一种高效清除细菌生物被膜的方法
阅读说明：本技术 一种高效清除细菌生物被膜的方法 (Method for efficiently removing bacterial biofilm ) 是由 赵勇 童金蓉 黄振华 赵晟 张昭寰 韩乔 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效清除细菌生物被膜的方法,属于微生物领域。该方法采用二槽隔膜电解水装置制得酸性电解水,用其迅速处理生物被膜不低于5min,再用含0.5g/100mL NaS-2O-3的PBS缓冲液中和不低于5min,其中生物被膜为预形成、包含有被膜菌且经无菌磷酸缓冲溶液PBS洗涤去除未附着菌的生物被膜。本发明利用酸性电解水具有低pH值、高氧化还原电位和一定的有效氯等特性以达到破坏生物被膜和清除被膜菌的双重功效,高效且安全。(The invention discloses a method for efficiently removing bacterial biofilm, belonging to the field of microorganisms. The method adopts a two-tank diaphragm water electrolysis device to prepare acidic electrolyzed water, the acidic electrolyzed water is used for rapidly treating the biofilm for not less than 5min, and then 0.5g/100mL NaS is contained 2 O 3 And (4) neutralizing with PBS buffer solution for not less than 5min, wherein the biofilm is pre-formed and contains enveloped bacteria, and washing with sterile phosphate buffer solution PBS to remove the biofilm of non-attached bacteria. The invention utilizes the characteristics of low pH value, high oxidation-reduction potential, certain available chlorine and the like of the acidic electrolyzed water to achieve the dual effects of destroying the biofilm and removing the tunica mucosa bacteria, and is efficient and safe.)
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种高效清除细菌生物被膜的方法。
背景技术
食源性病原菌是引起食源性疾病的首要原因。在食品加工环境中，引起食品污染机会较多的大肠杆菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌等常见的食源性致病菌，它们在一定的条件下黏附在食品、加工接触面及非食品加工接触面(如墙壁、下水道、死角等地方)后形成生物被膜。生物被膜是指细菌附着于接触物体表面分泌多糖、蛋白质等多聚物，并将自身包裹其中的膜状物，绝大多数的细菌都是以生物被膜的形式附着在自然环境中有生命和无生命的物体表面的方式而存在，这种生活方式可以帮助其抵抗环境中各种不利因素如过酸或过碱的环境。但是，被膜菌对消毒剂的抵抗力是浮游细菌的数百倍甚至上千倍，由于其难以去除的特性，即使在食品加工中经过严格的清洗消毒工序，生物被膜还有可能逗留在食品接触表面并危害食品安全。据估计，约65％人类细菌性感染是由生物被膜引起的，在食品工业中形成的生物被膜是引起食源性疾病的罪魁祸首。
