阅读说明：本技术 在环境温度时稳定的新食品 (Novel food product stable at ambient temperature ) 是由 毛跃建 于 2019-07-16 设计创作，主要内容包括：本申请涉及基于用稳定的乳酸菌对食品进行接种而制造在环境温度时稳定的食品的方法,所述乳酸菌能够在环境温度时存储时保持成活力并稍微降低pH。本发明还涉及这些稳定的乳酸菌用于在食品中接种的用途。(The present application relates to a method for manufacturing a food product stable at ambient temperature based on the inoculation of the food product with a stable lactic acid bacterium capable of maintaining viability and slightly lowering the pH upon storage at ambient temperature. The invention also relates to the use of these stabilized lactic acid bacteria for inoculation in food products.)

具体实施方式

发明人出乎意料地鉴定了可以添加到食品中的乳杆菌属菌株，使得当在环境温度时存储时，这些菌株在食品中的活力和食品的pH两者可接受地降低。因此，当在环境温度时存储至少6个月时，该食品含有高水平的细菌并具有可接受的pH。

本发明涉及用于制造在环境温度时稳定的食品的方法，所述方法包括：

1)提供pH在3.4至4.6之间的初始食品，特别是pH在3.4至4.6之间的低细菌含量的初始食品，所述低细菌含量的初始食品包含不超过1x10²CFU/g所述低细菌含量的初始食品的细菌水平；

2)向所述初始食品，特别是向所述低细菌含量的初始食品中以至少1.0x10⁵CFU/g的总量添加一种或多种稳定的乳酸菌，以获得在环境温度时稳定的食品，

其特征在于：

(i)所述一种或多种稳定的乳酸菌中的每一种选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus zymae)、罗西氏乳杆菌(Lactobacillus rossiae)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、相似乳杆菌(Lactobacillus similis)、费斯莫尔德乳杆菌(Lactobacillus versmoldensis)、酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)、黑氏乳杆菌(Lactobacillus hammesii)、那慕尔乳杆菌(Lactobacillus namurensis)、野田乳杆菌(Lactobacillus nodensis)和腊肠乳杆菌(Lactobacillus tucceti)的菌株；并且

(ii)当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述一种或多种稳定的乳酸菌中的每一种：

a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且

b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。

本发明还涉及一种或多种稳定的乳酸菌用于pH在3.4至4.6之间的初始食品，特别是低细菌含量的初始食品中接种的用途，其中

(i)所述稳定的乳酸菌选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株；并且

(ii)当以1x10⁶CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌：

a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且

b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。

初始食品

在本发明的方法的步骤1)中提供或在本发明的用途中提供pH在3.4至4.6之间的初始食品。

“食品”是指任何旨在供人类消费的产品。根据本发明(特别是所述方法的步骤2)，初始食品必须适合于用一种或多种稳定的乳酸菌接种。“初始食品”是指在添加一种或多种稳定的乳酸菌之前的食品，并且因此其不包含如本文定义的稳定的乳酸菌。初始食品必须与“在环境温度时稳定的食品”区别开，后者包含本文定义的稳定的乳酸菌。

在实施例中，所述初始食品是发酵食品。发酵是通过细菌发酵剂的作用，将碳水化合物转化为酸而进行的。“细菌发酵剂”定义为包含以下或由以下组成的组合物：一种或多种能够开始和进行基质发酵的细菌。在特定实施例中，所述初始食品是乙酸发酵食品，这意味着发酵是通过通过乙酸菌发酵剂的作用将碳水化合物转化为乙酸而进行的。在实施例中，所述初始食品是乳酸发酵食品，这意味着发酵是通过通过乳酸菌发酵剂的作用将碳水化合物转化为乳酸而进行的。表述“乳酸菌”(LAB)涉及食品级细菌，其产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。乳酸菌在本领域中是众所周知的，包括乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)和丙酸杆菌属(Propinibacterium)的菌株。

在实施例中，步骤1)的所述初始食品选自由以下组成的组：基于奶的产品、基于水果的产品(例如基于水果的饮料)、基于蔬菜的产品(例如基于蔬菜的饮料)、基于谷物的产品(例如基于谷物饮料)、基于稻的产品(例如基于稻的饮料)、基于坚果的产品(例如基于坚果的饮料)、基于大豆的产品及其任何混合物。通过“基于奶的产品”、“基于水果的产品或饮料”、“基于蔬菜的产品或饮料”、“基于谷物的产品或饮料”、“基于稻的产品或饮料”、“基于坚果的产品或饮料”和“基于大豆的产品”，这是指初始食品的主要成分分别是奶、水果、蔬菜、谷物、稻、坚果和大豆。在实施例中，奶、水果、蔬菜、谷物、稻、坚果和大豆是分别用作制造基于奶的产品、基于水果的产品或饮料、基于蔬菜的产品或饮料、基于谷物的产品或饮料、基于稻的产品或饮料、基于坚果的产品或饮料和基于大豆的产品(作为初始食品)的基质的唯一成分。术语“饮料”在本申请中定义为液体食品。

