一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法
阅读说明：本技术 一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法 (Green synthesis method for converting field herbicide into theanine ) 是由 李平 冯骏晨 赵美燚 肖淳夫 于 2021-02-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法,以含有乙胺基团的田园除草剂为底物,经过脱氯反应、脱乙胺反应,生成乙胺；之后在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下,被合成茶氨酸。进而设计出基于莠去津氯水解酶(AztA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、GS组成的茶氨酸新型合成途径。本发明同时还构建了表达AtzA、AtzB的基因工程菌,且该菌内源性高表达GS,能够在降解田园除草剂的同时合成茶氨酸,发酵实验进行84h后可以合成439.8μM的茶氨酸,莠去津转化率达到44.0％。本发明提供的茶氨酸合成新技术在降解环境有害物的同时,有望提高茶树茶氨酸含量,具有良好的应用价值。(The invention relates to a green synthesis method for converting a rural herbicide into theanine, which takes the rural herbicide containing ethylamine as a substrate and generates ethylamine through dechlorination reaction and ethylamine removal reaction; then, theanine is synthesized by Glutamine Synthetase (GS). And then a novel theanine synthesis way based on the composition of atrazine chlorine hydrolase (AztA), hydroxyatrazine deaminase (AtzB) and GS is designed. The invention also constructs the genetic engineering bacteria expressing the AtzA and the AtzB, endogenous high-expression GS of the genetic engineering bacteria can synthesize theanine while degrading the pastoral herbicide, and the theanine with 439.8 mu M can be synthesized after 84 hours of fermentation experiments, and the conversion rate of atrazine reaches 44.0%. The novel theanine synthesis technology provided by the invention is expected to improve the theanine content of tea trees while degrading environmental harmful substances, and has good application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法。
背景技术
茶氨酸是茶树特征的非蛋白质类氨基酸，具有保护神经、改善认知、镇定安神等多种保健功效，被广泛应用于食品、保健品及医药行业中，具有较大的市场需求和越来越广阔的应用前景。
中国专利CN112250592A公开了一种竹叶青茶末中提取茶氨酸的方法，包括步骤：1)将茶末粉碎后过筛，加入蒸馏水，水浴加热进行浸提；2)将茶汤用超滤离心管进行超滤浓缩；3)超滤后将溶液利用树脂进行吸附后，加入乙醇醇沉；4)醇沉过后的茶汤，动态柱层析分离茶氨酸。得到的茶氨酸粗品中不含茶多酚、咖啡碱、茶多糖等杂质，茶氨酸粗品的提取率为88％，茶氨酸粗品中L-茶氨酸含量纯度为91.23％。
