(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法
阅读说明：本技术 (E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法 ((E) Green preparation method of (E) -alpha-cyano-beta-aryl acrylamide compound ) 是由 贾娴 游松 左伟国 邢亚洁 杨顺彬 肖茜雯 范多纳 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于化学合成技术领域,涉及(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法,具体涉及基于金属卟啉-酶连续催化法的(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法。本发明所述的方法以芳香醛和丙二腈为底物,以卟啉或金属卟啉为催化剂,在无溶剂条件下发生Knoevenagel反应,生成的芳基亚甲基丙二腈类化合物用于腈水合酶催化下的水合反应,可选择性地生成(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物。本发明利用腈水合酶对芳基亚甲基丙二腈类化合物进行生物转化,可以合成高顺反选择性的(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物,其转化率>99％,顺反选择性>99％。(The invention belongs to the technical field of chemical synthesis, and relates to a green preparation method of (E) -alpha-cyano-beta-aryl acrylamide compounds, in particular to a green preparation method of (E) -alpha-cyano-beta-aryl acrylamide compounds based on a metalloporphyrin-enzyme continuous catalysis method. According to the method, aromatic aldehyde and malononitrile are used as substrates, porphyrin or metalloporphyrin is used as a catalyst, Knoevenagel reaction is carried out under the solvent-free condition, the generated aryl methylene malononitrile compound is used for hydration reaction under the catalysis of nitrile hydratase, and the (E) -alpha-cyano-beta-aryl acrylamide compound can be selectively generated. The invention relates to aryl methylene malononitrile by using nitrile hydrataseThe compound is subjected to biotransformation to synthesize the (E) -alpha-cyano-beta-aryl acrylamide compound with high cis-trans selectivity, and the transformation rate of the compound>99% cis-trans selectivity>99％。)
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，涉及(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法，具体涉及基于金属卟啉-酶连续催化法的(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法。
背景技术
酰胺类化合物不仅在生物科学中可以构建蛋白质、多肽、酶等，而且在有机、医药和材料科学中也有广泛的应用。其中丙烯酰胺类化合物平均每年生产20万吨(AngewandteChemie-International Edition 2004,43:1576-1580；Organometallics 2003,22:1203-1211)，具有重要的工业应用价值。而α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物及其衍生物在生命科学中也发挥了重要作用，如抑制登革热、西尼罗病毒丝氨酸蛋白酶(NS2B-NS3)(Bioorganic&Medicinal Chemistry 2011,19:7318-7337)，也具有抑制RSK2、MSK1激酶的可逆性半胱氨酸受体等潜在生物活性(Nature Chemical Biology 2014,10:1066-1072；Journal of the American Chemical Society 2014,136:12624-12630；Nature ChemicalBiology 2012,8:471-476)。因此，开发简单高效、经济实用的合成α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的新策略是非常有价值的。