在实施例中，基于奶的产品(作为初始食品)是发酵奶制品或化学酸化乳制品。在实施例中，发酵奶制品选自由以下组成的组：发酵奶、酸奶、奶酪、酸性稀奶油、酪乳和发酵奶清。发酵奶制品在本领域中是众所周知的，并且是通过乳酸菌发酵剂(如本文定义)对奶基质(奶基质的pH为约6.5至7)的作用而制造。“奶基质”在本文中定义为任何哺乳动物来源的奶，包括但不限于牛奶、绵羊奶和山羊奶。所述奶可以处于天然状态、重构奶或脱脂奶。奶基质，特别是牛奶，通常事先经过处理，特别是通过标准化、添加添加剂[例如，糖、甜味剂和/或稳定剂]、均质化和/或热处理[例如，巴氏灭菌]。在特定实施例中，通过用选自下组的乳酸菌发酵剂发酵奶来获得发酵奶，该组由以下组成：包含嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌株的发酵剂、包含来自乳杆菌属的菌株的发酵剂和包含乳酸乳球菌菌株的发酵剂。在特定实施例中，通过用选自下组的乳酸菌发酵剂发酵奶来获得所述发酵奶，该组由以下组成：包含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)或由其组成的发酵剂、包含嗜热链球菌和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)或由其组成的发酵剂以及包含嗜热链球菌和发酵奶杆菌(Lactobacillus fermentum)或由其组成的发酵剂。在特定实施例中，所述发酵奶是酸奶。

在实施例中，基于水果的产品(作为初始食品)是基于水果的饮料。在特定实施例中，基于水果的产品是果汁或发酵果汁。

在实施例中，基于蔬菜的产品(作为初始食品)是基于蔬菜的饮料。在特定实施例中，基于蔬菜的产品是蔬菜汁或发酵蔬菜汁。

在实施例中，基于谷物的产品(作为初始食品)是基于谷物的饮料。在特定实施例中，基于谷物的产品是化学酸化谷物产品、发酵谷物产品、化学酸化谷物饮料或发酵谷物饮料。

在实施例中，基于稻的产品(作为初始食品)是基于稻的饮料。在特定实施例中，基于稻的产品是化学酸化稻产品、发酵稻产品、化学酸化稻饮料或发酵稻饮料。

在实施例中，基于坚果的产品是基于坚果的饮料。在特定实施例中，基于坚果的产品是化学酸化坚果产品、发酵坚果产品、化学酸化坚果饮料或发酵坚果饮料。在本文描述的任何基于坚果的产品的特定实施例中，食品是基于核桃的产品。

在实施例中，基于大豆的产品(作为初始食品)是基于大豆的饮料。在特定实施例中，基于大豆的产品是发酵豆奶产品。

在实施例中，术语“初始食品”还涵盖如本文定义的基于奶的产品、基于水果的产品或饮料、基于蔬菜的产品或饮料、基于谷物的产品或饮料、基于稻的产品或饮料、基于坚果的产品或饮料和基于大豆的产品的任何混合物，例如，比如但不限于基于奶的产品和基于谷物的饮料的混合物，或基于奶的产品和基于水果的饮料的混合物。

在实施例中，所述初始食品是pH在3.4至4.6之间的“低细菌含量”的初始食品，即是如本文定义的初始食品，其细菌水平不超过1x10²CFU/g所述低细菌含量初始食品。通过本文所用的“细菌水平”，这是指按cfu/g产品计算的细菌总量。cfu计数可以通过在MRS/M17/PCA琼脂上接种待测产品的一个或多个稀释液来测量[Atlas,2010Handbook ofMicrobiological Media[微生物培养基手册2010],第四版,第986,1231和1402页]。

任何低细菌含量的初始食品可以用于本发明方法的步骤1)中或本发明的用途中。根据本发明(特别是所述方法的步骤2)，低细菌含量的初始食品必须适合于用稳定的细菌接种。

在实施例中，初始食品自然具有不超过1x10²CFU/g食品的细菌水平。

在另一个实施例中，除了如本文定义的稳定的乳酸菌外，初始食品具有大于1x10²CFU/g食品的细菌水平。细菌，特别是乳酸菌的存在，可能是由于在初始食品的制造过程中使用这些微生物(特别是作为发酵剂)导致的，例如，当初始食品是由基质的发酵产生时(如以上所解释的)。

因此，在本发明的任选的实施例中，在接种稳定的LAB之前对初始食品进行处理，以获得低细菌含量的初始食品。通过“处理”，这是指使初始食品中所含细菌失活的任何处理(例如，其抑制或减少细菌生长或杀死细菌)，以便将细菌水平降低至不超过1x10²CFU/g低细菌含量的食品。处理手段是本领域众所周知的。在实施例中，使用选自由高压灭菌、辐照、超滤和热处理组成的组的手段处理初始食品。在特定实施例中，对初始食品进行热处理，以将细菌水平降低至不超过1x10²CFU/g低细菌含量的食品。

通过“热处理”，这是指使初始食品中所含细菌失活的基于温度的任何处理(例如，其抑制或减少细菌生长或杀死细菌)，以便将低细菌含量的食品的细菌水平降低至不超过1x10²CFU/g低细菌含量的食品。

因此，在实施例中，本发明涉及用于制造在环境温度时稳定的食品的方法，所述方法包括：

1)提供pH在3.4和4.6之间的初始食品；

1b)处理所述初始食品，以便获得不超过1x10²CFU/g[所得的低细菌含量的初始食品]的细菌水平，特别是通过热处理所述初始食品；并且

2)向所述低细菌含量的初始食品中以至少1.0x10⁵CFU/g的总量添加一种或多种稳定的乳酸菌，以获得在环境温度时稳定的食品，

其特征在于：

(i)所述一种或多种稳定的乳酸菌中的每一种选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株；并且

(ii)当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述一种或多种稳定的乳酸菌中的每一种：

a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且

b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。

在实施例中，本发明的方法在如本文定义的发酵奶，特别是如本文定义的酸奶中进行。因此，本发明涉及用于制造在环境温度时稳定的发酵奶，特别是酸奶的方法，所述方法包括

1a)通过奶基质的发酵产生pH在3.4至4.6之间的初始发酵奶，特别是初始酸奶；

1b)处理，特别是热处理所述初始发酵奶，特别是所述初始酸奶，以便获得低细菌含量的初始发酵奶，特别是低细菌含量的初始酸奶，其包含的细菌水平不超过1x10²CFU/g；并且

