含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法与应用 (Benzothiazole-containing phenylalanine derivative and preparation method and application thereof ) 是由 展鹏 徐淑静 刘新泳 孙林 黄天广 张续杰 屈直言 于 2021-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法和应用。所述衍生物具有如下通式I所示的结构。本发明还涉及该类衍生物的制备方法及其作为HIV-1/HIV-2抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用,以及代表性化合物在人肝微粒体和血浆中的代谢稳定性结果。(The invention provides a benzothiazole-containing phenylalanine derivative and a preparation method and application thereof. The derivative has a structure shown in the following general formula I. The invention also relates to a preparation method of the derivative, application of the derivative as an HIV-1/HIV-2 inhibitor in preparing anti-AIDS drugs, and metabolic stability results of representative compounds in human liver microsomes and blood plasma.)
技术领域
本发明属于有机化合物合成与医药应用
技术领域
，具体涉及一种含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法与应用。背景技术
艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)即获得性免疫缺陷综合征，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的慢性传染病。HIV属于RNA逆转录病毒，分为HIV-1和HIV-2两种亚型，其中HIV-1是当前主要流行的病原体。HIV-2主要在西非流行，但随着全球化的不断发展和人员交流日益频繁，HIV-2感染的风险正在不断增加，现已在美国、欧洲、南非、印度和中国等国家和地区发现有HIV-2感染病例，应引起足够的重视。当前，抗HIV药物仍然是防治艾滋病的有效武器。迄今，针对HIV-1生命周期关键环节，已有30多个化学实体被美国FDA批准上市，分别靶向逆转录酶、蛋白酶、整合酶、CCR5协同受体和膜融合过程。“高效抗逆转录病毒疗法”(Highly Active AntiretroviralTherapy,HAART)在很大程度上延长了患者的生存时间，改善了患者的生活质量，但是耐药性、药物毒副作用、潜伏感染以及长期服用药物的高额费用等问题大大降低了该疗法的功效，限制了该疗法的应用，进而迫使研究者研发新靶点、新机制、新结构的抗艾滋病药物。
HIV-1衣壳是由Gag前体蛋白剪切得到衣壳蛋白单体进而组装形成的。未成熟的病毒颗粒转变为成熟病毒颗粒的过程中，衣壳蛋白装配成成熟的衣壳，将病毒RNA及与核相关的蛋白(逆转录酶、蛋白酶、整合酶等)包裹在内，形成成熟的HIV-1病毒颗粒。成熟的病毒颗粒才具有传染性，可以进行病毒的下一轮复制。近年来，随着研究者对衣壳蛋白结构的深入了解，其晶体结构也被陆续报道。因而，HIV-1的衣壳蛋白可以作为新的抗HIV-1药物的作用靶点。
Pfizer公司通过对化合物库的高通量筛选得到能显著抑制HIV-1复制的化合物PF74，对其进行构效关系和机制研究表明，这类化合物通过结合HIV-1衣壳蛋白，进而干扰病毒的脱壳和形成感染颗粒的过程。尽管PF74结构新颖、机制独特、靶点明确，但是，PF74相对于目前已上市的抗HIV-1药物疗效较低，类药性质较差而且极易诱发耐药性。因此，研发更高效且具有良好类药性和防止耐药性发生的衣壳蛋白抑制剂成为近年来抗艾滋病药物研发领域中引人关注的方向。
本发明根据PF74与HIV-1衣壳蛋白结合位点的晶体结构特征，通过合理药物设计、化学合成和生物活性评价发现了全新结构的含苯并噻唑的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂，有望改善现有HIV-1衣壳蛋白抑制剂疗效低、类药性质差和耐药性问题。值得注意的是，本发明还发现该类结构的抑制剂对HIV-2具有良好至优异的活性，可作为先导化合物进一步修饰。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法，本发明还提供上述化合物作为HIV-1/2抑制剂的活性筛选结果及其应用，以及代表性化合物在人肝微粒体和血浆中的代谢稳定性结果。
本发明的技术方案如下：
1.含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物
含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物，或其药学上可接受的盐、酯，具有通式I所示的结构：
其中，
R为：C1-C6烷基、OC1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、OC3-C6环烷基、炔丙基、吡啶基、苯基、取代苯基、取代苄基、取代萘环、各种取代的六元杂环或各种取代的五元杂环；所述的取代基选自卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、乙酰基、三氟甲氧基、羟基、氰基、硝基、氨基、N-叔丁氧羰基。
根据本发明优选的，
R为：OC1-C6烷基、炔丙基、吡啶基、苯基、取代苯基、各种取代的六元杂环；所述的取代基选自卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、乙酰基、三氟甲氧基、羟基、氰基、硝基、氨基、N-叔丁氧羰基。
