一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
阅读说明：本技术 一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 (Method for producing gamma-polyglutamic acid by solid-state fermentation of soybean curd residue ) 是由 马霞 刘芷含 何艳 于 2021-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。本发明的方法包括：首先将枯草芽孢杆菌进行复苏、活化培养,得到枯草芽孢杆菌种子液；再配制豆腐渣固态发酵基料,制成固态发酵培养基,接种活化的枯草芽孢杆菌种子液,进行发酵,得到发酵产物；将发酵产物分离后提取得到γ-聚谷氨酸。本发明的发酵周期短,豆腐渣的利用率高、γ-聚谷氨酸的产率和生产效率高,所生产的γ-聚谷氨酸可广泛应用于农业、食品、医药和化工等领域。(The invention discloses a method for producing gamma-polyglutamic acid by solid-state fermentation of soybean curb residues. The method of the invention comprises the following steps: firstly, bacillus subtilis is revived and activated to obtain bacillus subtilis seed solution; preparing a solid fermentation substrate of the bean curd residue to prepare a solid fermentation culture medium, inoculating activated bacillus subtilis seed liquid, and fermenting to obtain a fermentation product; and separating the fermentation product and extracting to obtain the gamma-polyglutamic acid. The invention has short fermentation period, high utilization rate of the bean curd residue and high yield and production efficiency of the gamma-polyglutamic acid, and the produced gamma-polyglutamic acid can be widely applied to the fields of agriculture, food, medicine, chemical industry and the like.)
技术领域
本发明涉及一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，属于微生物工程技术领域。
背景技术
豆腐渣是大豆加工生产豆浆豆腐的主要副产物，其产量很大，且价格低廉。豆腐渣在工业加工后一般只能作为动物饲料或垃圾处理，尽管其依然含有较高的营养价值，但却没有得到较好的利用，造成了资源的浪费和环境污染。为了提高豆腐渣的利用率，利用微生物将豆腐渣进行发酵，不仅具有成本低廉，操作简单，可行性高的优点。
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是以左、右旋光性的谷氨酸为单元体，以γ-位上的酰胺键聚合而成同质多肽。γ-聚谷氨酸的分子量分布在100kDa到10000kDa之间，具有优异的水溶性、超强的吸附性、良好的生物降解性、生物相容性和较低的细胞毒性等特点，可以降解为谷氨酸，是一种优良的生物安全环保型高分子材料。已有研究表明γ-聚谷氨酸及其衍生物由于较好的增稠、保湿、成膜、黏接等功能，已经可以应用到化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业；其生物安全性和降解性更是使其成为了水凝胶和微胶囊的理想材料之一，被广泛在医药材料应用。但由于γ-聚谷氨酸产量相对较低，尽管经过了菌株的变异分离，产量依然不尽人意，且其分离提纯工艺较为复杂，费时费力，γ-聚谷氨酸的应用研究主要还是集中在科研实验中。寻找操作简单且成本廉价的生产方法及快速有效的提纯方法也是科研人员需要解决的一大问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何利用豆腐渣生产γ-聚谷氨酸解决豆腐渣的利用问题和γ-聚谷氨酸的生产问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
步骤1：枯草芽孢杆菌进行复苏、活化培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