2)向所述低细菌含量的初始发酵奶中，特别是向所述低细菌含量的初始酸奶中以至少1.0x10⁵CFU/g的总量添加一种或多种稳定的乳酸菌菌株，以获得在环境温度时稳定的发酵奶，特别是酸奶，

其特征在于：

(i)一种或多种所述稳定的乳酸菌中的每一种选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株；并且

(ii)当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，一种或多种所述稳定的乳酸菌中的每一种：

a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且

b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。

初始的任选地低细菌含量的食品[特别是就其本身(步骤1)或在处理后(步骤1b)或在通过发酵和处理生产后(步骤1b)提供的]必须适合于达到本发明的目的，即，制造在环境温度时稳定的食品。

在实施例中，初始的任选地低细菌含量的食品的pH在3.4至4.6之间。在实施例中，初始的任选地低细菌含量的食品的pH在3.4至4.0之间。在实施例中，初始的任选地低细菌含量的食品的pH在4.0至4.6之间。在实施例中，初始的任选地低细菌含量的食品的pH在3.6至4.2之间。pH可以通过使用任何pH计来确定。

在实施例中，任选地与上段的任何实施例结合，所述初始的任选地低细菌含量的食品的糖含量在0％至13％之间。通过“糖含量”这是指初始的任选地低细菌含量的食品中糖(无论是最初包含在初始食品中的糖、添加到初始食品中的糖还是最初包含在初始食品中的糖和添加到初始食品中的糖的组合)的总含量。在实施例中，所述初始的任选地低细菌含量的食品的糖含量在4％至10％之间。在实施例中，所述初始的任选地低细菌含量的食品的糖含量在6％至9％之间。在特定含量中，所述初始的任选地低细菌含量的食品的蔗糖含量在0至8％之间。在实施例中，所述初始的任选地低细菌含量的食品的蔗糖含量在5％至8％之间。

向初始食品添加/接种一种或多种稳定的乳酸菌

本文定义的初始食品，特别是如本文定义的低细菌含量的初始食品，以至少1.0x10⁵CFU/g总量接种一种或多种稳定的乳酸菌(本发明的方法的步骤2或本发明的用途)。

在本发明的上下文中，“添加”与“接种”(以及“添加的”和“接种的”)互换使用，并且是指将一种或多种稳定的乳酸菌(如本文定义)与初始食品接触。通过“一种或多种”，这是指至少一种乳酸菌(LAB)。在实施例中，添加到食品中的LAB的数量选自由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10种。在实施例中，将1种稳定的LAB添加到食品中。在实施例中，将2种稳定的LAB添加到食品中。在实施例中，将3种稳定的LAB添加到食品中。在实施例中，将4种稳定的LAB添加到食品中。在实施例中，将5种稳定的LAB添加到食品中。

将一种或多种稳定的LAB以总量为至少1x10⁵cfu/g食品添加到初始食品中，特别是低细菌含量的初始食品中。当添加几种(即至少2种)稳定的LAB时，“总量”是指接种的稳定的LAB的每个单独量的总和(例如，以3x10⁵cfu/g的第一稳定的LAB和以7x10⁵cfu/g的第二稳定的LAB的添加导致1x10⁶cfu/g的总量)。在实施例中，以选自由至少5x10⁵CFU/g、至少1x10⁶CFU/g、至少5x10⁶CFU/g或至少1x10⁷CFU/g初始食品组成的组的总量将一种或多种稳定的LAB添加至初始食品，特别是低细菌含量的初始食品中。在实施例中，以选自由1x10⁵至1x10⁸cfu/g、1x10⁶至1x10⁸cfu/g和5x10⁶至1x10⁸cfu/g组成的组的总量范围将一种或多种稳定的LAB添加至初始食品，特别是低细菌含量的初始食品中。

可以以任何形式将一种或多种稳定的LAB接种到初始食品中，例如冷冻、干燥、冻干、液体或固体形式，以球粒或冷冻球粒形式，或以粉末或干粉形式。在实施例中，将一种或多种稳定的LAB以液体形式例如作为批量发酵剂[即，预先在生长培养基中繁殖的LAB培养物以获得所需的接种浓度]添加至初始食品。在实施例中，将一种或多种稳定的LAB以浓缩物例如冷冻的或干燥的浓缩物的形式直接添加到初始食品中。在实施例中，将一种或多种稳定的LAB以液体形式作为浓缩物(例如冷冻的或干燥的浓缩物)的稀释物[例如在水或盐溶液中]添加到食品中。表述“直接接种”是指将一种或多种稳定的LAB添加到初始食品中，而无需事先繁殖。直接接种要求一种或多种稳定的LAB的浓度足够高。因此，冷冻的或干燥的浓缩物中稳定的LAB的浓度范围是10⁸至10¹²cfu/g浓缩物，并且更优选至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²cfu/g浓缩物。

在实施例中，将所述一种或多种菌株无菌地添加到初始食品中。通过“无菌地”，这是指除了一种或多种稳定的乳酸菌外，没有其他微生物被添加到食品中，例如，通过使用Tetra FlexDosTM无菌内置接种系统。

稳定的乳酸菌(稳定的LAB)

添加到本发明要求保护的方法或本发明的用途中的初始食品中(步骤2)中的一种或多种稳定的乳酸菌(LAB)的特征在于以下2个特征：

(i)所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株。

在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌和那慕尔乳杆菌的菌株。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌和酸面团乳杆菌的菌株。

在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种植物乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种酸面团乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种罗西氏乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种丘状乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种相似乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种费斯莫尔德乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种酸鱼乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种黑氏乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种那慕尔乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种野田乳杆菌。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是属于物种腊肠乳杆菌。

