶液，优选制备两至七份稀释溶液，且更优选制备三至五份稀释溶液。合适的稀释系数为1:10，因此第一次稀释为1:10，第二次稀释为1:100，第三次稀释为1:1,000，依此类推。稀释优选地导致在琼脂托盘上形成单个菌落，从而可分离单个成员而不会被其它成员污染。

因此，本技术提供了一种方法步骤(b)，其包括制备文库成员的溶液的稀释液并将溶液和稀释液排列在一个或多个任选地包括孔的微量滴定板中。

在一些实施方案中，稀释液是连续稀释液，使得步骤(b)包括制备文库成员溶液的连续稀释液，并且将溶液和连续稀释液排列在一个或多个任选地包括孔的微量滴定板中。

在一些实施方案中，溶液和/或溶液的稀释液包括液体，所述液体包括甘油储备液。甘油储备液可包括例如按体积计10％-60％，优选17-30％的甘油。

在一些实施方案中，在本技术的方法的步骤(c)中使用声学分配器从一个或多个微量滴定板转移到一个或多个琼脂托盘上的规定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nLnL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL。

在另一个实施方案中，在本文描述的方法和实施方案中的任一个中，其中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，蛋白质具有选自由酶活性、底物特异性、酶稳定性、表达滴度及其任何组合组成的组的所需功能。

本文描述的方法或实施方案中的任一个的一个或多个微量滴定板中的孔数，其中在步骤(c)中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，并且其中一个或多个微量滴定板包括的孔可为例如6、12、24、48、96、384或1536。

在一个实施方案中，在本文描述的方法中的任一个的步骤(b)中，其中在步骤(c)中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，在排列成员之前制备溶液的稀释液，任选地其中稀释液是连续稀释液。稀释可在液体生长培养基、缓冲液或超纯水(例如Milli-Q水)中进行。

在一个实施方案中，在本文描述的方法中的任一个中，其中在步骤(c)中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，并且其中在步骤(b)中执行稀释或连续稀释，所述一种或多种细胞可选自由原核细胞和真核细胞组成的组。也就是说，待分析文库的每个成员包括一个或多个原核细胞或真核细胞。在一个这类实施方案中，一种或多种细胞是原核细胞，并且原核细胞是细菌细胞，即，待分析文库的每个成员均包括一个或多个细菌细胞。在另一个这类实施方案中，一个或多个细胞是真核细胞，并且真核细胞选自由真菌细胞、酵母细胞、动物细胞和植物细胞组成的组，即，待分析文库的每个成员均包括一种或多种真菌细胞、酵母细胞、动物细胞或植物细胞。

在一个实施方案中，在本文描述的方法和实施方案中的任一个中，其中在步骤(c)中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，并且在步骤(b)中执行稀释或系列稀释，蛋白质具有选自由酶活性、底物特异性、酶稳定性、表达滴度及其任何组合组成的组的所需功能。

在一个实施方案中，在本文描述的方法或实施方案中的任一个中，其中在步骤(c)中转移的指定体积为1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、21nL、22nL、23nL、24nL、25nL、26nL、27nL、28nL、29nL或30nL，溶液和/或溶液的稀释液包括液体，所述液体包括甘油储备液。甘油储备液可包括例如按体积计10％-60％，优选17-30％的甘油。

在一个实施方案中，在本文描述的方法和实施方案中的任一个的步骤(c)中，一个或多个琼脂托盘优选位于一个或多个微量滴定板上方，并且一个或多个琼脂托盘被定向成使得它们的琼脂表面面对一个或多个微量滴定板。

在一个实施方案中，本文描述的方法和实施方案中的任一个的步骤(d)中的温育时间为12小时至120小时。

在一个实施方案中，本文描述的方法和实施方案中的任一个的步骤(d)中的温育温度为15℃至50℃。

尽管已在附图和前面的描述中详细图示和描述了本技术，但是这类图示和描述应被认为是说明性或示例性的而不是限制性的。本技术不限于所公开的实施方案。通过对附图、公开内容和从属权利要求的研究，本领域技术人员在实践所要求保护的技术时可理解和实现对所公开的实施方案的其它变型。详细描述本质上仅是示例性的，并不旨在限制应用和用途。

实施例

以下实施例进一步说明了本技术，然而，本技术的范围不限于此。基于本技术的描述，本领域技术人员可做出各种改变和修改，并且这类改变和修改也包含在本技术中。

实施例1：手动分离单个巴斯德毕赤酵母菌落

将含有独特淀粉酶变体的三种巴斯德毕赤酵母菌株BD51541、BD51542和BD51546从冷冻的甘油储备液中划线到YPD-Zeo¹⁰⁰琼脂平板上，并且在30℃下培养三天。来自每个板的单个菌落用于将4mL YPD-Zeo¹⁰⁰培养基接种于15mL培养管中。培养物在30℃下以250rpm振荡生长18-24小时。

实施例2：用于自动化分离单个菌落的通用方案

步骤1.在8通道汉密尔顿液体处理机上创建一个ATS源板：

-文库成员使用工作列表从源甘油储备板中排列

-在ATS兼容的384平底板中创建每个文库成员的连续稀释液。如果需要高稀释因子的中间板，则使用96深孔板。

步骤2.将为ATS运行创建一个图谱文件--定义源到目标斑点的映射，以及要转移到目标琼脂托盘上的斑点的体积。在软件中，目标板定义为3456板(72×48孔)。这种大小的网格允许使用类似于96孔板的图案，其中每个孔均是点样于其自身25个斑点(5×5)的子网格中的一个变体。斑点是20nL。以后以这种格式进行铺板，便于菌落挑选机上的自动化挑选，使用96个区域中的每一个作为挑选区。