中国专利CN109777763B公开了一种新型高效γ-谷氨酰甲胺合成酶以及一株用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建方法与应用。该专利提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物合成L-茶氨酸的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，通过在其基因组上整合三拷贝的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA获得。通过系统代谢改造后，工程菌能够以葡萄糖和乙胺为原料合成L-茶氨酸，5L发酵罐发酵中L-茶氨酸的最高产量可达60g/L，糖酸转化率可达40％。
中国专利CN111073830A公开了一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCCNo.18686；使用该菌株在37℃，pH7.0条件下发酵生产γ-谷氨酰转肽酶；离心收集菌体细胞后在40℃，pH9.0条件下生物转化L-谷氨酰胺和乙胺得到L-茶氨酸；反应液经膜分离、离子交换树脂分离和浓缩结晶后获得合格的L-茶氨酸成品。
如上所述，现有的茶氨酸生产方法以茶叶提取法、发酵法为主，在成本、产量方面仍有提升空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法。本发明提供的方法不同于传统的茶叶提取法或发酵法，而是以田园除草剂(例如三嗪类除草剂)作为茶氨酸合成底物，规避了外源性添加底物乙胺对微生物的毒性，在降解环境有害物的同时合成茶氨酸，是一种全新的方法。
本发明引入合成生物学思维，使用生物信息学方法搜索和预测潜在的茶氨酸代谢通路，且不局限于茶树来源，设计了由AtzA、AtzB、GS组成的茶氨酸合成新途径。并以此为基础构建了一种基因工程菌株，该基因工程菌株能够在降解三嗪类除草剂(尤其是莠去津)的同时合成茶氨酸，发酵实验进行84h后可以合成439.8μM的茶氨酸，莠去津转化率达到44.0％。本发明技术方案突破了茶树原位的合成通路，建立了茶氨酸生物合成新技术。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法，以含有乙胺基团的田园除草剂(例如三嗪类除草剂)为底物，田园除草剂经过脱氯反应、脱乙胺反应，生成乙胺；之后在谷氨酰胺合成酶的作用下，被合成茶氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述底物中还包括谷氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述含有乙胺基团的田园除草剂为含有乙胺基团的三嗪类除草剂，优选为莠去津。
在本发明的一个实施方式中，所述三嗪类除草剂脱氯反应需要在莠去津氯水解酶(AtzA)存在的情况下进行。
在本发明的一个实施方式中，三嗪类除草剂经过脱氯反应后进行脱乙胺反应需要在羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)存在的情况下进行。
在本发明的一个实施方式中，乙胺被合成茶氨酸是在谷氨酰胺合成酶的作用下进行的。
在本发明的一个实施方式中，田园除草剂转化为茶氨酸的绿色合成方法，具体过程为：以三嗪类除草剂和谷氨酸为底物，利用高表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)的基因工程菌，通过发酵合成茶氨酸。
在本发明的一个实施方式中，高表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)的基因工程菌，其获得方式为：将莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)或谷氨酰胺合成酶(GS)中的一种或几种导入菌株中，以获得基因工程菌；
若菌株表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)或谷氨酰胺合成酶(GS)中的一个，则不需额外导入这种酶。
所述菌株优选为高产茶氨酸的茶树内生菌。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵是指：以2-5％的比例接种内源性高表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)的基因工程菌至LB培养基中，培养5-7h，加入终浓度0.5-1mM的三嗪类除草剂以及10-25mM的谷氨酸，发酵84h。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种茶氨酸合成方法的具体过程，为：
1)使用获赠的克氏假单胞菌(P.knackmussii，植物来源内生细菌，分离于水稻根部，菌种保藏号ACCC 05571；该菌株经实验室检测发现，内源性高表达GS，具有以乙胺为底物的茶氨酸合成能力)构建CFPS体系(PkCFPS)，验证茶氨酸新型合成途径，检测茶氨酸合成能力；