为了避免疑问，本文描述的乳杆菌物种如文献中所定义，特别是在Salvetti等人2012Probiotics&Antimicro.Prot.[益生菌和抗微生物蛋白]4(4):217-226，和Cay等人2012Int.J.Syst.Evol.Microbiol.[国际系统和进化微生物学杂志]62:1140-1144中。

(ii)所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株中的每一种在37℃的温度(即在严格条件下)存储30天的热处理酸奶中保持成活力，并且不使其pH显著降低。

因此，在实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株：

a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且

b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。

在实施例中，所述测试酸奶的糖含量是0％至13％。在实施例中，所述测试酸奶的糖含量是4％至10％。在实施例中，所述测试酸奶的糖含量是6％至9％。在特定含量下，所述测试酸奶的蔗糖含量是0％至8％。在实施例中，所述测试酸奶的蔗糖含量是5％至8％。在实施例中，所述测试酸奶的糖含量是12％至13％，包括7％至9％的蔗糖含量。

在实施例中，特征(ii)如下所述用测定A进行测试：

-要测试的LAB的接种物如下准备：将10⁶cfu/ml的LAB培养物在10mL MRS/M17液体培养基中于37℃过夜培养；在4℃下2小时后，将培养物以4000rpm离心10分钟；将沉淀重悬于10mL无菌盐水中；再次重复离心/重悬步骤，得到接种物

-在将接种物在约1x10⁹CFU/mL标准化之后，将0.4mL接种物添加到40mL热处理酸奶中(2.8％蛋白质，3％脂肪，12.5％总糖(包括8％蔗糖)；pH 4.3)并且充分混合[热处理酸奶中最终稳定的LAB浓度是约1x10⁷CFU/g酸奶]；然后将管密封。

-将接种的酸奶在37℃下孵育30天。

-30天后，通过pH计(梅特勒·托莱多公司(Mettler Toledo)，SevenEasy)测定pH；然后将第30天的pH与添加LAB时的热处理酸奶的pH进行比较

-30天后，通过在MRS/M17琼脂上铺板确定CFU计数，如下：将1mL酸奶样品用无菌盐水连续稀释至10^-7；将MRS/M17琼脂(1.5％)融化并在水浴中在48℃保持；将1mL的10^-1至10^-7稀释液添加到皮氏培养皿中，并将25mL的MRS/M17琼脂倒入；将板在37℃下厌氧孵育2天以进行计数；然后将第30天的LAB量与添加到热处理酸奶中的LAB量进行比较。

在特征a)的实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后以至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g的量保持成活力。

在特征b)的实施例中，单独考虑或与上段实施例[特征a]组合考虑，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位。

在实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5.0x10³CFU/g、至少1.0x10⁴CFU/g、至少5.0x10⁴CFU/g、至少1.0x10⁵CFU/g、至少5.0x10⁵CFU/g或至少1.0x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在特定实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在特定实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1.0x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在特定实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在特定实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

任何满足如本文定义的特征(ii)(特别是当通过测试A评估时)的植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌菌株可以用于本发明的方法或本发明的用途中。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5.0x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、黑氏乳杆菌、相似乳杆菌、野田乳杆菌、腊肠乳杆菌和那慕尔乳杆菌的菌株，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、相似乳杆菌和那慕尔乳杆菌的菌株，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、相似乳杆菌和那慕尔乳杆菌的菌株，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌和酸面团乳杆菌的菌株，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，所述稳定的乳酸菌菌株是属于物种植物乳杆菌，并且，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，所述稳定的乳酸菌菌株(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，要添加至本发明方法的步骤2)中或用于本发明用途中的一种或多种稳定的LAB选自由以下组成的组：2017年4月26日保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株DSM32493，DSM32493菌株的变体，2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，DSM33120菌株的变体，2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，和DSM33121菌株的变体。

在实施例中，要添加至本发明方法的步骤2)中或用于本发明用途中的一种或多种稳定的LAB是2017年4月26日保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株DSM32493，或DSM32493菌株的变体。

在实施例中，要添加至本发明方法的步骤2)中或用于本发明用途中的一种或多种稳定的乳酸菌是2017年4月26日保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株DSM32493的变体，其中所述变体在ATP合酶α亚基基因中具有突变(例如，点突变、缺失、插入、...)(与DSM32493菌株相比)。ATP合酶操纵子的野生型序列是如在SEQ ID NO:1中所示的。本领域技术人员知道如何确定该操纵子是否发生突变，以及如何测量细菌的H⁺-ATP酶活性[参见例如，Jaichumjai等人,2010；Food Microbiology[食品微生物学]27(2010)741-748]。在实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌是DSM32493的变体，其中所述变体在ATP合酶操纵子的ATP合酶α亚基基因(在本文中被称为“ATP合酶α亚基基因”)中具有至少一个突变。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌是DSM32493的变体，其中如本文定义的DSM32493的所述变体的ATP合酶α亚基基因编码在位置169具有天冬氨酸残基的ATP合酶α亚基蛋白。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌是DSM32493的变体，其中所述变体在SEQ ID NO:2中定义的ATP合酶操纵子的ATP合酶α亚基基因中具有至少一个突变。在特定实施例中，与关于SEQ IDNO:2的先前实施例组合或不组合，所述一种或多种稳定的乳酸菌是如本文定义的DSM32493的变体，其中所述变体在ATP合酶α亚基基因的位置506处具有G至A的突变(与DSM32493菌株相比)。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌是如本文定义的DSM32493的变体，其中所述变体的ATP合酶α亚基基因是如SEQ ID NO:4定义(其中，位置505-507处的密码子GGT改变为GAT)。在特定实施例中，要添加到本发明方法的步骤2)中的一种或多种稳定的乳酸菌是DSM32493的变体，其中如本文定义的DSM32493的所述变体的ATP合酶α亚基基因编码如SEQ ID NO:5中定义的ATP合酶α亚基蛋白。

