一种固定化酶催化制备d-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法
阅读说明：本技术 一种固定化酶催化制备d-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法 (Method for preparing D-p-methylsulfonylphenylserine ethyl ester under catalysis of immobilized enzyme ) 是由 金毅强 申屠有德 雷江 徐健 于 2021-01-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种固定化酶制备D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法。该方法条件温和,后处理简单,酶可回收使用,对生产装置的腐蚀性低。本发明提供的超顺磁性Fe-3O-4纳米粒子固定化新型脂肪酶不对称催化拆分体系来制备高光学纯度的D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法,其优势在于：光学纯度的D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的总产率达到85％,所得产物的对映体过量(ee％)达到93％,具有更高的收率和光学纯度；此外,后处理简单,固定化酶催化剂可以通过简单的外加磁场重新回收再利用,重复使用10次以后,产物仍然具有较高的收率和ee值。(The invention discloses a method for preparing D-p-methylsulfonylphenylserine ethyl ester by using immobilized enzyme. The method has mild conditions, simple post-treatment, recyclable enzyme and low corrosivity to production devices. The invention provides superparamagnetic Fe 3 O 4 The method for preparing the D-p-methylsulfonylphenylserine ethyl ester with high optical purity by using the nano particle immobilized novel lipase asymmetric catalytic resolution system has the advantages that: the total yield of the D-p-methylsulfonylphenylserine ethyl ester with optical purity reaches 85%, the enantiomeric excess (ee%) of the obtained product reaches 93%, and the yield and the optical purity are higher; in addition, the post-treatment is simple, the immobilized enzyme catalyst can be recycled through a simple external magnetic field, and the product still has high yield and ee value after being repeatedly used for 10 times.)
技术领域
本发明涉及一种D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的制备方法，具体地，涉及一种磁性纳米粒子固定化新型脂肪酶-CuCl2不对称催化拆分制备高光学纯度的D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法。
背景技术
手性化合物广泛存在于药物分子、天然产物、生物活性分子等多种成分中。特别地，在药物化学领域，药物不同的手性通常表现出不同的药物活性和毒性，最著名的就是发生于上世纪五六十年代的“反应停事件”。因此，在制药工程中，生产具有合格光学纯性质的药物中间体已成为必须且越来越重要。D-对甲砜苯丝氨酸乙酯(D-p-MPSE)是合成抗生素氟苯尼考的重要中间体。氟苯尼考是氯霉素的衍生物，在治疗动物的传染性疾病如赤磷病中，表现出优异的效果(李秀波，石波，新型广谱抗菌药——氟苯尼考，《中国畜牧兽医》，1999)；但是，其另一种非对映异构体，却表现出极其微弱的抗真菌活性。因此对D-p-MPSE的制备研究，尤其是通过手性拆分的方法，具有重要的意义。
就目前的研究及相关专利来说，制备D-p-MPSE的方法有两种路线：1)化学合成-拆分方法：对甲砜基苯丝氨酸路线和对甲砜基苯丝氨酸铜路线；2)酶催化拆分路线。HisaoTobiki等人报道的方法，通过酒石酸拆分，可以得到较高收率的D-p-MPSE，但是该过程对设备的耐腐蚀性要求较高，提高了生产成本，因此其工业化应用受限；董顺康等人改进了化学合成-拆分方法的反应过程：以甲砜基苯丝氨酸铜、乙醇为生产原料，浓硫酸作为酯化反应的催化剂，可以以75-82％的收率得到目标产品。相对来说，该工艺对设备的要求较低，但是其收率相对较低。还有一些其他通过化学方法合成的D-p-MPSE，即使化学法的原料相对便宜，但是整个过程来说，他们都表现出了如生产成本高(如用到大量拆分试剂、溶剂、废液后处理等)、工艺复杂、产品光学纯度差等问题，限制了化学法合成光学纯D-p-MPSE的化工生产。