2)将莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)导入产茶氨酸内生菌P.knackmussii中，且该菌株内源性高表达谷氨酰胺合成酶(GS)，构建的基因工程菌以莠去津和谷氨酸为底物，通过发酵实验合成茶氨酸，建立茶氨酸合成新技术。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，本发明在无细胞蛋白合成体系中进行验证实验，具体是：在CFPS体系中分别表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)，蛋白表达4-8h后，取三个PkCFPS体系各10μL混合，并加入终浓度0.5-1mM的莠去津(5％丙酮助溶)和10-25mM的谷氨酸，30℃水浴反应，并在不同时间点取样，检测反应液中的茶氨酸合成量。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，本发明在无细胞蛋白合成体系中进行验证实验，具体是：在PkCFPS体系中分别表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)，蛋白表达4-8h后，取三个PkCFPS体系各10μL混合，并加入终浓度0.5-1mM的莠去津(5％丙酮助溶)和10-25mM的谷氨酸，30℃水浴反应，并在不同时间点取样，检测反应液中的茶氨酸合成量。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，PkCFPS体系中含有：12mM醋酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、34μg/mL亚叶酸、170μg/mL E.coli来源tRNA溶液、20种标准氨基酸各2mM、33mM PEP、200ng表达质粒、4μLP.knackmussii来源Extract。之后使用pJL1-AtzA、pJL1-AtzB和pJL1-GS表达质粒在PkCFPS体系中分别表达AtzA、AtzB和GS三个酶，蛋白表达4-8h后取三个PkCFPS体系各10μL混合，并加入终浓度0.5-1mM的莠去津(以5％丙酮作为莠去津的助溶剂)和10-25mM的谷氨酸，30℃水浴反应24h，不同时间点取样检测茶氨酸的合成量。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，构建的基因工程菌命名为P.knackmussii–AtzAB，该工程菌能够表达外源导入的AtzA、AtzB，并内源性含有高表达的谷氨酰胺合成酶(GS)。使用pJQ200SK介导的基因插入系统，将AtzA、AtzB基因插入P.knackmussii基因组中的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)位点，共转录的AtzAB基因的开放阅读框(ORF)由管家基因rpsL的启动子调控，该启动子为组成型表达启动子。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述发酵实验是指：以2-5％的比例接种基因工程菌株至LB培养基中，培养5-7h(OD600＝2.0)，加入终浓度0.5-1mM的莠去津(5％丙酮助溶)以及10-25mM的谷氨酸，发酵84h，并在不同时间点取样，检测发酵液中的茶氨酸合成量。
本发明中引入合成生物学理念，突破茶氨酸原位合成通路的限制，设计新型茶氨酸合成途径，进而开发茶氨酸合成新技术。
合成生物学是指设计和构建生物元件、装置和系统，并有目的地重新设计现有自然中的生物系统，广泛应用于化学合成、医药、农业、环境等领域。
本发明还提供一种基因工程菌，所述基因工程菌高表达莠去津氯水解酶(AtzA)、羟基莠去津脱乙胺基团酶(AtzB)、谷氨酰胺合成酶(GS)。
所述基因工程菌可以以含有乙胺基团的田园除草剂和谷氨酸为底物，通过发酵合成茶氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌为上述的P.knackmussii–AtzAB。
本发明设计的茶氨酸生物合成途径，该途径将含有乙胺基团的田园除草剂的降解和茶氨酸的生物合成偶联起来。含有乙胺基团的田园除草剂残留对动物、植物均有危害性，但鉴于其价格、效果等优势，仍拥有较大的市场体量和稳定的市场需求。因此构建偶联含有乙胺基团的田园除草剂降解的茶氨酸生物合成途径，具有一定的环境保护意义。