步骤3.为确保单个菌落，并排点样出同一文库成员的3种不同稀释液。通过这种布局，OmniTray^TM的容量为32个文库成员。

步骤4.含有OmniTray^TM的源平板和目标琼脂被装载到ATS上。使用适当的图谱文件，将源平板的6列点样到一个目标托盘上。

步骤5.然后将琼脂托盘盖上盖子，放在培养箱中并使其生长。生长条件，例如温度和持续时间，取决于文库成员的性质。常见的设定是：对于大肠杆菌，在30℃下过夜；对于巴斯德毕赤酵母，在30℃下48小时。

示例性结果(大肠杆菌)可在图2中看到。在图3中可看到另一个示例性结果(巴斯德毕赤酵母)的特写。

实施例3：单个巴斯德毕赤酵母菌落的自动化分离和测序

根据实施例2的一般方案分离单个菌落，除非以下另有规定：使用与实施例1中相同的三种冷冻甘油储备液以及实施例1中获得的三种培养物的等量混合物(通过基于OD600将三种培养物中的每一种归一化，然后将每一种培养物的等量合并而生成)，在8通道汉密尔顿液体处理机上创建一个ATS源板，其通过使用工作列表将它们排列到ATS(EDS生物系统公司)兼容的384平底板(384 Greiner 781090)中。在同一微板中，液体处理机对连续稀释液的稀释度最高为100,000倍(六种总稀释度)。根据实施例2创建了一个图谱文件，但是为了确保单个菌落，使用ATS将四种巴斯德毕赤酵母的所有6种不同稀释度(未稀释、10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍)转移到含有Omni-Tray^TM目标琼脂托盘的YPD-Zeo¹⁰⁰上。将琼脂托盘盖上盖子，置于培养箱中，并在30℃下生长48小时(参见图4；第二平板未绘出，由于在较高稀释度下没有菌落生长)。

实施例4：来自单个菌落的目的基因的测序

使用实施例1中获得的每种独立培养物或实施例2中使用的三种培养物的每种的相等混合物作为模板，执行扩增全长淀粉酶基因的培养物PCR。对来自实施例3中获得的每个稀释组的多个菌落执行扩增全长淀粉酶基因的菌落PCR。通过GENEWIZ(新泽西州(NewJersey))对来自这些PCR反应的淀粉酶基因产物进行测序，并且使用软件进行分析。

来自实施例1中获得的源自单个菌落的培养物的所有三个序列显示了所述基因的干净的高质量测序数据(参见图5)。如所期望的，来自混合群体培养物的序列在整个基因中显示出高质量的序列，但三个氨基酸残基除外；128、256和433(参见图5)。这些残基是三个毕赤酵母菌株中的基因彼此不同的位点。

在实施例3中获得的来自1倍、10倍和100倍稀释阵列的单个菌落的PCR显示了至少一些混合序列。来自1,000倍或更高稀释度阵列的所有菌落均产生非混合序列，指示每个菌落均为同质克隆群体。在从1,000倍稀释液中测序的40个分离菌落中，三种不同菌株中的每一种均有代表(参见图6)。

实施例5：鉴定表达具有所需活性的蛋白质的细胞

如实施例2和3所述，制备并铺板具有不同水平的活性酶表达的细胞文库。将这些菌株在含有底物的琼脂平板上温育，所表达的酶可作用于所述底物上并引起琼脂培养基外观的视觉改变。表达淀粉酶的芽孢杆菌菌株在37℃温育16小时后，在用0.1％红淀粉制备的琼脂平板上显示出澄清区。图7显示了两个具有不同百分比的活性变体的文库。在最低的稀释率下，存在混合群体，并且整个斑点表现出活性，而在最高的稀释率下，获得单个菌落，并且可鉴定出酶活性的差异。

等效物

尽管已图示和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员在阅读上述说明书之后，可对本技术的化合物或其盐、药物组合物、衍生物、前药、代谢物、互变异构体或外消旋混合物进行如本文所述的改变、等效物的取代和其它类型的改变。上面描述的每个方面和实施方案还可已包含或并入了关于任何其它方面或所有其它方面和实施方案所公开的这类变型或方面。

本技术也不受本文描述的特定方面的限制，这些特定方面旨在作为本技术的各个方面的单个图示。在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可对本技术进行许多修改和变型，这对于本领域技术人员而言将是显而易见的。根据前述描述，除了本文列举的方法之外的处于本技术范围内的功能上等效方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这类修改和变型旨在落入所附权利要求的范围内。应理解，本技术不限于当然可能发生变化的特定方法、试剂、化合物、组合物、标记化合物或生物系统。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。因此，本说明书旨在仅在本技术的广度、范围和精神仅由所附权利要求、其中的定义及其任何等效物指示的情况下被认为是示例性的。

本文说明性描述的实施方案可在缺乏任何一个或多个元素、限制或本文未具体公开的限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地阅读而不受限制。另外，本文所采用的求语和表述已被用作说明书的求语且不被限制，并且这类术语和表述的使用并不旨在排除所显示及所描述的特征的任何等效物或其部分，但应认识到的是，在所要求保护的技术的范围内可进行各种修改。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围均可容易地被鉴定为充分描述并使得相同的范围被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性示例，本文论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“最高”、“至少”、“大于”、“小于”等所有用语包含所引用的数字并且指代可随后分解成如上所论述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包含每个单独的成员。

本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其它文件(例如，期刊、文章和/或教科书)均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其它文件被具体且单独地指示为通过引用整体并入。如果通过引用并入的文本中含有的定义与本公开中的定义相矛盾，则所述含有的定义被排除在外。