在实施例中，要添加至本发明方法的步骤2)中或用于本发明用途中的一种或多种稳定的LAB是2019年5月22日保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株DSM33120，或DSM33120菌株的变体。

在实施例中，要添加至本发明方法的步骤2)中或用于本发明用途中的一种或多种稳定的LAB是2019年5月22日保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株DSM33121，或DSM33121菌株的变体。

植物乳杆菌菌株

本发明还涉及选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，DSM33120菌株的如本文定义的变体，2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，和DSM33121菌株的如本文定义的变体。

在实施例中，本发明涉及选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，或DSM33120菌株的如本文定义的变体。在实施例中，本发明涉及选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，或DSM33121菌株的如本文定义的变体。

细菌组合物

本发明还涉及细菌组合物，所述细菌组合物包含以下或由以下组成：选自由以下组成的组的植物乳杆菌菌株：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，DSM33120菌株的如本文定义的变体，2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，和DSM33121菌株的如本文定义的变体。

在特定实施例中，所述细菌组合物是纯培养物，即包含以下或由以下组成：本发明的单一植物乳杆菌菌株。在另一个实施例中，所述细菌组合物是混合培养物，即包含以下或由以下组成：本发明的植物乳杆菌菌株和至少一种其他细菌菌株，特别是一种其他乳酸菌。

在实施例中，所述细菌组合物(无论是作为如上定义的纯培养物或混合培养物)还包含食物可接受的成分。

在特定实施例中，如上文所定义的纯培养物或混合培养物形式的细菌组合物为冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，为球粒或冷冻球粒的形式，或为粉末或干粉形式。在特定实施例中，本发明的细菌组合物是以冷冻形式或处于球粒或冷冻球粒的形式，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。在另一个实施例中，如本文定义的细菌组合物是在粉末形式下，如干燥或冷冻干燥的粉末，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。

在特定实施例中，本发明的细菌组合物(无论是作为如上所定义的纯培养物或混合培养物，并且无论以何种形式(冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，处于球粒或冷冻球粒的形式，或以粉末或干粉形式))包含本发明的植物乳杆菌菌株，其浓度范围包含在10⁵至10¹²cfu(菌落形成单位)/克细菌组合物内。在特定实施例中，在本发明的细菌组合物内的植物乳杆菌菌株的浓度范围为10⁷至10¹²cfu/克细菌组合物，并且特别是至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰或至少10¹¹CFU/g细菌组合物。在特定实施例中，当处于冷冻或干燥浓缩物的形式时，在细菌组合物内的本发明的植物乳杆菌菌株(作为纯培养物或作为混合培养物)的浓度范围为10⁸至10¹²cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物，并且更优选至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物。

植物乳杆菌菌株的变体

本文针对保藏的植物乳杆菌菌株的变体详述的特征适用于在本发明的方法内添加的植物乳杆菌菌株，适用于就其本身的植物乳杆菌菌株以及作为细菌组合物的一部分的植物乳杆菌菌株。

DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的变体在本文定义为分别与DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株相比，呈现至少一个突变(如在其基因组中至少一个核苷酸的添加、缺失、插入和/或取代)的植物乳杆菌菌株。在特定实施例中，所述变体的基因组序列分别与DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的基因组序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.92％、至少99.94％、至少99.96％、至少99.98％、或至少99.99％的同一性。这种变体可以是例如：

-在选择培养基中孵育后从DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株自发获得的天然变体。因此，天然变体是在没有任何遗传操作，而仅仅通过在适当的培养基中所述菌株的自发突变以及菌株的选择获得的；用于选择DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的特定突变体的方案的实例公开于实例5中；或者

-其基因组中包含至少一个突变的变体，所述突变是通过基因工程诱导的，例如通过定向诱变或随机诱变。可以用UV辐射或诱变化合物(如亚硝酸、甲磺酸乙酯、N甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、吖啶橙、原黄素)进行随机诱变。

在实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的所述变体(如本文定义)(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x.10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位、至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的所述变体(如本文定义)(例如通过应用测定A)：

a)以选自下组的量保持成活力，该组由以下组成：至少5x10³CFU/g、至少1x10⁴CFU/g、至少5x10⁴CFU/g、至少1x10⁵CFU/g、至少5x10⁵CFU/g或至少1x10⁶CFU/g；并且

b)使所述测试酸奶的pH降低至多0.5个单位、至多0.4个单位或至多0.3个单位，

这是在所述测试酸奶于37℃的温度存储30天后。

在实施例中，DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的所述变体(如本文定义)分别保持与DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株至少相同的活力和至多相同的pH降低(当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，例如通过应用测定A)，即DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的所述变体：

a)分别保留与DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的活力保留相同的活力，或保留比DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的活力保留更高的活力(以cfu/g计算)；并且

b)分别使测试酸奶的pH降低与DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的pH降低相同，或分别使pH降低小于DSM32493、DSM33120或DSM33121菌株的pH降低(以pH单位计算)。

在环境温度时稳定的食品

所述方法的目的是制造在环境温度时稳定的食品。当涉及食品时，表述“在环境温度时稳定”是指含有如本文定义的一种或多种稳定的乳酸菌且当存储在环境温度时时其稳定的乳酸菌的量和pH均未显著降低的食品。