目前关于α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的合成策略大约分为以下几种：
(1)芳香醛与氰基乙酰胺在强酸或强碱条件下发生Knoevenagel缩合，直接生成α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物(Tetrahedron.1987,43:537-542；CatalysisCommunications 2008,9:403-405)。
(2)苄胺、二苄胺或三苄胺与氰基乙酰胺在高价碘的介导下氧化生成α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物(European Journal of Organic Chemistry 2019,36:62326239)。
(3)芳香醛与丙二腈发生Knoevenagel缩合生成芳基亚甲基丙二腈类化合物，再通过氰基的单水合反应生成α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物(ChemCatChem 2016,8:1-11；ChemistrySelect 2018,3:3534-3538)。
(4)芳香醛与丙烯腈发生Baylis-Hillman反应，所得产物在离子液体的作用下转化为α-氰基-β-芳基丙烯醛类化合物，然后在羟胺甲醇溶液中转化为α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物(New Journal of Chemistry 2017,41:9203-9209)。
上述合成策略仍存在以下问题：反应条件苛刻、反应时间长；芳基亚甲基丙二腈类化合物的两个氰基都有可能成为水合反应的反应官能团；在有些条件下酰胺的水解速度快于氰基转变为酰胺的速度，生成的酰胺可能继续水解成羧酸。因此，开发无毒、无腐蚀、无羧酸副产物的方法，选择性生成单水合产物，即(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物，仍是一项具有挑战性的任务。
卟啉类化合物因其特殊的共轭大环结构，所以具有较好的热稳定性和化学稳定性。金属卟啉可以模拟过氧化物酶、细胞色素P450等蛋白质的生物功能，是重要的仿生催化剂之一(Chemical Reviews 2017,117,4:2910-3043)。卟啉及金属卟啉作为催化剂的优点包括：结构稳定、无毒无味，易从反应体系中分离、重复利用度高和易于合成等。
腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)是腈类化合物的代谢过程中的一种关键分解酶(Biotechnology Advances 2010,28:725-741)，能够在温和的条件下高效地水解腈变为相应的酰胺类化合物。
发明内容
为了克服传统化学合成(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的不足，本发明提供了一种绿色、高效、高顺反选择性的连续式化学-酶法合成(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的方法。
本发明通过如下技术方案实现：
一种基于金属卟啉的化学-酶连续催化法的(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的绿色制备方法，所述的方法以芳香醛和丙二腈为底物，以卟啉或金属卟啉为催化剂，在无溶剂条件下发生Knoevenagel反应，生成的芳基亚甲基丙二腈类化合物用于腈水合酶催化下的水合反应，可选择性地生成(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物。
其中，Ar为5-10元芳基或5-10元杂芳基。
具体包括以下步骤：
(1)将芳香醛和丙二腈按一定比例充分混合，以卟啉或金属卟啉作为催化剂，在无溶剂条件下，于30～80℃下发生Knoevenagel反应，反应时间为0.5-6小时，得到芳基亚甲基丙二腈类化合物。
(2)步骤(1)得到的化合物加入适量溶剂溶解，滤出金属卟啉，得到芳基亚甲基丙二腈类化合物的溶液。取适量该溶液加入到生物催化剂腈水合酶的磷酸盐缓冲液体系中，再发生水合反应，用乙酸乙酯萃取，得到(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物。
其中，
步骤(1)所述的芳香醛为取代或未取代的5-10元芳香醛、5-10元杂芳香醛，所述取代可以为单取代或多取代，取代基为卤素、硝基、氰基、羟基、C1～C10烷基、C1～C10烷氧基；
进一步地，所述的芳香醛包括但不限于取代或未取代的苯甲醛、呋喃甲醛、噻吩甲醛、咪唑甲醛、吡唑甲醛、吡啶甲醛、吡嗪甲醛、肉桂醛、萘甲醛、联苯甲醛，取代基为卤素、硝基、氰基、羟基、C1～C10烷基、C1～C10烷氧基。
步骤(1)所述的催化剂的用量为芳香醛用量的0.1～5％；
优选反应温度为60～80℃，反应时间为0.5～1小时，催化剂用量为1～2％。
步骤(1)所述的芳香醛和丙二腈的摩尔比例为1:1～1:3。
步骤(1)所述的金属卟啉催化剂具有如式(I)所示结构：
式(I)中，R1、R2、R3、R4各自独立为：取代或未取代的苯基、咪唑基、吡啶基、联苯基，所述的取代基为氨基、硝基、羧基，具体可以为4-氨基苯基、4-硝基苯基、4-羧基苯基、3,5-二羧基苯基、4-(4’-羧基联苯)基、4-咪唑基或4-吡啶基，M为钴(II)、铁(II)、镉(II)、锰(II)、镍(II)、锌(II)或铜(II)中的任意一种。
