一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用
阅读说明：本技术 一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用 (Fermentation preparation method of antibacterial peptide, antibacterial peptide hydrogel and application ) 是由 陈刚 于 2021-03-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用,该制备方法包括以下步骤：S1、将枯草芽孢杆菌种于LB液体培养基中,得到培养液；S2、将培养液以1％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵；S3、将步骤S2获得的培养液进行离心,然后经过质量浓度为390g/L的硫酸铵进行沉淀,沉淀物即为得到的抗菌肽。抗菌肽从乳酸杆菌和解淀粉芽孢杆菌中分离获得,而抗菌肽在对GV等致病菌杀伤的同时,又可以促进乳酸杆菌的生长,这种药物药效学效果对于细菌性阴道炎的治疗是十分有利的,且可用于治疗HPV人乳头瘤病毒。(The invention discloses a fermentation preparation method of antibacterial peptide, antibacterial peptide hydrogel and application, wherein the preparation method comprises the following steps: s1, putting the bacillus subtilis into an LB liquid culture medium to obtain a culture solution; s2, inoculating the culture solution into a fermentation medium by an inoculation amount of 1% for fermentation; s3, centrifuging the culture solution obtained in the step S2, and then precipitating the culture solution by ammonium sulfate with the mass concentration of 390g/L, wherein the precipitate is the obtained antibacterial peptide. The antibacterial peptide is obtained by separating from lactobacillus and bacillus amyloliquefaciens, can promote the growth of the lactobacillus while killing pathogenic bacteria such as GV, and the like, has favorable pharmacodynamic effect on the treatment of bacterial vaginitis, and can be used for treating HPV (human papilloma virus).)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用。
背景技术
患有细菌性阴道炎的妇女常常伴随着阴道酸性下降，致使易受病毒如HIV的影响。当今研究是以PEG纳米载体为基础的可降解水凝胶实现乳酸的控释。PEG-la纳米载体与乳酸之间通过PEG-SH共价结合。PEG-LA有4个乳酸分子的拷贝，可以实现对乳酸的控释，使得在磷酸盐缓冲盐水中和醋酸盐缓冲液中的最大释放范围分别为23％和47％。当弹性系数大于粘性系数的100倍时，水凝胶可在20min内形成。由于聚合物链的位阻现象，最大释放率一般在10％-14％之间。与此相反的是，含有截留的乳酸的水凝胶在30min内可实现完全释放。当MIC为3.6mg/mL时，乳酸显示抑菌(原bv病原体Gardnerella vaginalis)活性。含有被截留乳酸的水凝胶可在48h内完全抑制G.vaginalis的生长。这些研究都展示出PEG纳米载体为基础的水凝胶(阴道内给药)在预防治疗BV方面的巨大潜力。
因此，一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用亟待提出。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种抗菌肽的发酵制备方法、抗菌肽水凝胶及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供一种抗菌肽的发酵制备方法，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌种于LB液体培养基中，得到培养液；