根据本发明进一步优选的，含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物是下列化合物之一：
本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。
2.含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物的制备方法
含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物的制备方法，包括步骤：以1,3-苯并噻唑-5-胺(1)为起始原料，与多聚甲醛、甲醇钠和硼氢化钠反应得到中间体2；中间体2与N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸发生酰胺缩合反应得到中间体3；中间体3在三氟乙酸的作用下脱掉Boc基团得到中间体4；接着中间体4与间苯二甲酸单甲酯发生酰胺缩合反应得到中间体5；中间体5经氢氧化锂水解脱去酯基得到中间体6，随后与各种取代的芳香胺或者脂肪胺发生酰胺缩合反应得到目标化合物(7a-t)；化合物(7r-t)进一步在三氟乙酸的作用下脱掉Boc基团得到目标化合物(7u-w)。
合成路线如下：
试剂及条件：(i)多聚甲醛，甲醇钠，甲醇，60℃，16h，硼氢化钠，室温，16h；(ii)N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，0℃转至室温；(iii)三氟乙酸，二氯甲烷，室温；(iv)间苯二甲酸单甲酯，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，0℃转至室温；(v)氢氧化锂，四氢呋喃，水，室温；(vi)相应取代的芳香胺或脂肪胺，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，0℃转至室温；(vii)三氟乙酸，二氯甲烷，室温。
其中，R为苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、4-乙酰基苯基、4-三氟甲氧基苯基、4-氰基苯基、炔丙基、2-甲氧基乙基、4-吡啶基、N-叔丁氧羰基-哌嗪基、N-叔丁氧羰基-哌啶基、N-叔丁氧羰基-4-氨基苯基、N-叔丁氧羰基-3-氨基苯基、N-叔丁氧羰基-2-氨基苯基。
所述的取代的芳香胺或脂肪胺为苯胺、4-氟苯胺、4-溴苯胺、4-氯苯胺、3-氟苯胺、2-氟苯胺、对甲苯胺、对甲氧基苯胺、对三氟甲基苯胺、对氨基苯乙酮、对三氟甲氧基苯胺、对氨基苯腈、炔丙基胺、2-甲氧基乙胺、4-氨基吡啶、N-叔丁氧羰基-哌嗪、N-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶、N-叔丁氧羰基-对苯二胺、N-叔丁氧羰基-间苯二胺、N-叔丁氧羰基-1,2-苯二胺。
本发明所述的室温为20-30℃。
根据本发明优选的，含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将1,3-苯并噻唑-5-胺(1)加入到甲醇中，之后缓慢加入多聚甲醛，再缓慢加入甲醇钠的甲醇溶液。60℃反应16h后逐渐降至室温，再加入NaBH4并室温继续反应16h。TLC监测反应毕，过滤反应液，减压蒸除溶剂，后加入饱和氯化钠溶液，并用乙酸乙酯萃取，合并有机相，然后用饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化后得到中间体2；
(2)将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷加入到二氯甲烷中使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将中间体2溶解在二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后将N,N-二异丙基乙胺加入到反应体系中，恢复至室温反应3h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，加入饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷萃取。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化后得到中间体3；
(3)将中间体3加入到二氯甲烷中使之溶解，随后将三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH为7，加入水，再加入二氯甲烷萃取。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到中间体4；
(4)将间苯二甲酸单甲酯、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，加入到二氯甲烷中使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将中间体4溶解在二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后，将N,N-二异丙基乙胺加入到反应体系中，恢复至室温反应6h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，并加入饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷萃取。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化后得到中间体5；
(5)将中间体5加入到四氢呋喃和水中，使之溶解，随后将氢氧化锂加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除四氢呋喃，然后用2mol/L的盐酸调节pH至3左右，析出白色固体，抽滤烘干得中间体6；