步骤2：配制豆腐渣发酵培养基，接种步骤1得到的枯草芽孢杆菌种子液，进行发酵，得到豆腐渣发酵产物；
步骤3：将上述豆腐渣发酵产物进行分离，提取γ-聚谷氨酸。
优选地，所述步骤1具体为：将枯草芽孢菌接种至斜面培养基中复苏培养，得到菌种，再挑取菌种接种到装有液体培养基的摇瓶中进行活化培养，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液。
优选地，所述斜面培养基的组成包括：LB培养基40g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH；所述液体培养基的组成包括：蔗糖30g，牛肉膏10g，谷氨酸钠30g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.5g,CaCl2 1g，蒸馏水1L，自然pH。
优选地，所述复苏培养的条件为：温度37℃，时间24h；所述活化培养的条件为：液体培养基50mL，摇瓶转速220r/min，温度37℃，时间18h。
优选地，所述步骤2中的配制豆腐渣发酵培养基具体为：将干豆腐渣与蒸馏水按照质量比为1:2～4的比例混合后得到豆腐渣发酵培养基。
优选地，所述步骤2中发酵培养的条件为：接种量2％，温度37℃，时间24～28h，静置发酵。
优选地，所述步骤3的分离具体为：将豆腐渣发酵产物用质量分数0.9％的生理盐水浸10min，离心，去除菌体和部分豆粉沉淀后得到上清液；所述的提取具体为：调节分离所得的上清液的pH至3，然后加入4倍体积的异丙醇，放入冰箱沉淀12h后离心，离心所得沉淀物即为γ-聚谷氨酸。
优选地，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用了产量大且价格低廉的工业废料-豆腐渣作为固态发酵基底，有效提高其工业价值的同时，也为豆腐渣提供了有效的利用方式；
2.本发明生产方式简单，所需成本较低，无需大型生产设施投入，可行性和操作性较强。
3.本发明发酵周期短，豆腐渣的利用率高、γ-聚谷氨酸的产率和生产效率高。
附图说明
图1为本发明的豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
(1)培养基的配制：首先配制枯草芽孢杆菌的培养基，斜面培养基：LB培养基40g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH，121℃灭菌20min；液体培养基：蔗糖30g，牛肉膏10g，谷氨酸钠30g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.5g,CaCl2 1g，自然pH，蒸馏水1L；再配制豆腐渣发酵培养基，在干豆腐渣中加入蒸馏水混合均匀，调节豆腐渣含水量为60％，进行121℃，15min灭菌处理。
(2)枯草芽孢杆菌的活化培养：在无菌条件下将4℃保存的枯草芽孢菌接种至斜面培养基，37℃培养24h复苏菌种，再挑取种子接种到装有50mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，220r/min，37℃培养18h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液。
(3)豆腐渣的发酵培养:按2％的接种量，将活化好的种子液接种到豆腐渣发酵培养基中进行37℃发酵培养24h；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。
(4)将发酵好的豆腐渣用0.9％生理盐水浸泡10min，离心，去除菌体和部分豆粉沉淀后取上清液，调pH至3。
(5)向提取液中加入4倍体积的异丙醇，放入冰箱沉淀12h。
(6)将醇沉溶液离心，所得沉淀物即为γ-聚谷氨酸粗提物；制备的γ-聚谷氨酸粗提物的产率19.96％。
作为对比，采用与上述制备方法相同的工艺条件将黄豆发酵，得到的γ-聚谷氨酸粗提物的产率为10.12％。
实施例2
一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
(1)培养基的配制：首先配制枯草芽孢杆菌的培养基，斜面培养基：LB培养基40g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH，121℃灭菌20min；液体培养基：蔗糖30g，牛肉膏10g，谷氨酸钠30g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.5g,CaCl2 1g，自然pH，蒸馏水1L；再配制豆腐渣发酵培养基，在干豆腐渣中加入蒸馏水混合均匀，调节豆腐渣含水量为80％，进行121℃，15min灭菌处理。
(2)枯草芽孢杆菌的活化培养：在无菌条件下将4℃保存的枯草芽孢菌接种至斜面培养基，37℃培养24h复苏菌种，再挑取种子接种到装有50mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，220r/min，37℃培养18h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液。