S2、将培养液以1％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵；
S3、将步骤S2获得的培养液进行离心，然后经过质量浓度为390g/L的硫酸铵进行沉淀，沉淀物即为得到的抗菌肽。
作为本发明的一种优选技术方案，所述发酵培养基按照重量百分比由以下组分组成：16～22份马铃薯淀粉，16～22份葡萄糖，20～26份棉籽糖，1～3份酵母粉，4～6份乙酸钠，1～3份柠檬酸二胺，2～4份磷酸氢二钾，0.1～0.4份硫酸镁，0.01～0.05份硫酸锰，0.1～0.2份吐温80。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中发酵温度为36～38℃，发酵时间为12～14小时。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种抗菌肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
Q1、将抗菌肽的发酵制备方法制备的抗菌肽经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为40％的抗菌肽水溶液；按照质量比为丙交酯：聚乙二醇＝5:1～1:5，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；
Q2、将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到抗菌肽水溶液中，在10-25℃下静置20分钟形成抗菌肽水凝胶。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种抗菌肽水凝胶应用于治疗阴道炎。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明一种抗菌肽水凝胶应用于治疗HPV人乳头瘤病毒。
本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：
第一，抗菌肽从乳酸杆菌和解淀粉芽孢杆菌中分离获得，乳酸杆菌和解淀粉芽孢杆菌发现于发酵的乳制品。这些细菌自然存在于人类的消费品中，因此按照定义来说是安全的。从解淀粉芽孢杆KATMIRA1933中获得的subtilosin A已被证实对人类正常组织是安全的，具有一定的杀精活性，并可有效杀死食物传播的和阴道病原体。
第二，抗菌肽带有负电荷。众所周知，细菌性阴道炎表现出来的临床症状之一就是阴道分泌物pH的升高。抗菌肽所携带的负电荷对于维持阴道酸性微环境具有独特的优势。
第三，抗菌肽可从乳酸杆菌中获得，其作为乳酸杆菌的产物，对于乳酸杆菌的生长是有益的。乳酸杆菌是作为阴道一种自我保护的益生菌而存在。在细菌性阴道炎患者阴道中，致病菌(加德纳菌GV、厌氧菌(主要是动弯杆菌)、支原体以及大肠杆菌、粪肠球菌、链球菌等的异常生长导致乳酸杆菌比例失调。而抗菌肽在对GV等致病菌杀伤的同时，又可以促进乳酸杆菌的生长，这种药物药效学效果对于细菌性阴道炎的治疗是十分有利的，且可用于治疗HPV人乳头瘤病毒。
第四，本发明发酵制备方法中采用硫酸铵沉淀分布进行，去除部分杂质，减少纯化柱压力。
附图说明
图1是本发明中抗菌肽的形态图。
图2是本发明中抗菌肽的抑菌活性的试验结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
为了达到本发明的目的，在本发明的其中一种实施方式中提供一种抗菌肽的发酵制备方法，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌种于LB液体培养基中，得到培养液。
S2、将培养液以1％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵温度为38℃，发酵时间为14小时；所述发酵培养基按照重量百分比由以下组分组成：22份马铃薯淀粉，22份葡萄糖，26份棉籽糖，3份酵母粉，6份乙酸钠，3份柠檬酸二胺，4份磷酸氢二钾，0.4份硫酸镁，0.05份硫酸锰，0.2份吐温80。
S3、将步骤S2获得的培养液进行离心，然后经过质量浓度为390g/L的硫酸铵进行沉淀，沉淀物即为得到的抗菌肽。
实施例2
作为第二实施例，本实施例提供一种抗菌肽的发酵制备方法，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌种于LB液体培养基中，得到培养液。
S2、将培养液以1％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵温度为36℃，发酵时间为12小时；所述发酵培养基按照重量百分比由以下组分组成：16份马铃薯淀粉，16份葡萄糖，20份棉籽糖，1份酵母粉，4份乙酸钠，1份柠檬酸二胺，2份磷酸氢二钾，0.1份硫酸镁，0.01份硫酸锰，0.1份吐温80。