(6)将中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐加入到二氯甲烷中使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将不同取代的胺基衍生物溶解在二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后，将N,N-二异丙基乙胺加入到反应体系中，恢复至室温反应6h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，并加入饱和氯化钠溶液，然后用二氯甲烷萃取两次。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化后得目标化合物纯品(7a-7t)；
(7)将目标化合物(7r-t)加入到二氯甲烷中使之溶解，随后将三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH为7，加入水，再加入二氯甲烷萃取。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到目标化合物粗品，再经硅胶制备板纯化得目标化合物纯品(7u-7w)。
3.含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物的应用
本发明公开了含苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物抗HIV-1/2活性筛选结果及其作为HIV-1/2抑制剂的首次应用。通过实验证明本发明的含苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物可作为HIV-1/2抑制剂用于制备抗艾滋病药物。本发明还提供上述化合物在制备抗HIV-1/2药物中的应用。
目标化合物的抗HIV-1/2活性和毒性实验
对按照上述方法合成的一类含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1/2活性和毒性测试，它们的抗HIV-1和HIV-2活性和毒性数据列于表1中，以文献报道的衣壳蛋白抑制剂PF74为阳性对照。
本发明新合成的含苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物呈现出一定的抗HIV-1活性，其中化合物7u(EC50＝3.57±0.15μM,CC50＝57.36±9.82μM,SI＝16)和7m(EC50＝5.02±1.00μM,CC50＝133.61±4.8μM,SI＝27)展现出个位数微摩尔水平的抗HIV-1活性。值得注意的是，有16个化合物的抗HIV-2活性在0.85-3.85μM范围内，优于阳性对照PF74(EC50＝4.16±0.86μM,CC50＝32.27±1.25μM,SI＝8)，其中目标化合物7m的抗HIV-2活性和选择性(EC50＝0.85±0.24μM,CC50＝133.61±4.8μM,SI＝157)尤为突出，具有进一步研究的价值。同时，代表性化合物7u和7m在人肝微粒体和血浆中的代谢稳定性均优于先导PF74。尤为突出的是，7u(t1/2＝54.6min)在人肝微粒体中的半衰期较PF74(t1/2＝0.5min)提升109倍，可作为先导化合物进一步修饰以期得到活性和代谢稳定性均大幅提升的抗艾滋病药物。
本发明的一类含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物可作为HIV-1/2抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1/2抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
一种抗HIV-1/2药物组合物，包括本发明的含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明提供了一类含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物及其制备方法，本发明还提供了部分化合物抗HIV-1/2活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的一类含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物可作为HIV-1/2抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1/2抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
具体实施方式
通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，所述百分比数均为质量百分比。
实施例1：中间体N-甲基苯并[d]噻唑-5-胺(2)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入1,3-苯并噻唑-5-胺(0.5g，3.33mmol)，并加入20mL甲醇，之后缓慢加入多聚甲醛(0.22g，6.66mmol)，再缓慢加入甲醇钠(0.90g，16.64mmol)的甲醇溶液。60℃反应16h后逐渐降至室温，再加入NaBH4(0.31g，8.32mmol)并室温继续反应16h。TLC监测反应毕，过滤反应液，减压蒸除溶剂，后加入30mL水，并用乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离(洗脱剂EA:PE＝1:8+1％TEA)得到中间体N-甲基苯并[d]噻唑-5-胺(2)的粗品0.43g，黄色油状物，收率为78.6％。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.20(s,1H),7.77(d,J＝8.7Hz,1H),7.08(d,J＝2.2Hz,1H),6.83(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),5.92(d,J＝5.2Hz,1H),2.75(d,J＝5.1Hz,3H).