进一步地，步骤(1)所述的卟啉或金属卟啉催化剂为：5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉、5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)铁卟啉、5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)卟啉、5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)锌卟啉。
所述的金属卟啉可以按常规方法合成得到。
步骤(2)所述的生物催化剂腈水合酶来源于紫红色红球菌J1(Rhodococcusrhodochrous J1)；所述的生物催化剂的形式可以为细胞、粗酶粉、酶溶液或固定化酶。
步骤(2)所述的溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二氧六环或四氢呋喃；所述的芳基亚甲基丙二腈类化合物溶液的浓度为0.05～1mol/mL；所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为50～100mM，pH 5～9。
步骤(2)所述的金属卟啉可重复利用。
本发明以芳香醛和丙二腈为底物，以金属卟啉为催化剂，在无溶剂条件下发生Knoevenagel反应，生成的芳基亚甲基丙二腈类化合物经简单处理再直接用于腈水合酶催化下的水合反应，可选择性地生成(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物，为(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物的制备构建了一条高效、温和、绿色的合成路线。
与现有技术相比，本发明具有下列优点：
(1)本发明通过实验证明，金属卟啉可以高效催化Knoevenagel缩合反应，转化率>99％，且性质稳定，可以重复利用。
(2)本发明首次利用腈水合酶对芳基亚甲基丙二腈类化合物进行生物转化，可以合成高顺反选择性的(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物，其转化率>99％，顺反选择性>99％。
(3)本发明第一步采用无溶剂方法金属卟啉催化法，第二步采用酶催化方法，所述方法与传统化学合成方法相比更加高效且绿色环保，且所述的金属卟啉和腈水合酶均可通过商购获得，为制备(E)-α-氰基-β-芳基丙烯酰胺类化合物提供了新思路。
附图说明
图1为苯甲醛与苯基亚甲基丙二腈的HPLC谱图，用于检测转化率，
其中：A为底物苯甲醛，B为产物苯基亚甲基丙二腈；
图2为苯基亚甲基丙二腈与(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺的HPLC谱图，用于检测转化率及顺反选择性，
其中：A为底物苯基亚甲基丙二腈，B为产物(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺。
图3为(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺的1H-1H COSY谱图。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明的目的、特征、优点、技术方法，但不能局限于本发明的内容。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件或者厂商建议的条件。
实施例涉及的培养基配方：
(1)Rhodococcus rhodochrous种子培养基：KH2PO4 2.4g，K2HPO4 2.4g，葡萄糖10.0g，酵母膏8.0g，尿素2.0g，味精1.6g，MgSO4 2.4g，加蒸馏水定容至1000ml(如需配制固体平板培养基，可在灭菌前加入15g琼脂)，115℃，灭菌30min。
(2)Rhodococcus rhodochrous发酵培养基：KH2PO4 6.0g，K2HPO4 6.0g，葡萄糖30.0g，酵母膏8.0g，尿素9.2g，CoCl2.6H2O 24mg，味精0.96g，MgSO4 0.6g，加蒸馏水定容至1000ml，115℃，灭菌30min。
实施例1 5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉的制备
在50mL的圆底烧瓶中加入25mL丙酸，加入1.5g(10mmol)4-甲酰苯甲酸，加热至80℃，滴加0.68mL(10mmol)新蒸吡咯，升高温度至140℃回流反应2h，经TLC检测原料反应完全，停止反应，冷却至室温，放入4℃冰箱静置过夜。抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，得到目标产物。粗产品经柱层析得到黑紫色粉末状固体0.39g，转化率为20％。
实施例2 5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)卟啉的制备
在50mL的圆底烧瓶中加入25mL丙酸，加热至80℃，先加入0.85g(3.2mmol)2,2'-((4-羧基苯基)亚甲基)双(1H-吡咯)，搅拌至完全溶解后再加入0.307g(3.2mmol)4-咪唑甲醛，升高温度至140℃回流反应2h，经TLC检测原料反应完全，停止反应，冷却至室温，放入4℃冰箱静置过夜。抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，得到目标产物。粗产品经柱层析得到黑紫色粉末状固体0.37g，转化率为17％。
实施例3 5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)铁卟啉的制备
