一种Zn2+离子激活型荧光探针
阅读说明：本技术 一种Zn2+离子激活型荧光探针 (Zn2+Ion-activated fluorescent probe ) 是由 赵梦 李飞 朱夏夏 黄山 于 2021-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种Zn～(2+)离子激活型荧光探针及其应用,涉及激活型荧光探针设计合成与应用技术领域。所述激活型小分子荧光探针,能够专一性检测体内外Zn～(2+)离子水平,实现激活型荧光成像,且不受其他金属离子的干扰。同时,本发明中目标探针与Zn～(2+)离子作用后,荧光强度迅速的实现“OFF”到“ON”的转变,可以应用于体内外Zn～(2+)离子的快速荧光检测。本发明采用一步合成目标探针的制备方法,可操作性强,简单高效,为Zn～(2+)离子异常相关疾病尤其是AD的诊断和治疗提供潜在的应用价值。(The invention provides Zn 2+ An ion-activated fluorescent probe and application thereof relate to the technical field of activated fluorescent probe design synthesis and application. The activated small molecular fluorescent probe can specifically detect Zn inside and outside a body 2+ And (4) ion level, so that activated fluorescence imaging is realized, and interference of other metal ions is avoided. Meanwhile, the target probe of the present invention is Zn 2+ After the ion action, the fluorescence intensity can rapidly realize the conversion from OFF to ON, and can be applied to in vivo and in vitro Zn 2+ Rapid fluorescence detection of ions. The preparation method for synthesizing the target probe by one step has strong operability, is simple and efficient and is Zn 2+ The diagnosis and treatment of diseases associated with ion abnormalities, particularly AD, provide potential application value.)
技术领域
本发明涉及激活型荧光探针设计合成与应用技术领域，具体涉及一种Zn2+离子激活型荧光探针及其应用。
背景技术
随着全球老龄化的加剧，老年人口比例逐年提升，阿尔兹海默氏症(Alzheimer’sDisease，简称AD，又称老年痴呆症)造成的问题日益严重。β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ蛋白)在大脑中形成的胞外β-淀粉样斑块(β-amyloidplaques，Aβ斑块)是阿尔兹海默氏症最重要的病理特征之一。Aβ斑块在大脑中产生的神经毒性与Aβ斑块中异常浓聚的Zn2+离子密切相关，即Aβ斑块与Zn2+离子等的异常结合将导致Aβ斑块的形成，并产生不可逆的神经毒性。Aβ蛋白与Zn2+离子的相互作用是导致AD发生的一个重要因素。
Zn2+离子作为人类和其它哺乳动物体内第二丰富的过渡金属离子，在细胞凋亡调控、信号传递、酶功能、基因表达等诸多生物学过程中发挥着重要作用。目前，在众多检测Zn2+离子的分析方法中，小分子荧光探针以其高灵敏度性和高特异性引起了广泛关注，然而该类探针仍旧存在检测限较高，难以检测低剂量的Zn2+离子，同时探针的分子量较大，生理毒性高，无法进行后续的生物学应用。因此，设计合成新型小分子荧光探针检测生理水平的Zn2+离子浓度，探索其在AD发生中的作用机理，具有重要的科研及临床价值。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种Zn2+离子激活型荧光探针及其应用，Zn2+离子能够有效激活探针的荧光信号，实现荧光从“OFF”到“ON”的转变，利用其激活型成像的特点，进行细胞内Zn2+离子成像，为后期探索Zn2+离子与Aβ蛋白的相互作用奠定基础。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种Zn2+离子激活型荧光探针，所述Zn2+离子激活型荧光探针的化学结构如下所示：