C8H8N2S[M+H]+(165.04),ESI-MS m/z:165.00(M+1).
实施例2：中间体叔丁基(S)-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸酯(3)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(1.94g，7.31mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(4.75g，9.13mmol)，并加入30mL二氯甲烷使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将中间体2(1.0g，6.09mmol)溶解在10mL二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后将N,N-二异丙基乙胺(2.83g，21.87mmol)加入到反应体系中，恢复至室温反应3h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，加入30mL饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离(洗脱剂EA:PE＝1:4)得到中间体叔丁基(S)-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸酯(3)的粗品1.9g，黄色固体，收率为76.0％。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.50(s,1H),8.27(d,J＝8.6Hz,1H),7.99(s,1H),7.38(d,J＝8.6Hz,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.09(d,J＝7.2Hz,3H),6.73(d,J＝7.0Hz,2H),4.18(q,J＝7.3Hz,1H),3.24(s,3H),2.84(dd,J＝13.7,4.5Hz,1H),2.65(dd,J＝13.6,9.7Hz,1H),1.31(s,9H).
C22H25N3O3S[M+H]+(412.16),ESI-MS m/z:411.87[M+H]+；433.99[M+Na]+
实施例3：中间体(S)-2-氨基-N-(苯并噻唑-5-基)-N-甲基-3-苯丙胺(4)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入中间体3(1.0g，2.43mmol)，并加入20mL二氯甲烷使之溶解，随后将4mL三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH至7，并加入30mL水，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到中间体(S)-2-氨基-N-(苯并噻唑-5-基)-N-甲基-3-苯丙胺(4)的粗品0.6g，黄色油状物，收率为79.3％。
波谱数据：
C17H17N3OS[M+H]+(312.11),ESI-MS m/z:312.02[M+H]+
实施例4：中间体(S)-3-((1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨甲酰基)苯甲酸甲酯(5)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入间苯二甲酸单甲酯(0.48g，2.67mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(1.27g，3.33mmol)，并加入30mL二氯甲烷使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将中间体4(0.69g，2.22mmol)溶解在10mL二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后，将N,N-二异丙基乙胺(0.57g，4.44mmol)加入到反应体系中，恢复至室温反应6h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，并加入30mL饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离(洗脱剂EA:PE＝1:3)得到中间体(S)-3-((1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨甲酰基)苯甲酸甲酯(5)0.64g，黄色固体，收率为60.8％。
波谱数据：
C26H23N3O4S[M+H]+(474.14),ESI-MS m/z:474.02[M+H]+
实施例5：中间体(S)-3-((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨甲酰基)苯甲酸(6)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入中间体5(0.63g，1.33mmol)，并加入10mL四氢呋喃，10mL水，使之溶解，随后将氢氧化锂(63.7mg，2.66mmol)加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后用2mol/L的盐酸调节pH至3左右，析出白色固体，抽滤烘干得到中间体(S)-3-((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨甲酰基)苯甲酸(6)0.47g，白色固体，收率为76.9％。
波谱数据：
C25H21N3O4S[M+H]+(460.13),ESI-MS m/z:460.05[M+H]+
实施例6：目标化合物(7a-t)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入中间体6(0.1g，0.2176mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(0.1241g，0.3264mmol)，并加入15mL二氯甲烷使之溶解，随后在冰浴条件下搅拌30min，后将不同取代的胺基衍生物(0.2611mmol)溶解在10mL二氯甲烷中并用恒压滴液漏斗逐滴加入到反应体系中；之后，将N,N-二异丙基乙胺(0.0844g，0.6529mmol)加入到反应体系中，恢复至室温反应6h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，并加入30mL饱和氯化钠溶液，然后用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析得目标化合物纯品(7a-w)。
相应取代的芳香胺选用苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-苯丙氨酸(7a)，白色粉末状固体，收率为81％。熔点:102-103℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.39(s,1H),9.52(s,1H),8.96(d,J＝7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.19–8.05(m,2H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.62(t,J＝7.7Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.41–7.34(m,2H),7.12(q,J＝6.2,5.1Hz,4H),6.86(d,J＝4.9Hz,2H),4.68(d,J＝8.2Hz,1H),3.34(d,J＝1.5Hz,3H),3.02(qd,J＝13.7,7.0Hz,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.67,166.31,165.62,158.58,154.21,141.81,139.56,138.36,135.65,134.37,133.57,130.95,130.82,129.21,129.14,128.85,128.61,127.45,126.91,125.69,124.26,123.84,122.62,120.83,53.24,38.05,37.00.