因此，通过本发明的方法制造的食品当于25℃的温度存储该食品180天后被认为是稳定的：

-其pH降低不超过0.7个单位；并且

-其所含的稳定的乳酸菌的量的减少不超过3log和/或所述量是至少1x10³CFU/g。

因此，从将如本文定义的一种或多种稳定的乳酸菌添加到初始食品中的那一天起(第0天)，所述食品在25℃下存储180天。在实施例中，食品以密封形式存储(即，在密闭的无菌容器中)。

180天后，通过pH计(梅特勒·托莱多公司，SevenEasy)测定pH并与第0天食品的pH进行比较。因此，在实施例中，食品在180天时的pH降低不超过0.6个单位、不超过0.5个单位或不超过0.4个单位(与在第0天的pH相比)。

180天后，如本文详述的测定A中所述确定CFU计数，并与第0天添加的如本文定义的一种或多种稳定的乳酸菌的量进行比较。因此，在实施例中，无论在步骤2)中的添加水平如何(其是至少1x10⁵CFU)，其包含的一种或多种稳定的乳酸菌的量是至少1x10³CFU/g(与在第0天添加的量相比)。在实施例中，其包含的一种或多种稳定的乳酸菌的量的减少不超过3log(与在第0天添加的量相比)。在实施例中，其包含的一种或多种稳定的乳酸菌的量的减少不超过2log(与在第0天添加的量相比)。在实施例中，其包含的一种或多种稳定的乳酸菌的量的减少不超过3log，并且所述量是至少1x10³CFU/g(与在第0天添加的量相比)。在实施例中，其包含的一种或多种稳定的乳酸菌的量的减少不超过2log，并且所述量是至少1x10³CFU/g(与在第0天添加的量相比)。

本发明还涉及在环境温度时稳定的食品，其如本文定义或如通过本发明的方法获得，并且包含如本文定义的一种或多种稳定的乳酸菌。

在实施例中，在环境温度时稳定的食品(其如本文定义或如通过本发明的方法获得)包含选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，DSM33120菌株的如本文定义的变体，2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，和DSM33121菌株的如本文定义的变体。

在实施例中，在环境温度时稳定的食品(其如本文定义或如通过本发明的方法获得)包含选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33120，或DSM33120菌株的如本文定义的变体。在实施例中，在环境温度时稳定的食品(其如本文定义或如通过本发明的方法获得)包含选自下组的植物乳杆菌菌株，该组由以下组成：2019年5月22日保藏在DSMZ的菌株DSM33121，或DSM33121菌株的如本文定义的变体。

在实施例中，在本发明的环境温度时稳定的食品(这样或通过本发明的方法获得的)具有不超过0.7个单位的降低的pH，并且具有其所包含的稳定的乳酸菌的量。于25℃的温度存储180天后，其降幅不超过3log和/或至少1x10³CFU/g。

在实施例中，本发明的在环境温度时稳定的食品(就其本身或通过本发明的方法获得)选自由以下组成的组：基于奶的食品、基于水果的食品(例如基于水果的食物饮料)、基于蔬菜的食品(例如基于蔬菜的食物饮料)、基于谷物的食品(例如基于谷物食物饮料)、基于稻的食品(例如基于稻的食物饮料)、基于坚果的食品(例如基于坚果的食物饮料)、基于大豆的食品及其任何混合物。在实施例中，在环境温度时稳定的基于奶的食品食品是发酵奶制品或化学酸化乳制品。在实施例中，发酵奶制品选自由以下组成的组：发酵奶、酸奶、奶酪、酸性稀奶油、酪乳和发酵奶清。在实施例中，基于奶的食品是发酵奶。

在实施例中，本发明的在环境温度时稳定的食品(特别是如本文定义的发酵乳食品)包含选自下组的一种或多种所述稳定的乳酸菌，该组由以下组成：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌的菌株，其中当以1x10⁷CFU/g的量添加到pH为4.3的预先于75℃热处理25秒的测试酸奶中时，一种或多种所述稳定的乳酸菌中的每一种：a)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，以至少5.0x10³CFU/g的量保持成活力；并且b)于37℃的温度存储所述测试酸奶30天后，使所述测试酸奶的pH降低至多0.6个单位。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌和那慕尔乳杆菌的菌株。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株选自由以下组成的组：物种植物乳杆菌和酸面团乳杆菌的菌株。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是物种植物乳杆菌。在特定实施例中，所述一种或多种稳定的乳酸菌菌株是2017年4月26日保藏在DSMZ的DSM32493菌株或其如本文定义的任何变体。

针对本发明的制造方法详述的定义和特定实施例类似地适用于本发明的在环境温度时稳定的食品的上下文中，特别是但不限于，乳酸菌物种、乳酸菌数量、要添加的LAB于25℃的温度存储180天后的pH降低特征、要添加的LAB于25℃的温度存储180天后的LAB活力保留特征、该pH降低和LAB活力保留特征的任何组合、食品类型(例如饮料)和食品性质(例如基于奶的食品、基于水果的食品、基于蔬菜的食品、基于谷物的食品、基于稻的食品、基于坚果的食品、基于大豆的食品及其任何混合物)。

保藏和专业解决方案

以下保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

-2017年4月26日由杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition BiosciencesApS)在DSMZ[德国微生物及细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，德国不伦瑞克市，英豪丰大街7B号，邮编D-38124(Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig-Germany)]保藏在登录号DSM32493下的植物乳杆菌菌株DGCC12411；