本发明通过经典的构建基因工程菌的方法，以及创造性地在CFPS体系中，验证上述茶氨酸新型合成途径，进而建立茶氨酸合成新技术。CFPS是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统，可以无障碍地将目的基因、底物等添加至反应环境中，直接探测其生物学功能。由于不涉及菌体生长和分裂，CFPS对于毒性底物、毒性产物等呈现出良好的耐受性，且体系内的能量更集中的供给与目的蛋白的转录和翻译。基于上述优势，近年来CFPS已成为合成生物学的重要平台，在筛选生物元件、设计基因电路、构建生物合成通路等研究中的应用越来越广泛。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明引入合成生物学思维，设计了由AtzA、AtzB、GS组成的茶氨酸合成新途径。以此为基础构建的基因工程菌株能够在降解含有乙胺基团的田园除草剂的同时合成茶氨酸，发酵实验进行84h后可以合成439.8μM的茶氨酸，莠去津转化率达到44.0％。本专利突破了茶树原位的合成通路，建立了茶氨酸生物合成新技术。本发明提供的茶氨酸合成新技术在降解环境有害物的同时，有望提高茶树茶氨酸含量，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为本发明的实施例1中使用生物信息学分析手段获得的潜在的茶氨酸合成途径。图中Cxxxxxx编号为KEGG数据库中的物质编号；实线箭头代表已知该反应对应的酶，因KEGG数据库中绝大部分反应均被标注为可逆反应，即由同一个酶催化、或由两个酶各催化一个方向的反应，所以图中均为双向箭头；虚线代表该反应已被证实，但对应的酶还未完成鉴定。
图2为本发明的实施例1中莠去津降解模式菌Pseudomonas sp.strain ADP降解莠去津的通路示意图。该降解通路主要包括脱氯、脱乙胺基团、脱异丙胺基团、以及均三嗪母核开环反应等步骤。
图3为本发明的实施例1中对比软件预测结果与莠去津降解通路后设计出的茶氨酸合成新途径的示意图。
图4为本发明的实施例2中在PkCFPS体系中验证茶氨酸合成新途径的示意图。
图5为本发明的实施例2中在PkCFPS体系中的验证茶氨酸合成新途径。其中A图为AtzA、AtzB和GS在PkCFPS体系中的表达情况。B图为PkCFPS体系中的反应时间-茶氨酸产量曲线。
图6为本发明的实施例3中构建基因工程菌P.knackmussii-AtzAB的方法示意图。
图7为本发明的实施例3中使用PCR和逆转录-PCR的方法，分别在基因组水平(图A)和mRNA水平(图B)上检测AtzA和AtzB的ORF。
图8为本发明的实施例4中在基因工程菌工程菌P.knackmussii-AtzAB发酵生产茶氨酸的时间-产量曲线。其中发酵实验的底物为莠去津和谷氨酸。
具体实施方式
本发明一个实施方式中提供一种茶氨酸合成新技术，其包括如下步骤：
(1)使用生物信息学手段搜索潜在的茶氨酸代谢通路，设计茶氨酸新型合成途径；
(2)构建和验证新型茶氨酸合成途径，建立茶氨酸合成新技术。
步骤(2)中，构建和验证新型茶氨酸合成途径，建立茶氨酸合成新技术的过程为：将预测的茶氨酸合成潜在途径与已知模式菌的莠去津降解通路进行对比，根据比对结果获悉可以在假单胞菌中构建新的茶氨酸合成途径。最终设计的合成途径是通过3个酶：AtzA、AtzB、GS，实现从莠去津→羟基莠去津→乙胺→茶氨酸的生物合成。
1)建立基于产茶氨酸内生菌P.knackmussii的CFPS体系(PkCFPS)，构建并验证新型茶氨酸合成途径。其中PkCFPS体系中含有：12mM醋酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、34μg/mL亚叶酸、170μg/mL E.coli来源tRNA溶液、20种标准氨基酸各2mM、33mM PEP、200ng表达质粒、4μL P.knackmussii来源Extract。之后使用pJL1-AtzA、pJL1-AtzB和pJL1-GS表达质粒在PkCFPS体系中分别表达AtzA、AtzB和GS三个酶，蛋白表达4-8h后取三个PkCFPS体系各10μL混合，并加入终浓度0.5-1mM的莠去津(以5％丙酮作为莠去津的助溶剂)和10-25mM的谷氨酸，30℃水浴反应24h，不同时间点取样检测茶氨酸的合成量。
2)构建基因工程菌P.knackmussii-AtzAB，实现茶氨酸生物合成的新技术。该工程菌能够表达外源导入的AtzA、AtzB，并内源性含有高表达的谷氨酰胺合成酶(GS)。使用pJQ200SK介导的基因插入系统，将AtzA、AtzB基因插入P.knackmussii基因组中的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)位点，共转录的AtzAB基因的开放阅读框(ORF)由管家基因rpsL的启动子调控，该启动子为组成型表达启动子，构建的基因工程菌株命名为P.knackmussii-AtzAB。使用PCR和逆转录-PCR的方法，分别在基因组水平和mRNA水平上分别检测了AtzA和AtzB的ORF，确定AtzA和AtzB被成功敲入P.knackmussii基因组中并成功完成表达。以2-5％的比例接种P.knackmussii-AtzAB菌株至LB培养基中，培养约5-7h(OD600＝2.0)，加入终浓度0.5-1mM的莠去津(5％丙酮助溶)以及10-25mM的谷氨酸，发酵84h，不同的时间点取样并检测茶氨酸浓度。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