C31H26N4O3S[M+H]+(535.17),ESI-MS m/z:535.03[M+H]+
相应取代的芳香胺选用4-氟苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-氟苯基)间苯二甲酰胺(7b)，白色粉末状固体，收率为80％。熔点:111-112℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.45(s,1H),9.52(s,1H),8.96(d,J＝7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.16–8.05(m,2H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.82(dd,J＝8.7,5.0Hz,2H),7.62(t,J＝7.7Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(t,J＝8.7Hz,2H),7.11(d,J＝5.2Hz,3H),6.97–6.76(m,2H),4.69(s,1H),3.28(s,3H),3.02(qd,J＝13.8,7.1Hz,2H).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6):δ171.66,166.30,165.53,160.05,158.49,157.66,154.20,141.81,138.31,135.91,135.88,135.47,134.43,130.90,130.85,129.21,128.86,128.60,127.41,126.91,125.65,123.80,122.75,122.67,53.20,38.06,37.09.
C31H25FN4O3S[M+H]+(553.16),ESI-MS m/z:553.03[M+H]+
相应取代的芳香胺选用4-溴苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯丙-2-基)-N3-(4-溴苯基)间苯二甲酰胺(7c)，白色粉末状固体，收率为76％。熔点:103-105℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.52(s,1H),9.52(s,1H),8.96(d,J＝7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.18–7.96(m,3H),7.83–7.76(m,2H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.59–7.54(m,2H),7.49(d,J＝8.3Hz,1H),7.10(d,J＝5.4Hz,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.69(s,1H),3.28(s,3H),3.03(td,J＝16.4,15.2,7.4Hz,2H).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6):δ171.66,166.28,165.73,158.51,154.18,141.79,138.93,138.30,135.36,134.42,133.56,131.96,130.97,129.21,128.90,128.60,127.46,126.91,125.65,123.81,122.74,122.59,115.98,53.21,38.06,37.06.
C31H25BrN4O3S[M+H]+(613.08),ESI-MS m/z:613.01[M+H]+
相应取代的芳香胺选用4-氯苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-氯苯基)间苯二甲酰胺(7d)，白色粉末状固体，收率为75％。熔点:134-137℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.52(s,1H),9.52(s,1H),8.96(d,J＝7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.05(dd,J＝20.4,8.0Hz,3H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.3Hz,3H),7.11(s,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.68(q,J＝7.3Hz,1H),3.28(s,3H),3.15–2.90(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.27,165.71,158.55,154.20,141.80,138.54,138.34,135.37,134.41,133.57,130.97,129.21,129.06,128.90,128.61,127.87,127.47,126.91,125.67,123.83,122.61,122.34,53.23,38.05,37.02.
C31H25ClN4O3S[M+H]+(568.13),ESI-MS m/z:568.05[M+H]+
相应取代的芳香胺选用3-氟苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(3-氟苯基)间苯二甲酰胺(7e)，白色粉末状固体，收率为65％。熔点:104-105℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.58(s,1H),9.52(s,1H),8.97(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.07(dt,J＝17.9,7.8Hz,3H),7.78(dd,J＝11.8,2.2Hz,1H),7.62(dd,J＝19.7,8.1Hz,2H),7.42(q,J＝7.8Hz,2H),7.11(s,3H),6.96(t,J＝8.5Hz,1H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.76–4.60(m,1H),3.28(s,3H),3.02(qd,J＝13.7,7.2Hz,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.26,165.89,158.55,154.20,141.81,141.39,141.28,138.35,135.30,134.43,133.57,131.03,130.82,130.72,129.21,128.92,128.61,127.50,126.91,125.67,123.83,122.61,116.46,110.81,110.60,107.59,107.32,53.24,38.06,37.01.