酶催化的手性拆分具有一定优势，如酶催化过程所表现出来的高选择性，高效性和条件温和的特性，都使得酶促反应成为选择性高效催化合成过程的首选。在手性拆分中，使用脂肪酶酶法拆分手性物质主要是依据其独特的立体选择性，其过程就是外消旋底物的一对对映体对酶的活性中心进行的竞争性的反应，从而实现反应产物或者是剩余底物具有单一的光学活性的目的。郭锐等报道称使用脂肪酶实现了DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的手性拆分，但是其终产物转化率较低，仅为68.6％(a.R Guo,YX Fan,XL Chen,YC Shen,J.Agric.Food Chem.,2013,6,157–166；b.郭锐，范永仙，陈小龙,浙江农业科学，2012,8,1197-1200)。相比于化学拆分来说，酶促拆分过程更容易得到高选择性的产物，反应可以在温和条件下进行，避免了苛刻化学反应条件下要使用到的化学试剂和对反应设备的要求，同时避免了副反应的发生和化学反应产生的废弃物，降低了生产成本。
虽然酶催化路线具有独特优势，如反应条件温和，反应选择性高，反应效率高。但是脂肪酶的合成过程相对繁复且酶在一些复杂反应条件下容易失活。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种操作简单、生产成本低，利用新型的超顺磁性纳米粒子固定化脂肪酶-CuCl2不对称催化拆分体系来制备高光学纯度的D-p-PMSE。
本发明为了实现上述目的，通过下列技术方案来实现的：
一种固定化酶催化制备D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法，包括：
在固定化酶和CuCl2的催化下，DL-thero-对甲砜基苯丝氨酸乙酯进行不对称催化拆分，拆分结束后经过后处理得到所述的D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯；
所述的固定化酶包括作为载体的磁性纳米粒子和负载于载体上的脂肪酶。
本发明中，通过磁性纳米粒子固定化的新型脂肪酶对消旋体DL-对甲砜基苯丝氨酸乙酯进行手性拆分，固定化脂肪酶可以特异性地水解L(+)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，而对D(-)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯无水解作用(如图1所示)，从而可以直接得到D(-)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯。此外，固定化酶也提高了酶对反应体系的耐受性，例如pH耐受性、温度耐受性都有所提高。该过程降低了生产成本，提高了催化剂利用率，符合绿色可持续化学的发展要求。值得注意的是：与现有报道的酶催化拆分方法(a.R Guo,YX Fan,XL Chen,YC Shen,J.Agric.Food Chem.,2013,6,157–166；b.郭锐，范永仙，陈小龙,浙江农业科学，2012,8,1197-1200)具有更高的收率且催化剂可重复使用，降低了生产成本。
作为优选，所述的固定化酶采用以下方法制备得到：
(1)三氯化铁或其水合物、柠檬酸钠和乙酸钠在乙二醇中反应，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)Fe3O4磁性纳米粒子采用聚乙烯亚胺进行功能化，得到Fe3O4@PEI；
(3)以戊二醛作为交叉偶联试剂，所述的Fe3O4@PEI与脂肪酶的缓冲溶液进行反应，反应完全后经过后处理得到所述的固定化酶。
本发明中，脂肪酶是按照现有方法获得的，例如可以直接购买，也可以按照现有技术中记载的通过构建脂肪酶基因工程菌，从菌株中分离出来的脂肪酶基因与载体质粒进行重组，在大肠杆菌中进行表达，通过基因突变的技术得到的。脂肪酶经过过镍柱纯化，纯化脂肪酶可直接用于拆分过程，其在固定化反应过程中的给酶量为200～300mg/g(脂肪酶/纳米粒子)，作为优选，最佳给酶量为250mg/g，酶溶液浓度为1％。需要说明的是，按照描述纯化后的脂肪酶直接使用即可，不需要其他处理。
本发明中，加入CuCl2可以抑制副反应发生，这是由于Cu2+可以与氨基和酯键氧通过配位作用形成螯合物，或者是与α-羟基和羰基氧形成六元螯合产物。螯合物的形成不仅加速了酯键的水解，而且也阻止了对甲砜基苯丝氨酸乙酯分解生成对甲砜基苯甲醛，抑制了副反应的发生。作为优选，所述的CuCl2的用量为DL-thero-对甲砜基苯丝氨酸乙酯摩尔量的10～20％。
本发明中，所述的固定化酶与所述DL-thero-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的质量用量比为1～2：10。
作为优选，所述的不对称催化拆分在溶剂中进行，所述的溶剂为pH值为7.0～8.0的磷酸缓冲溶液；进一步优选为7.2。
作为优选，所述的不对称催化反应的温度为30℃～40℃，优选为37℃。
此外，反应结束后，通过外加磁铁可以直接将固定化酶和反应体系分离，实现催化剂的回收。回收催化剂经缓冲液洗涤并干燥后，可以再次作为不对称催化拆分的酶催化剂，实验表明，重复使用10次以上，该固定化酶仍然具有较高的催化活性。
同现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1)本发明作为拆分方法，可以实现反应完毕后酶催化剂的快速回收和重复利用，固定化酶可重复使用10次以上，提高了催化剂利用率，降低了生产成本。
2)本发明作为拆分方法，在该拆分过程中不需要加入额外的拆分试剂如酒石酸，使用固定化酶作为拆分催化剂，反应条件温和，选择性高，后处理简单，对生产装置的腐蚀性低。
3))该磁性纳米粒子固定化脂肪酶-CuCl2不对称拆分催化循环体系，与现有报道的酶催化拆分方法相比，具有更高的收率(85％)和光学纯度(93％ee)。
附图说明