优选的，所述Zn2+离子激活型荧光探针的制备方法为：将4-二乙胺基水杨醛与对甲基苯胺发生亲核加成-消除反应，得到目标探针TN。
优选的，所述亲核加成-消除反应在无水乙醇中进行；且4-二乙胺基水杨醛与甲基苯胺的摩尔比为1∶1。
优选的，所述亲核加成-消除反应采用冰醋酸作为反应催化剂，反应为回流反应5h，并采用重结晶对目标探针进行提纯。
所述Zn2+离子激活型荧光探针的应用主要包括：在检测Zn2+离子中的应用；在制备Zn2+离子激活型试剂盒中的应用；在细胞荧光成像中的应用；在制备细胞荧光成像试剂的应用。
优选的，所述Zn2+离子激活型荧光探针在细胞荧光成像中的应用方式为：将Zn2+离子激活型荧光探针溶液加入到正常细胞或者Zn2+离子预处理的细胞中，培养孵化后吸去培养液，然后加入缓冲液，进行荧光检测，完成细胞成像。
优选的，所述Zn2+离子激活型荧光探针溶液中的溶剂为1％的DMSO水溶液。
优选的，所述细胞选用人源肝癌HepG2细胞。
本发明提供一种Zn2+离子激活型荧光探针及其应用，与现有技术相比优点在于：
(1)本发明中设计合成了一种新型激活型小分子荧光探针，采用一步合成法进行合成，方法简单高效；
(2)本发明中目标探针被Zn2+离子识别后，荧光强度实现“OFF”到“ON”的转变，实现激活型荧光成像。
(3)本发明中目标探针被与细胞中Zn2+离子共孵育后，实现细胞内Zn2+离子激活型荧光成像。
附图说明
图1为本发明Zn2+离子激活型荧光探针的合成示意图；
图2中(a)为本发明目标探针TN在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱图；(b)为目标探针TN在不同溶剂中的荧光发射光谱图；
图3中(a)为目标探针TN在不同金属离子存在下的紫外可见吸收光谱；(b)为目标探针TN在不同金属离子存在下的荧光发射光谱；
图4中(a)为目标探针TN的细胞毒性测试结果图；(b)为目标探针TN的光稳定性测试结果图；
图5为目标探针TN的活细胞共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
Zn2+离子激活型荧光探针的合成与表征：
(1)50mL圆底烧瓶中加入对甲基苯胺0.54g(107.15g/mol,5.0mmol)、4-二乙胺基水杨醛0.97g(193.24g/mol,5.0mmol)以及20mL无水乙醇作为溶剂，随后滴加1mL冰乙酸作为催化剂，混合液磁力搅拌并回流5h。反应完成，冷却至室温，析出黄色固体，抽滤，得到固体，使用20mL乙醇重结晶，得目标探针TN，合成示意图如图1所示。
实施例2：
Zn2+离子激活型荧光探针的溶剂化紫外可见吸收光谱及荧光发射光谱的确立：
(1)将实施例1中制得的目标探针TN溶于DMSO溶液中，配置成浓度为1×10-3mol/L的母液；
(2)取50μL母液分别加入4500μL的色谱纯溶剂中，按溶剂极性由低到高的顺序为：苯，二氯甲烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，乙醇，乙腈，N,N-二甲基甲酰胺；
(3)取适量上述样品于1cm的石英比色皿进行紫外可见吸收光谱及荧光发射光谱测试。
紫外可见吸收光谱使用SPECORD S600分光光度计进行测定，荧光发射光谱使用日立F-7000荧光分光光度计进行测定，并使用紫外可见分光光度计测试紫外可见光谱变化，结果如图2(a)所示。
结果表明，目标探针TN在不同极性溶剂中的最大吸收波长均在350～400nm，且随着溶剂极性大的增加，最佳吸收波长略有红移，呈现明显的溶剂化效应。
由于处于激发态分子的极性大于基态，所以极性溶剂虽然使激发态和基态的能量都有所降低，但是激发态降低的更多，因而分子的电子吸收能量较非极性溶剂中减小，故吸收带发生红移。图2(b)为相同条件下测试的荧光发射光谱。结果表明，目标探针TN的荧光发射强度均较弱，最佳发射波长位于400～550nm之间，荧光强度和发射波长受溶剂极性影像呈现不规律的变化。
实施例3：