-2019年5月22日由杜邦营养生物科学公司在DSMZ保藏在登录号DSM33120下的植物乳杆菌菌株DGCC12119；并且

-2019年5月22日由杜邦营养生物科学公司在DSMZ保藏在登录号DSM33121下的植物乳杆菌菌株DGCC12480。

要求生物材料只能通过向请求者指定的专家发放的样品来提供。就寻求欧洲专利保护的那些指定而言，在提及授予欧洲专利的公告之前或在所述申请被驳回或撤回、或被视为撤回之日之前可获得保藏的微生物的样品，且此样品的发放仅限于由请求获得所述样品的请求人指定的专家，且视情况需征得i)申请人和/或ii)欧洲专利局同意(欧洲专利公约细则第32条)。

序列

SEQ ID NO:1:植物乳杆菌ATP合酶操纵子

SEQ ID NO:2:DSM32493菌株的ATP合酶α亚基基因

SEQ ID NO:3:DSM32493菌株的ATP合酶α亚基蛋白

SEQ ID NO:4:DSM32493菌株的变体的ATP合酶α亚基基因

SEQ ID NO:5:DSM32493菌株的变体的ATP合酶α亚基蛋白

现在，通过非限制性实例的方式来描述本发明的各种优选特征和实施例。

实例

实例1：筛选稳定的乳酸菌(物种)

如下所述使用测定A选择稳定的乳酸菌：

接种物制剂

每个要测试的LAB如下准备：将10⁶cfu/ml的LAB培养物在10mL MRS/M17液体培养基中于37℃过夜培养；在4℃下2小时后，将培养物以4000rpm离心10分钟；将沉淀重悬于10mL无菌盐水中；再次重复离心/重悬步骤。将接种物以约1x10⁹CFU/ml的量标准化。测试了表1中列出的乳杆菌物种。

测试酸奶

将具有以下特征的酸奶-2.8％的蛋白质，3％的脂肪，12.5％的总糖(包括8％的蔗糖)；pH 4.3-进行热处理，以将细菌水平降低至小于1x10²CFU/g。

添加/接种

将0.4mL准备好的接种物添加到40mL的热处理酸奶中(在管中)并充分混合。然后将管密封。添加到热处理酸奶中的稳定的LAB的浓度(第0天)是约1x10⁷CFU/g酸奶。

存储

然后将密封的管在37℃下保存30天。这些条件被认为代表在环境温度时的加速存储模型。

在第30天，确定pH和稳定的LAB的量(细胞计数)，并计算分别与第0天的pH和添加的稳定的LAB的量的差。

pH和细胞计数测量

通过pH计(梅特勒·托莱多公司，SevenEasy)测定pH。

通过在MRS/M17琼脂上铺板确定CFU计数，如下：将1mL酸奶样品(第30天)用无菌盐水连续稀释至10^-7；将MRS/M17琼脂(1.5％)融化并在水浴中在48℃保持；将1mL的10^-1至10^-7稀释液添加到皮氏培养皿中，并将25mL的MRS/M17琼脂倒入；将板在37℃下厌氧孵育2天以进行计数。

选择

选择稳定的LAB时考虑了以下两个特征：

-至少5x10³cfu(3.69log₁₀ cfu)的LAB的量；并且

-pH降低至多0.6个单位(即，pH是至少3.7)。

结果

通过测定A测试和选择了代表33个物种的80个菌株。在37℃下存储30天后酸奶中的菌株水平(cfu)和酸奶的pH总结在表1中，并且在图1(log cfu)和图2(pH)中显示。

表1：通过使用乳杆菌属的33个物种的菌株通过测定A获得的在37℃下存储30天后的log cfu和pH；STD：标准偏差；n.a.：不适用

如表1和图1和图2所示，11个乳杆菌属物种的菌株均满足针对选择所定义的两个参数，即在37℃下存储30天后，活力为至少5x10³cfu(3.69log₁₀ cfu)并且pH降低至多0.6个单位(即pH为至少3.7)：植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、罗西氏乳杆菌、丘状乳杆菌、相似乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌、酸鱼乳杆菌、黑氏乳杆菌、那慕尔乳杆菌、野田乳杆菌和腊肠乳杆菌。

实例2：筛选稳定的乳酸菌(菌株)

通过测定A对这11个乳杆菌属物种所涵盖的菌株进行了更深入的研究。在37℃存储30天后，根据菌株活力和酸奶的pH将菌株分为4类(表2)。

表2：关于菌株活力和降低pH的能力对菌株的分类

表3和图3总结了通过测定A对20个菌株获得的结果。

表3：在37℃下存储30天后，使用稳定的乳酸菌获得的log CFU和pH(*：DSM32493v是DSM32493的变体，与DSM32493相比，其ATP合酶α亚基基因的位置506处的G突变为A，并且产生如SEQ ID NO:5定义的ATP合酶α亚基蛋白)

因此，将这20个菌株分类如下：

-类别1中3个菌株(存储后特别高的活力和特别低的pH降低)

-类别2中8个菌株(存储后很高的活力和很低的pH降低)

-类别3中8个菌株(存储后很高的活力和低的pH降低，或者高的活力和很低的pH降低)

-类别4中1个菌株(存储后高的活力和低的pH降低)。

这些结果表明，本文所述的测定A不仅能够选择在37℃下存储30天后在酸奶中保持高活力的菌株，而且能够选择在存储后稍微降低该酸奶的pH的菌株。这20个菌株是稳定的乳酸菌，适于制造在环境温度时稳定的食品。

实例3：用植物乳杆菌DSM32493制造在环境温度时稳定的食品

将具有以下特征的酸奶-2.8％的蛋白质，3％的脂肪，8％的蔗糖；pH 4.3-进行热处理，以将细菌水平降低至小于1x10²CFU/g。以1x10⁷cfu/ml酸奶的水平接种DSM32493菌株(根据实例2分类在类别3中)。