胞外多糖在形成生物被膜与抵抗外界压力中起重要作用，其可以阻止抗生素、消毒剂等接触包裹于被膜内的细菌从而起到屏蔽作用，消弱它们对被膜菌的杀伤效应，不仅使得细菌生物被膜对外界压力的抗性增加，并且能够保护生物被膜结构的完整性。因此控制食品中各种致病菌的污染，特别是通过破坏胞外多糖来防止其形成生物被膜交叉污染食品，是控制食源性疾病发生的重要内容。常见的控制生物被膜方法有高压喷射处理、亚硝酸、过氧化氢和次氯酸等，这些方法对生物被膜有一定的破坏作用，二氧化氯和柠檬酸/亚甲基蓝/对羟基苯甲酸能有效杀灭包括被膜菌，但这些方法不同时具备破坏生物被膜胞外多糖和清除被膜菌的双重作用。酸性电解水被视为一种环境友好型的杀菌剂，具有低pH值、高氧化还原电位和一定的有效氯等特点，其主要通过干扰膜的平衡使微生物的细胞膜电位发生改变，导致细胞通透性增强、细菌肿胀及细胞代谢酶的破坏，胞内物质溢出、溶解，从而达到杀灭微生物的作用。酸性电解水已广泛应用于医疗、食品加工、环境卫生等行业的杀菌消毒，具有杀菌力强、谱广、迅速等特点，但酸性电解水对食源性致病菌生物被膜的清除作用少见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效清除细菌生物被膜的方法，同时具备破坏细菌尤其是食源性致病菌生物被膜胞外多糖和清除被膜菌的双重作用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种高效清除细菌生物被膜的方法，先用酸性电解水处理生物被膜不低于5min，再用含0.5g/100mL NaS2O3的PBS缓冲液中和不低于5min；所述生物被膜为预形成、包含有被膜菌且经无菌磷酸缓冲溶液PBS洗涤已去除未附着菌的生物被膜。
优选地，所述酸性电解水由二槽隔膜电解水装置制得。
优选地，所述细菌选自大肠杆菌、副溶血性弧菌或单增李斯特菌。
更优选地，所述细菌选自大肠杆菌ATCC 25404、副溶血性弧菌S36或单增李斯特菌WaX12。
优选地，所述酸性电解水迅速处理生物被膜5min。
优选地，所述PBS缓冲液中和5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：酸性电解水具有低pH值、高氧化还原电位和一定的有效氯等特性，是一种环保、廉价、易获取的生化制剂，通过其清除细菌生物被膜，具有在短时间内破坏生物被膜和清除被膜菌的双重功效。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1为扫描电镜观察大肠杆菌(A)、副溶血性弧菌(B)和单增李斯特菌(C)生物被膜在未处理(a)、用无菌水处理(b)和酸性电解水处理(c)后的变化。
图2为酸性电解水对大肠杆菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌胞外多糖的影响。
具体实施方式
下面通过具体实例和附图，对本发明的技术方案做进一步的具体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
以下通过酸性电解水分别清除大肠杆菌ATCC 25404、副溶血性弧菌S36和单增李斯特菌WaX12的生物被膜为例，步骤如下：
(1)生物被膜的形成：大肠杆菌ATCC 25404、副溶血性弧菌S36和单增李斯特菌WaX12分别在LB、TCBS和PALCAM培养基上划线，37℃静置过夜培养。挑取单菌落至5mL液体培养基于37℃，180r/min震荡培养7-8h至OD600nm＝0.6左右。菌悬液与培养基按照体积比1：99(将10μL菌悬液接种于990μL培养基)，以1mL/孔加入到24孔细胞培养板中培养48h形成生物被膜。
(2)酸性电解水的制备及对生物被膜的处理：采用二槽隔膜电解水装置，通过调解电压、电流、电解水时间、电解液质量浓度等参数制得酸性电解水。由于所得酸性电解水中有效氯易损失，制备后迅速处理生物被膜。将已形成的生物被膜经无菌磷酸缓冲溶液PBS洗涤3次以去除未附着的细胞；分别用无菌水和酸性电解水处理5min，再用含0.5g/100mLNaS2O3的PBS缓冲液中和5min。
性能测试
(1)扫描电镜观察生物被膜
处理后的生物被膜用4％戊二醛溶液固定2h。固定结束后，分别用浓度为30％、50％、70％、90％、100％无水乙醇进行梯度脱水(30％、50％、70％、90％无水乙醇依次脱水一次，每次10min，100％无水乙醇脱水2次)，于室温下过夜干燥，在扫描电镜下观察。
(2)生物被膜活菌量的测定
处理后的生物被膜在无菌状态下用无菌棉球擦拭培养孔数次，将棉球转入装有10mL 0.85％NaCl溶液试管中，将试管放入超声仪中，50Hz超声15min，使棉球上的菌团分散于溶液中。用0.85％NaCl溶液进行梯度稀释后，在相应的平板上37℃培养24h后计数，结果以Log CFU/mL表示，活菌清除率(％)＝(未处理的活菌数-处理后的活菌数)/未处理的活菌数×100。