Zn2+离子激活型荧光探针在不同金属离子存在下的紫外可见吸收光谱及荧光发射光谱的确立：
(1)将实施例1中制得的目标探针TN溶于DMSO溶液中，配置成浓度为1×10-3mol/L的母液。
(2)取50μL母液分别加入4925μL的水溶液中，同时分别加入25μL，1×10-2mol/L的不同金属离子的硝酸盐溶液(Blank、Fe3+、Ni2+、Al3+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Bi3+、Cr3+、Li+、Pb2+、Na+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、K+、Hg2+、Mn2+、Fe2+和Mn2+离子)，使金属离子的最终浓度为5×10-5mol/L。
(3)取适量上述样品于1cm的石英比色皿进行紫外可见吸收光谱及荧光发射光谱测试。
紫外可见吸收光谱使用SPECORD S600分光光度计进行测定，荧光发射光谱使用日立F-7000荧光分光光度计进行测定。
如图3(a)所示，由于目标探针TN分子上的酚羟基的O原子和C＝N键上的N原子具有一定的配位功能，而锌离子作为过渡金属元素，具有可以配位的空轨道，在其配位过程中能级发生改变，吸收峰发生变化，则在与未加任何离子的空白对照相比，加入Zn2+离子后，目标探针TN在350nm处出现新的较为明显的肩峰，而原来的主峰位置发生红移。
图3(b)为相同条件下测试的荧光发射光谱，结果表明，目标探针TN仅在Zn2+离子存在下呈现明显的荧光增强，而其他金属离子对荧光强度的改变不具有明显变化，表明探针TN确实是一个Zn2+离子激活型荧光探针。
实施例4：
Zn2+离子激活型荧光探针的细胞毒性测试与光稳定性测试：
1、细胞毒性实验：
(1)将对数期生长期的HepG2细胞接种到平底的96孔板中，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中孵育24h；
(2)使用新鲜DMEM培养基将探针TN稀释至所需浓度(0、10、20、40、60和80μM)，吸去96孔板中原有培养基，分别加入100μL不同浓度培养基稀释的探针溶液，继续37℃孵育24h；
(3)探针孵育完成，吸去原有培养基，每孔中使用100μL冷的PBS洗涤两遍，再分别加入100μL培养基稀释的MTT溶液(0.5mg/mL)，在5％CO2的37℃恒温培养箱中孵育4h；
(4)孵育完成，小心吸去96孔板中的溶液，并加入100μL的二甲基亚砜溶液，常温震荡5min后使用酶标仪进行测定；
(5)以同一实验条件下未经探针处理的细胞群体的吸光度作为参比，利用公式计算细胞成活率，实验重复测定三次。
由图4(a)可知在较低浓度化合物存在条件下，细胞的存活率均达到85％以上，这种较低的毒性可以用于后续的细胞内Zn2+离子激活共聚焦荧光成像。
2、光稳定性实验：使用荧光光谱测试5μM的探针TN在水溶液中的荧光强度，每分钟进行60s的激光辐照，连续照射10次，记录10次的荧光强度变化。
图4(b)为采用标准的光漂白方法测试探针在10min内的光稳定性，实验结果显示，10min内探针的荧光强度仍然保持初始强度的90％以上，具有良好的光稳定性。
实施例5：
Zn2+离子激活型荧光探针的共聚焦荧光成像：
(1)将上述实施例1获得的目标探针TN溶于含1％的DMSO的水中，加入到细胞富集程度达60％的HepG2细胞培养皿中(5μM)，放置在恒温培养箱孵化30min，随后吸去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍(2×1mL)，最后将每个孔注入1mL的PBS缓冲液。
(2)Zn2+离子激活实验中，Zn2+离子预先与HepG2细胞共培养30min后(20μM)，随后洗去培养液，并将介质换成TN(5μM)再共培养30min，洗去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍(2×1mL)，最后将培养皿中注入1mL的PBS缓冲液并进行共聚焦成像。
如图5所示，与没有添加Zn2+离子的对照组相比，实验组具有显著增强的细胞内荧光信号，且信号区域集中在胞质内，表明细胞内的Zn2+离子能够有效激活探针TN的荧光信号，实现细胞内激活型荧光成像。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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