将接种的酸奶混合，密封并在25℃下存储180天。这些条件代表将食品存储在冰箱之外或冷藏室之外时的平均环境存储条件。

如上文测定A所述，在第90、120、150和180天测定pH和稳定的LAB的量(细胞计数)。随时间变化的菌株活力和pH分别在图4A和图4B中表示。

在25℃下180天后，DSM32493菌株的量是4.8log10 CFU，即高于1x10⁴cfu/g产品。这表示细菌的量的减少小于3log，证实了DSM32493在环境温度时存储6个月后可以保持高活力。有趣的是，最大的量减少是在150天时获得的，并且在第150天和第180天之间稍微增加。

在25℃下180天后，产品的pH是3.67，即表示pH降低小于0.7个单位。有趣的是，最大的pH下降在90天时达到，并且在第90天到第180天之间稳定。

这些数据证实DSM32493菌株是合适的乳酸菌，用于制造在环境温度时稳定的食品。这也更普遍地证实，以下乳酸菌是合适的稳定乳酸菌以制造在环境温度时稳定的食品：当通过测定A选择时，所述乳酸菌能够维持5x10³cfu/g的活力连同pH降低至多0.5或者维持1x10⁴cfu/g的活力连同pH降低至多0.6(即，分类在类别3中)

实例4：使用植物乳杆菌DSM32493的变体(DSM32493v)制造在环境温度时稳定的食品

将具有以下特征的酸奶-2.8％的蛋白质，3％的脂肪，8％的蔗糖；pH 4.3-进行热处理，以将细菌水平降低至小于1x10²CFU/g。以1x10⁷cfu/ml酸奶的水平接种DSM32493菌株的变体DSM32493v(根据实例2分类在类别1中)。将接种的酸奶混合，密封并在25℃下存储180天。

如上文测定A所述，在第90、120、150和180天测定pH和稳定的LAB的量(细胞计数)。随时间变化的菌株活力和pH分别在图5A和图5B中表示。

在25℃下180天后，DSM32493v菌株的量是5.3log10 CFU，即高于1x10⁵cfu/g产品。这表示细菌的量的减少小于2log，证实了DSM32493v在环境温度时存储6个月后可以保持很高活力。

在25℃下180天后，产品的pH是3.77，即表示pH降低小于0.6个单位。有趣的是，最大的pH下降在90天时达到，并且在第90天到第180天之间稳定。

这些数据证实DSM32493v菌株是合适的乳酸菌，用于制造在环境温度时稳定的食品。这也更普遍地证实，以下乳酸菌是合适的稳定乳酸菌以制造在环境温度时稳定的食品：当通过测定A选择时，所述乳酸菌能够维持1x10⁵cfu/g的活力连同pH降低至多0.3(即，分类在类别1中)。

总而言之，这些数据表明，根据本文所述的测定A选择的菌株被证实适合于制造在环境温度时稳定的食品。

实例5：另外的稳定的植物乳杆菌菌株的鉴定

杜邦丹尼斯科菌种库(Dupont Danisco collection)的另外的植物乳杆菌菌株通过测定A进行测试，并且它们的活力和酸奶的pH在37℃下存储30天后测定。2个植物乳杆菌菌株的结果在表4中描述。

菌株	log CFU	pH	分类
				植物乳杆菌DSM33120	5.4	4.11	1
植物乳杆菌DSM33121	5.7	4.08	1

表4：使用稳定的植物乳杆菌菌株在37℃存储30天后获得的log CFU和pH

鉴定的两个植物乳杆菌菌株(DSM33120和DSM33121)在存储后(当通过测定A进行测试时)显示出特别高的活力和特别低的pH降低，并被分类为类别1。这2个新菌株是稳定的乳酸菌，适于制造在环境温度时稳定的食品。

这些结果证实，本文所述的测定A不仅能够选择在37℃下存储30天后在酸奶中保持高活力的菌株，而且能够选择在存储后稍微降低该酸奶的pH的菌株。

实例6：用植物乳杆菌DSM33120或DSM33121菌株制造在环境温度时稳定的食品

将具有以下特征的酸奶-2.8％的蛋白质，3％的脂肪，8％的蔗糖；pH 4.3-进行热处理，以将细菌水平降低至小于1x10²CFU/g。以1x10⁷cfu/ml酸奶的水平接种DSM33120或DSM33121菌株(根据实例5分类在类别1中)。

将接种的酸奶混合，密封并在25℃下存储180天。这些条件代表将食品存储在冰箱之外或冷藏室之外时的平均环境存储条件。如上文测定A所述，在第90、120、150和180天测定pH和稳定的LAB的量(细胞计数)。

针对DSM33120菌株的随时间变化的菌株活力和pH分别在图6A和图6B中表示。在25℃下180天后，DSM33120菌株的量是5.96log10CFU，即高于9x10⁵cfu/g产品。这表示细菌的量减少约1log，证实了DSM33120在环境温度时存储6个月后可以保持很高活力。在25℃下180天后，产品的pH是3.75，即表示pH降低小于0.5个单位。

针对DSM33121菌株的随时间变化的菌株活力和pH分别在图7A和图7B中表示。在25℃下180天后，DSM33121菌株的量是6.35log10CFU，即高于2x10⁶cfu/g产品。这表示细菌的量的减少小于0.7log，证实了DSM333121在环境温度时存储6个月后可以保持很高活力。在25℃下180天后，产品的pH是3.87，即表示pH降低小于0.4个单位。

这些数据证实，DSM33120和DSM33121菌株是合适的乳酸菌以制造在环境温度时稳定的食品。这也更普遍地证实，以下乳酸菌是合适的稳定乳酸菌以制造在环境温度时稳定的食品：当通过测定A选择时，所述乳酸菌能够维持1x10⁵cfu/g的活力连同pH降低至多0.3(即，分类在类别1中)。

PCT/RO/134表