(3)豆腐渣的发酵培养:按2％的接种量，将活化好的种子液接种到豆腐渣发酵培养基中进行37℃发酵培养24h；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。
(4)将发酵好的豆腐渣用0.9％生理盐水浸泡10min，离心，去除菌体和部分豆粉沉淀后取上清液，调pH至3。
(5)向提取液中加入4倍体积的异丙醇，放入冰箱沉淀12h。
(6)将醇沉溶液离心，所得沉淀物即为γ-聚谷氨酸粗提物；制备的γ-聚谷氨酸粗提物的产率19.34％。
作为对比，采用与上述制备方法相同的工艺条件将黄豆发酵，得到的γ-聚谷氨酸粗提物的产率为10.12％。
实施例3
一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
(1)培养基的配制：首先配制枯草芽孢杆菌的培养基，斜面培养基：LB培养基40g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH，121℃灭菌20min；液体培养基：蔗糖30g，牛肉膏10g，谷氨酸钠30g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.5g,CaCl2 1g，自然pH，蒸馏水1L；再配制豆腐渣发酵培养基，在干豆腐渣中加入蒸馏水混合均匀，调节豆腐渣含水量为70％，进行121℃，15min灭菌处理。
(2)枯草芽孢杆菌的活化培养：在无菌条件下将4℃保存的枯草芽孢菌接种至斜面培养基，37℃培养24h复苏菌种，再挑取种子接种到装有50mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，220r/min，37℃培养18h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液。
(3)豆腐渣的发酵培养:按2％的接种量，将活化好的种子液接种到豆腐渣发酵培养基中进行37℃发酵培养28h；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。
(4)将发酵好的豆腐渣用0.9％生理盐水浸泡10min，离心，去除菌体和部分豆粉沉淀后取上清液，调pH至3。
(5)向提取液中加入4倍体积的异丙醇，放入冰箱沉淀12h。
(6)将醇沉溶液离心，所得沉淀物即为γ-聚谷氨酸粗提物；制备的γ-聚谷氨酸粗提物的产率24.9％。
作为对比，采用与上述制备方法相同的工艺条件将黄豆发酵，得到的γ-聚谷氨酸粗提物的产率为15.424％。
实施例4
一种豆腐渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
(1)培养基的配制：首先配制枯草芽孢杆菌的培养基，斜面培养基：LB培养基40g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH，121℃灭菌20min；液体培养基：蔗糖30g，牛肉膏10g，谷氨酸钠30g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.5g,CaCl2 1g，自然pH，蒸馏水1L；再配制豆腐渣发酵培养基，在干豆腐渣中加入蒸馏水混合均匀，调节豆腐渣含水量为80％，进行121℃，15min灭菌处理。
(2)枯草芽孢杆菌的活化培养：在无菌条件下将4℃保存的枯草芽孢菌接种至斜面培养基，37℃培养24h复苏菌种，再挑取种子接种到装有50mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，220r/min，37℃培养18h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液。
(3)豆腐渣的发酵培养:按2％的接种量，将活化好的种子液接种到豆腐渣发酵培养基中进行37℃发酵培养28h；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。
(4)将发酵好的豆腐渣用0.9％生理盐水浸泡10min，离心，去除菌体和部分豆粉沉淀后取上清液，调pH至3。
(5)向提取液中加入4倍体积的异丙醇，放入冰箱沉淀12h。
(6)将醇沉溶液离心，所得沉淀物即为γ-聚谷氨酸粗提物；制备的γ-聚谷氨酸粗提物的产率20.9％。
作为对比，采用与上述制备方法相同的工艺条件将黄豆发酵，得到的γ-聚谷氨酸粗提物的产率为15.424％。
上述实施例1～4中，相同工艺条件下利用豆腐渣与黄豆发酵生产γ-聚谷氨酸，γ-聚谷氨酸的产率比较结果如表1所示，其中γ-聚谷氨酸的产率的增加率为豆腐渣相对于黄豆发酵所得的γ-聚谷氨酸的产率的增加率。
表1γ-聚谷氨酸的产率比较结果
从表1可知，豆腐渣经过发酵后，在较短的24h发酵周期，γ-聚谷氨酸的产率可以比同等质量的黄豆提高90％以上，28h的发酵周期产率能提高30％以上。且豆腐渣作为一种废料副产物，提高了其利用价值，对其剩余营养价值进行了充分利用。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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