C31H25FN4O3S[M+H]+(553.16),ESI-MS m/z:578.17[M+Na]+
相应取代的芳香胺选用2-氟苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(2-氟苯基)间苯二甲酰胺(7f)，白色粉末状固体，收率为82％。熔点:105-107℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.29(s,1H),9.55(s,1H),8.99(d,J＝7.6Hz,1H),8.48(s,1H),8.33(d,J＝8.5Hz,1H),8.14(d,J＝7.4Hz,2H),8.06(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(q,J＝8.4Hz,2H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H),7.38–7.27(m,3H),7.15(d,J＝5.1Hz,3H),6.90(d,J＝6.2Hz,2H),4.73(d,J＝7.2Hz,1H),3.32(s,3H),3.14–2.96(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.64,166.27,165.51,154.99,154.20,141.79,138.32,134.58,134.45,133.57,131.11,131.04,129.22,128.94,128.61,127.57,127.49,126.92,126.18,126.06,125.66,124.83,124.80,123.83,122.60,116.44,116.24,53.18,38.05,37.09.
C31H25FN4O3S[M+H]+(553.16),ESI-MS m/z:553.04[M+H]+
相应取代的芳香胺选用对甲苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(对甲苯基)间苯二甲酰胺(7g)，白色粉末状固体，收率为81％。熔点:132-134℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.30(s,1H),9.51(s,1H),8.94(d,J＝7.5Hz,1H),8.40(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.18–8.04(m,2H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,2H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.55–7.42(m,1H),7.18(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(d,J＝5.4Hz,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.69(s,1H),3.28(s,3H),3.12–2.93(m,2H),2.30(s,3H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.33,165.40,158.55,154.20,141.80,138.35,137.03,135.72,134.36,133.56,133.22,130.89,130.73,129.52,129.21,128.82,128.60,127.39,126.91,125.68,123.83,122.61,120.85,53.21,38.05,37.03,20.98.
C32H28N4O3S[M+H]+(549.19),ESI-MS m/z:549.07[M+H]+
相应取代的芳香胺选用对甲氧基苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-甲氧基苯基)间苯二甲酰胺(7h)，白色粉末状固体，收率为80％。熔点:143-144℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.27(s,1H),9.52(s,1H),8.95(d,J＝7.6Hz,1H),8.40(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.17–7.93(m,3H),7.79–7.67(m,2H),7.61(t,J＝7.7Hz,1H),7.55–7.42(m,1H),7.11(d,J＝5.2Hz,3H),7.04–6.92(m,2H),6.85(d,J＝4.5Hz,2H),4.69(t,J＝7.6Hz,1H),3.76(d,J＝1.5Hz,3H),3.28(s,3H),3.01(qd,J＝14.6,14.0,7.5Hz,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.67,166.35,165.16,158.51,156.13,154.20,138.33,135.72,134.38,133.55,132.61,130.82,130.65,129.21,128.80,128.60,127.33,126.90,125.66,123.80,122.59,122.46,114.28,55.67,53.20,38.06,37.07.