利用软件预测茶氨酸潜在合成通路，设计茶氨酸合成新途径。
使用生物信息学分析手段搜索潜在的茶氨酸代谢通路，预测结果如图1所示，分析预测结果可知：1)乙胺可能由N-乙基三聚氰胺脱乙胺基生成，但反应需要的酶还未被鉴定；2)乙胺可能由N-乙基甘氨酸脱乙胺基生成，该反应涉及的酶已知，但N-乙基甘氨酸在生物体内和环境中含量极低；3)乙胺可能由羟基莠去津脱乙胺基团生成，羟基莠去津是由莠去津(Atrazine，也称阿特拉津)脱氯生成，莠去津是一种广泛使用的除草剂，具有一定的生物危害性，且存在土壤残留问题，因此以莠去津作为茶氨酸合成的潜在底物。
对比莠去津降解模式菌株Pseudomonas sp.strain ADP的降解通路(图2)与预测的茶氨酸合成潜在途径(图1)，设计的合成途径是通过3种酶：AtzA、AtzB、GS，实现从莠去津→羟基莠去津→乙胺→茶氨酸的生物合成(图3)。
实施例2
建立基于产茶氨酸内生菌P.knackmussii(分离于水稻根部，菌种保藏号ACCC05571)的CFPS(PkCFPS)体系，构建并验证新型茶氨酸合成途径。
先制备P.knackmussii来源的Extract，然后在1.5mL离心管中配置标准的15μLPkCFPS体系，反应体系中含有：12mM醋酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、34μg/mL亚叶酸、170μg/mL E.coli来源tRNA溶液、20种标准氨基酸各2mM、33mM PEP、200ng表达质粒、4μL基于P.knackmussii的Extract。
构建表达质粒pJL1-AtzA、pJL1-AtzB和pJL1-GS，验证思路如图4所示。分别配制含有pJL1-AtzA、pJL1-AtzB和pJL1-GS质粒的PkCFPS体系，在30℃水浴条件下反应4h合成蛋白，图5A为AtzA、AtzB和GS分别在PkCFPS体系中的表达情况。然后各取10μL的3种PkCFPS反应液并混合，加入终浓度1mM的莠去津(5％丙酮助溶)和终浓度25mM的谷氨酸作为底物，达到终体积50μL，继续在30℃水浴条件下反应24h合成茶氨酸。在不同的时间点取样，并加入3倍体积的乙醇，然后在12000rpm的条件下离心30min，吸取上清作为样品送检，绘制时间-茶氨酸产量曲线(图5B)。
实施例3
构建表达AtzA和AtzB的基因工程菌P.knackmussii-AtzAB。
通过比对Genbank上的P.knackmussii基因组数据(GenBank:HG322950.1)，发现此菌中不含有AtzA和AtzB基因，因此选择基因合成AtzA和AtzB用于代谢途径的构建；而乙胺到茶氨酸的转化可以由P.knackmussii中内源性高表达的GS完成。
使用pJQ200SK介导的基因插入系统，将AtzAB基因插入P.knackmussii基因组中的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)位点，共转录的AtzAB ORF由rpsL基因的启动子调控，构建的菌株命名为P.knackmussii-AtzAB，基因工程菌株构建过程如图6所示。使用PCR和逆转录-PCR的方法，分别在基因组水平(图7A)和mRNA水平(图7B)上检测了AtzA和AtzB的ORF，确定了AtzA和AtzB被成功敲入P.knackmussii基因组中，并成功完成了表达。
实施例4
利用实施例3构建的基因工程菌，进行降解莠去津的同时合成茶氨酸的发酵实验。
以5％的比例接种P.knackmussii-AtzAB菌株至LB培养基中，培养约7h(OD600＝2.0)，加入终浓度1mM的莠去津(5％丙酮助溶)以及25mM的谷氨酸，发酵84h后，取样并检测茶氨酸浓度；同时在过程中设置不同的时间点，取样并检测。检测结果显示发酵84h后，P.knackmussii-AtzAB可以在培养液中合成浓度约为439.8μM的茶氨酸，莠去津转化率达到44.0％。同时，P.knackmussii降解莠去津并合成茶氨酸的速度较快，加入底物45h后，茶氨酸产量即达到398.4μM，反应基本进行完全(图8)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。