S3、将步骤S2获得的培养液进行离心，然后经过质量浓度为390g/L的硫酸铵进行沉淀，沉淀物即为得到的抗菌肽。
实施例3
作为第三实施例，本实施例提供一种抗菌肽的发酵制备方法，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌种于LB液体培养基中，得到培养液。
S2、将培养液以1％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵温度为37℃，发酵时间为13小时；所述发酵培养基按照重量百分比由以下组分组成：20份马铃薯淀粉，20份葡萄糖，25份棉籽糖，2.5份酵母粉，5份乙酸钠，2份柠檬酸二胺，3份磷酸氢二钾，0.2份硫酸镁，0.03份硫酸锰，0.15份吐温80。
S3、将步骤S2获得的培养液进行离心，然后经过质量浓度为390g/L的硫酸铵进行沉淀，沉淀物即为得到的抗菌肽。
实施例4
作为第四实施例，本实施例还提供一种抗菌肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
Q1、将抗菌肽的发酵制备方法制备的抗菌肽经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为40％的抗菌肽水溶液；按照质量比为丙交酯：聚乙二醇＝1:5，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；
Q2、将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到抗菌肽水溶液中，在25℃下静置20分钟形成抗菌肽水凝胶。
实施例5
作为第五实施例，本实施例还提供一种抗菌肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
Q1、将抗菌肽的发酵制备方法制备的抗菌肽经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为40％的抗菌肽水溶液；按照质量比为丙交酯：聚乙二醇＝5:1，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；
Q2、将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到抗菌肽水溶液中，在10℃下静置20分钟形成抗菌肽水凝胶。
实施例6
作为第六实施例，本实施例还提供一种抗菌肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
Q1、将抗菌肽的发酵制备方法制备的抗菌肽经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为40％的抗菌肽水溶液；按照质量比为丙交酯：聚乙二醇＝2:1，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；
Q2、将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到抗菌肽水溶液中，在20℃下静置20分钟形成抗菌肽水凝胶。
抗菌肽分子量3.4kDa，在温度4℃，浓度9～12μg/mL下，发挥最大抑菌作用。在保存条件为pH4～7，温度4～18℃，至少可以稳定存放1.5～2年。pH维持在中性抗菌肽subtilosin的活性最高。
本实施例还提供一种抗菌肽水凝胶应用于治疗阴道炎。
下面将抗菌肽水凝胶对阴道炎症病原体的抑制作用进行实验。
(1)实验原理：
阴道内微生物群是一个由多种微生物构成的复杂环境，临床上阴道炎根据致病的病原体可以分为四类：滴虫性阴道炎(trichomonal vaginitis,TV)，念珠菌阴道炎(vulvovaginal candidiasis,VVC)，细菌性阴道炎(bacterial vaginosis,BV)，需氧性阴道炎(aerobic vaginitis,AV)。这四类阴道炎的病原体不同，分别为阴道毛滴虫、白念珠菌、阴道加德纳菌、其他需氧性细菌等。另外乳酸杆菌作为阴道内的正常菌群，如数量减少引起阴道内环境改变进而引起阴道炎。因此在后续的抑菌实验中计划选取阴道毛滴虫、白念珠菌、大肠埃希菌、乳酸杆菌(两株)作为实验对象。
(2)实验材料
阴道毛滴虫
培养基：肝浸液培养基加入血清
培养方法：37℃厌氧培养
实验试剂：甲硝唑
其他实验材料：96孔板(Nunc)、三角瓶、Tips等
白念珠菌
培养基：沙堡培养基
培养方法：37℃培养
实验试剂：两性霉素B
其他实验材料：96孔板(Nunc)、三角瓶、Tips等
大肠埃希菌
培养基：LB培养基
培养方法：37℃培养
实验试剂：头孢曲松
其他实验材料：96孔板(Nunc)、三角瓶、Tips等
乳酸杆菌
培养基：乳酸杆菌肉汤培养基
培养方法：37℃培养