取0.1g(0.15mmol)5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)卟啉溶于40mLDMF，0.15g(1.2mmol)氯化亚铁溶于10mL DMF，将上述反应体系混合，120℃条件下反应12h。反应完毕后冷却至室温，加入50mL蒸馏水，静置，抽滤，DMF洗涤3次，分别用蒸馏水和乙醇洗涤，将滤饼真空干燥，得到目标产物0.11g，转化率为93％。
实施例4 5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)锌卟啉的制备
取0.1g(0.15mmol)5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)卟啉溶于40mLDMF，0.14g(1.2mmol)氯化锌溶于10mL DMF，将上述反应体系混合，120℃条件下反应12h。反应完毕后冷却至室温，加入50mL蒸馏水，静置，抽滤，DMF洗涤3次，分别用蒸馏水和乙醇洗涤，将滤饼真空干燥，得到目标产物0.11g，转化率为93％。
实施例5腈水合酶(EC 4.2.1.84)的制备-Rhodococcus rhodochrous J1的诱导培养
将紫红色红球菌J1(Rhodococcus rhodochrous J1)接种至3mL液体种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h。取1mL培养好的种子液接种至100mL发酵培养基中，置28℃、200rpm的摇床震荡培养，当培养液的OD600达到1.0，4000rpm离心15min，富集菌体，弃上清，菌体用100mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液洗涤两次，再次离心，将得到的菌体用100mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液分装保藏于4℃冰箱中。
实施例6金属卟啉催化剂用量和反应温度对于Knoevenagel反应的影响
表1
反应条件：苯甲醛(1mmol)、丙二腈(2mmol)、5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)铁卟啉，加热搅拌反应30分钟。a转化率通过高效液相色谱法测定。
实施例7苯基亚甲基丙二腈的制备
向10mL圆底瓶中加入1mmol苯甲醛、100mg(1.5mmol)丙二腈和10mg(1.4％mmol)5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)铁卟啉。混合物于60℃搅拌，经TLC检测至苯甲醛反应完全，再加入5mL二甲基亚砜，滤出金属卟啉可重复利用，得到苯基亚甲基丙二腈溶液，供下一步酶催化使用。经HPLC检测计算反应转化率>99％。
底物苯甲醛及产物苯基亚甲基丙二腈的HPLC检测条件为：色谱柱：ODS-C18柱；检测器：UV检测器；波长：254nm；流动相：乙腈：水＝50：50(v/v)；流动相流速：1mL/min；柱温：25℃。
实施例8(2-氟苯基)亚甲基丙二腈的制备
向10mL圆底瓶中加入1mmol 2-氟苯甲醛、132mg(2mmol)丙二腈和10mg(1.4％mmol)5,15-二(4-咪唑基)-10,20-二(4-羧基苯基)锌卟啉。混合物于60℃搅拌，经TLC检测至2-氟苯甲醛反应完全，再加入5mL乙醇，滤出金属卟啉可重复利用，得到(2-氟苯基)亚甲基丙二腈溶液，供下一步酶催化使用。经HPLC检测计算反应转化率>99％。
实施例9(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺的制备
将50mg腈水合酶(NHase)湿菌体悬浮于950μL 50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中并加入到1.5mL Eppendorf管中，然后加入0.1mmol/mL苯基亚甲基丙二腈的DMSO溶液50μL。室温条件下将该反应体系置于200rpm摇床，经TLC检测至底物反应完全。反应结束后加入10μL6N HCl以终止反应，将反应液12000rpm离心后，将上清液与沉淀分离。随后用3×1mL乙酸乙酯萃取上清液，合并有机层，减压除去溶剂，得到(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺1.7mg。经HPLC检测转化率>99％，顺反选择性>99％。
底物苯基亚甲基丙二腈及产物(E)-α-氰基-β-苯基丙烯酰胺的HPLC检测条件：色谱柱：ODS-C18柱；检测器：UV检测器；波长：254nm；流动相：乙腈：水：磷酸＝33：66：1(v/v)；流动相流速：1mL/min；柱温：25℃。
实施例10(E)-α-氰基-β-(2-氟苯基)丙烯酰胺的制备
将50mg NHase湿菌体悬浮于950μL 50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中并加入到1.5mL Eppendorf管中，然后加入0.1mmol/mL(2-氟苯基)亚甲基丙二腈的乙醇溶液50μL。室温条件下将该反应体系置于200rpm摇床，经TLC检测至底物反应完全。反应结束后加入10μL6N HCl以终止反应，将反应液12000rpm离心后，将上清液与沉淀分离。随后用3×1mL乙酸乙酯萃取上清液，合并有机层，减压除去溶剂，得到(E)-α-氰基-β-(2-氟苯基)丙烯酰胺1.9mg。经HPLC检测转化率>99％，顺反选择性>99％。
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