图1为本发明Fe3O4磁性纳米颗粒固定化新型脂肪酶(Fe3O4@PEI-Lipase)-CuCl2不对称催化拆分DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的示意图；
图2为实施例1得到的Fe3O4@PEI-Lipase纳米粒子电镜图；
图3为实施例1得到的D(-)-p-MPSE高效液相色谱检测结果；
图4为实施例1重复10次得到的D(-)-p-MPSE高效液相色谱检测结果；
图5为实施例2得到的Fe3O4@PEI-Lipase纳米粒子电镜图(磁性纳米粒子制备温度为200℃)；
图6为实施例2得到的D(-)-p-MPSE高效液相色谱检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述，但是不受此限，图1为本发明的反应流程。
实施例1
1)超顺磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶(Fe3O4@PEI-Lipase)的制备
6.48g六水合三氯化铁、4.704g柠檬酸钠和9.84g乙酸钠溶解到400mL乙二醇中，混合液超声分散均匀后，分装到10个100mL聚四氟乙烯高压反应釜中，于140℃反应12小时，降至室温后，粗产物经磁铁分离后用水和乙醇洗涤3-5次(洗至中性)。真空干燥后备用。
上述磁性纳米粒子5g和PEI(Mw＝10000)25g溶解到60mL蒸馏水中，反应液剧烈搅拌24小时后，磁分离。固体用蒸馏水(20mL)洗涤3-4次后真空干燥备用(标记为Fe3O4@PEI)。
上述PEI活化的磁性纳米粒子Fe3O4@PEI加入到蒸馏水中，然后加入7％戊二醛溶液(m/V)，室温反应4小时后，洗涤，真空干燥。干燥后的活化Fe3O4@PEI 5g加入到100mL磷酸缓冲液中(0.1M,pH＝7.0)，然后向其中加入1％褶皱假丝酵母脂肪酶磷酸缓冲液溶液(0.1M,pH＝7.0)，按照最佳给酶量(250mg/g)计算加入酶溶液的体积。加入酶溶液后，反应于37℃摇床反应6小时。磁分离后固体经缓冲液洗涤后真空35℃干燥12小时，即得到Fe3O4@PEI-Lipase纳米粒子。得到的Fe3O4@PEI-Lipase纳米粒子电镜图见图2。
2)催化手性拆分(实验室克级反应)
将10g DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯加入到盛有0.2L水的反应釜中，加入磷酸缓冲液(pH＝7.0)，在25℃加入2.0g固定化脂肪酶和底物量10mol％的CuCl2，反应60小时之后，通过外加磁场，使催化剂和反应体系分离，反应混合液经过柱纯化后可得到D(-)-p-MPSE，收率85％(以底物中的D(-)-p-MPSE计)。
纯度检测：本发明的产物光学纯度通过高效液相色谱进行检测，结果如图3所示，显示所得产物的ee值为81％，图谱数据见表1。
表1产物的HPLC图谱数据
序号
保留时间
峰面积
峰高
相对峰面积
相对峰高
1
12.257
7.076
16.017
90.74
92.02
2
17.000
0.722
1.389
9.26
7.98
3)重复使用
上述反应完毕后，通过外加磁场将催化剂和反应体系分离，固定化脂肪酶经过缓冲液洗涤3次后，真空干燥。继续按照上述反应条件进行催化拆分反应，得到产物的收率为70％，ee值为80％。重复10次以后，仍然能够得到产品的产率为65％，ee值为70％(图4)。
实施例2
1)超顺磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶(Fe3O4@PEI-Lipase)的制备
6.48g六水合三氯化铁，4.704g柠檬酸钠和9.84g乙酸钠溶解到400mL乙二醇中，混合液超声分散均匀后，分装到10个100mL聚四氟乙烯高压反应釜中，于200℃反应6小时，降至室温后，粗产物经磁铁分离后用水和乙醇洗涤3-5次(洗至中性)。真空干燥后备用。
上述磁性纳米粒子5g，PEI 25g溶解到60mL蒸馏水中，反应剧烈搅拌24小时后，磁分离。固体用蒸馏水(20mL)洗涤3-4次后真空干燥备用(标记为Fe3O4@PEI)。
活化及酶的固定化同实施例1，得到的Fe3O4@PEI-Lipase纳米粒子电镜图见图5。
2)催化手性拆分
将100g DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯加入到盛有2L水的反应釜中，加入磷酸缓冲液(pH＝7.4)，在30℃加入20g固定化脂肪酶和20mol％的CuCl2，反应120小时之后，通过外加磁场，使催化剂和反应体系分离，反应混合液经过柱纯化后可得到D(-)-p-MPSE，收率80％(以底物中的D(-)-p-MPSE计)。
纯度检测：本发明的产物光学纯度通过高效液相色谱进行检测，结果如图6所示，显示所得产物的ee值为93％，图谱数据见表2。
表2产物的HPLC图谱数据
序号
保留时间
峰面积
峰高
相对峰面积
相对峰高
1
11.753
12.067
27.664
96.52
96.64
2
16.447
0.4351
0.850
3.48
3.36
对比例1
1)超顺磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶(Fe3O4@PEI-Lipase)的制备同实施例2。
2)催化手性拆分
将10g DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯加入到盛有0.2L水的反应釜中，加入磷酸缓冲液(pH＝7.0)，在25℃加入2.0g固定化脂肪酶和底物量10mol％的ZuCl2，反应60小时之后，通过外加磁场，使催化剂和反应体系分离，反应混合液经过柱纯化后可得到D(-)-p-MPSE，收率50％(以底物中的D(-)-p-MPSE计)。
该结果表明，若不使用氯化铜，则不能高效拆分底物得到目标产物。
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