其他实验材料：96孔板(Nunc)、三角瓶、Tips等
(3)实验方法
1、抗菌肽对阴道毛滴虫的抑制作用实验
将滴虫接种于5ml肝浸液培养基中，37℃温箱过夜培养。
准备新鲜液体培养基，将菌液放入15ml试管中。将抗菌肽做系列稀释，并设置甲硝唑阳性对照组。共12支试管，每组两个重复。
阴性对照组：PBS
阳性对照组：60μg/ml甲硝唑
实验组1：440μg/ml抗菌肽
实验组2：220μg/ml抗菌肽
实验组3：110μg/ml抗菌肽
实验组4：55μg/ml抗菌肽
取0.05ml的滴虫悬液，加滴虫悬液于各管内，混匀。将试管置于37℃温箱中培养48h，在管底下吸取培养液一滴置玻片在显微镜下观察。滴虫不生长的最小浓度管的浓度为最小抑菌浓度。
2、抗菌肽对白念珠菌的抑制作用实验
挑取菌落接种于5ml沙堡培养基中，37℃温箱过夜培养。
1:100转接于新鲜沙堡培养基，将菌液放入96孔板中。分为7组，每组设八复孔。
阴性对照组：DMSO(两性霉素B配置溶剂)
阴性对照组：PBS(抗菌肽配置溶剂)
阳性对照组：10μg/ml两性霉素B
实验组1：440μg/ml抗菌肽
实验组2：220μg/ml抗菌肽
实验组3：110μg/ml抗菌肽
实验组4：55μg/ml抗菌肽
将96孔板置于37℃培养箱中培养，分别于24h、48h监测细菌OD600值。
3、抗菌肽对大肠埃希菌的抑制作用实验
挑取菌落接种于5ml LB培养基中，37℃温箱过夜培养。
1:100转接于新鲜LB培养基，将菌液放入96孔板中。分为6组，每组设八复孔。
阴性对照组：PBS
阳性对照组：10μg/ml头孢曲松
实验组1：440μg/ml抗菌肽
实验组2：220μg/ml抗菌肽
实验组3：110μg/ml抗菌肽
实验组4：55μg/ml抗菌肽
将96孔板置于37℃培养箱中培养，分别于24h、48h监测细菌OD600值。
4、抗菌肽对阴道正常菌乳酸杆菌是否存在抑制作用
此实验中选取两种阴道内常见的乳酸菌，分别为加氏乳杆菌和卷曲乳杆菌。
挑取菌落接种于5ml乳酸杆菌肉汤培养基中，37℃厌氧箱过夜培养。
1:100转接于新鲜乳酸杆菌肉汤培养基，将菌液放入96孔板中。分为5组，每组设八复孔。
阴性对照组：PBS
实验组1：440μg/ml抗菌肽
实验组2：220μg/ml抗菌肽
实验组3：110μg/ml抗菌肽
实验组4：55μg/ml抗菌肽
将96孔板置于37℃厌氧箱中培养，分别于24h、48h监测细菌OD600值。
我们实验室共保存了三株白念珠菌，分别对抗真菌药物高度敏感、中度敏感和不敏感。因此此次抗菌肽实验中需用到的病原体一共有8种：阴道毛滴虫、白念珠菌3株、大肠埃希菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌。
预估抗菌肽用量：之前保存的抗菌肽浓度为4.4mg/ml，每种病原体一次实验中约需1.5ml抗菌肽，即抗菌肽的用量为6.6mg，考虑到实际实验中可能会有因为操作造成的损耗，因此总共需要66mg抗菌肽。
下面对抗菌肽的抑菌活性进行试验。
(1)抗菌肽悬液制备
抗菌肽干粉称重为6.0mg，纯度为95％，用1ml PBS溶解，终浓度为5.7mg/mL。
(2)抗菌肽抑菌试验
挑取血平板上的菌落至液体培养基中，经过48个小时的培养后，转接入新鲜培养基，使初始OD600为0.1，按照顺序分别加入PBS，甲硝唑及抗菌肽，培养6、12、24、36、48小时后测量OD600值。
(3)将上述OD600的数值进行如下处理：每组的A-H复孔取平均值，再减掉Blank组的平均值为每组的最终OD600值，以时间(hour)为横坐标，以OD600为纵坐标，作折线图。结果如图2所示。
从试验结果来看，甲硝唑浓度为60μg/ml时，阴道加德纳菌未见明显生长，甲硝唑浓度为30μg/ml时，48小时细菌有部分生长。抗菌肽浓度为35.6μg/ml时，细菌正常生长，浓度为71.25μg/ml及以上时，细菌未见明显生长。
水凝胶结构：以PEG为基础，PEG-SH(8臂)和PEG-NHS(4臂)通过硫酯键共价交联。
水凝胶对乳酸的控释：以PEG-乳酸菌纳米载体为基础的可降解的水凝胶为基础来重建阴道环境。
使用PEG纳米载体为基础的水凝胶以实现对乳酸的控释。这种纳米载体为基础的水凝胶形成迅速(20min内)，在生理酸性条件下具有弹性并且可以降解。乳酸从水凝胶上释放的过程可以持续若干天。最大释放率在14％左右。与此相反的是，水凝胶与截留的乳酸在30min内可以实现高达90％的释放率。当MIC为3.6mg/mL时，乳酸显示抑菌(原bv病原体Gardnerella vaginalis)活性。含有被截留乳酸的水凝胶可在48h内完全抑制G.vaginalis的生长。这些研究都展示出PEG纳米载体为基础的水凝胶(阴道内给药)在预防治疗BV方面的巨大潜力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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