(3)MTT法测定生物被膜内细胞活性
处理后的生物被膜加入1mL新鲜液体培养基和100μL预先配制的终浓度为5mg/mLMTT(四甲基偶氮唑盐)染液，于37℃避光温育1h，然后在通风橱内加入1mL二甲基亚砜溶解沉淀30min，最后用酶标仪检测OD570nm的光吸收值，细胞活性减少率＝(OD570nm(未处理)-OD570nm(处理后))/OD570nm(未处理)。
(4)残液中活菌数的测定
将处理后的残液收集，再用0.85％NaCl溶液进行梯度稀释进行平板计数，结果以Log CFU/mL表示。
(5)胞外多糖的测定
生物被膜培养结束后，首先用酶标仪测定菌液OD595nm的光吸收值。然后小心弃去孔中的培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤3次，以除去尚未形成生物被膜的浮游菌体。加入1mL0.01M的氯化钾溶液重悬5min，然后每个样品孔超声5s，间隙5s，循环5次。超声结束后，将菌液转移至1.5mL无菌离心管内，于4℃条件下，转速为4000g/min，离心20min。随后用直径0.22μm的滤膜过滤上清液，以除去杂质。胞外多糖的测定：吸取100μL滤液于1.5mL无菌离心管内，加入200μL 98％的浓硫酸，室温静置30min。随后加入25μL 6％的苯酚溶液，置于90℃金属浴中，温育5min。移取200μL样品于96孔微孔板内，最后用酶标仪检测OD490nm的光吸收值，计算比值OD570nm/OD595nm即为样品多糖相对含量。
数据结果均以x±s表示，采用SPSS17.0软件对获得的数据进行分析。
结果分析
(1)酸性电解水对生物被膜形态的影响
运用扫描电镜观察细菌生物被膜在处理前后的变化，结果表明酸性电解水对大肠杆菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌生物被膜有一定的清除作用。图1(A-a，B-a，C-a)表示大肠杆菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌的生物被膜形态结构，均由胞外聚合物高度有序地包裹被膜菌，这些被膜菌呈网络状集聚相连。但是经过酸性电解水处理后(如图1A-c，B-c，C-c所示)，生物被膜菌明显减少，生物被膜形态结构遭到破坏，说明酸性电解水对生物被膜清除效果显著。然而，经过无菌水处理后(如图1A-b，B-b，C-b所示)，生物被膜的形态结构没有明显的变化，并且被膜菌仍包裹于胞外聚合物之中。
(2)酸性电解水对被膜菌的影响
经过酸性电解水处理后，三种食源性致病菌生物被膜中活菌数和细胞活性均显著降低(表1为酸性电解水和无菌水处理后对生物被膜内活菌清除率、细胞活性减少率及处理后残液内的活菌数)，而无菌水处理后并没有显著的影响。大肠杆菌生物被膜在经过酸性电解水处理后活菌数减少了66.65％，细胞活性降低了81.15％；副溶血性弧菌在经过酸性电解水处理后活菌数减少了51.69％，细胞活性降低了77.41％；单增李斯特菌在经过酸性电解水处理后活菌数减少了81.52％，细胞活性分别降低了89.28％。
此外，食源性致病菌生物被膜在经过酸性电解水处理之后，残液内活菌数明显低于检测值；而无菌水处理后，残液中仍存在大量活菌。对比于无菌水处理，酸性电解水处理后的残液不会对环境造成二次污染，可作为一种绿色安全的生物被膜清除方法。
表1
(3)酸性电解水对胞外多糖的影响
经过酸性电解水处理后，三种食源性致病菌的胞外多糖显著降低，大肠杆菌胞外多糖的含量(OD490nm/OD595nm)从2.1到1.4，降低了33.33％，副溶血性弧菌从2.9到1.7，降低了41.37％，以及单增李斯特菌从2.6到1.22，降低了53.07％，而经过无菌水处理后，三种食源性致病菌胞外多糖含量并没有显著的减少(如图2所示)。由此证明，酸性电解水不仅能够清除被膜菌，而且还可以降低胞外多糖的含量。
经过酸性电解水处理后，细菌生物被膜结构遭到破坏，被膜态的活菌数和细胞活性显著降低，处理后的残液内活菌数低于检测值，且其胞外多糖的含量也明显减少，从而达到了高效清除细菌生物被膜的效果证明酸性电解水可用于清除食源性致病菌的生物被膜和被膜菌。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
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