C32H28N4O4S[M+H]+(565.18),ESI-MS m/z:588.20[M+Na]+
相应取代的芳香胺选用对三氟甲基苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-(三氟甲基)苯基)间苯二甲酰胺(7i)，白色粉末状固体，收率为79％。熔点:134-136℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.74(s,1H),9.52(s,1H),8.98(d,J＝7.6Hz,1H),8.43(s,1H),8.30(d,J＝8.6Hz,1H),8.07(dd,J＝23.9,8.2Hz,5H),7.76(d,J＝8.4Hz,2H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.49(s,1H),7.11(s,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.68(s,1H),3.28(s,3H),3.11–2.89(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.65,166.23,166.11,165.07,158.50,154.20,143.21,141.81,138.32,135.17,134.48,133.55,131.14,131.08,129.22,128.93,128.60,127.58,126.90,126.45,126.41,126.21,125.65,124.40,124.09,123.80,123.52,122.60,120.65,53.22,38.06,37.08.
C32H25F3N4O3S[M+H]+(603.16),ESI-MS m/z:603.03[M+H]+
相应取代的芳香胺选用对氨基苯乙酮与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(4-乙酰苯基)-N3-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧基-3-ph苯基丙醇-2-基)异羟甲酰胺(7j)，白色粉末状固体，收率为74％。熔点:103-104℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.71(s,1H),9.51(s,1H),8.97(d,J＝7.6Hz,1H),8.43(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.5Hz,2H),7.99(q,J＝8.6Hz,5H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.49(d,J＝8.5Hz,1H),7.11(d,J＝5.2Hz,3H),6.85(d,J＝6.2Hz,2H),4.69(d,J＝7.0Hz,1H),3.28(s,3H),3.14–2.93(m,2H),2.57(s,3H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ197.11,171.65,166.24,166.06,158.59,154.20,143.97,141.78,138.34,135.24,134.40,133.57,132.60,131.13,129.83,129.20,128.95,128.62,127.60,126.92,125.67,123.85,122.62,119.95,53.26,38.05,36.97,26.97.
C33H28N4O4S[M+H]+(576.18),ESI-MS m/z:576.01[M+H]+
相应取代的芳香胺选用对三氟甲氧基苯胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-(三氟甲氧基)苯基)间苯二甲酰胺(7k)，白色粉末状固体，收率为71％。熔点:112-113℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.58(s,1H),9.52(s,1H),8.97(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,2H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.98–7.86(m,2H),7.63(t,J＝7.9Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.11(d,J＝5.3Hz,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.69(d,J＝7.4Hz,1H),3.28(s,3H),3.14–2.90(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.27,165.76,158.55,154.20,144.44,141.80,138.77,138.35,135.31,134.43,133.57,131.00,129.21,128.90,128.61,127.50,126.91,125.67,123.83,122.61,122.18,121.99,119.37,53.25,38.05,37.01.
C32H25F3N4O4S[M+H]+(618.15),ESI-MS m/z:618.04[M+H]+
相应取代的芳香胺选用对氨基苯腈与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(4-氰基苯基)间苯二甲酰胺(7l)，白色粉末状固体，收率为68％。熔点:171-172℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.78(s,1H),9.50(s,1H),8.96(d,J＝7.5Hz,1H),8.42(s,1H),8.28(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(d,J＝7.8Hz,2H),8.01(dd,J＝8.8,1.7Hz,3H),7.86–7.82(m,2H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,1H),7.10(d,J＝5.5Hz,3H),6.85(d,J＝6.3Hz,2H),4.69(t,J＝8.4Hz,1H),3.27(s,3H),3.11–2.93(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.64,166.24,166.19,158.54,154.20,143.88,141.80,138.33,135.04,134.47,133.65,131.26,131.14,129.21,128.98,128.61,127.63,126.91,125.65,123.83,122.61,120.72,119.52,105.99,53.25,38.06,37.02.
C32H25N5O3S[M+H]+(560.17),ESI-MS m/z:594.02[M+Cl]-
相应取代的芳香胺选用炔丙基胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-N3-(丙-2-基-1-基)间苯二甲酰胺(7m)，白色粉末状固体，收率为76％。熔点:134-135℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.51(s,1H),9.04(t,J＝5.6Hz,1H),8.89(d,J＝7.6Hz,1H),8.42–8.22(m,2H),8.08(s,1H),7.97(t,J＝7.6Hz,2H),7.56(t,J＝7.7Hz,1H),7.47(d,J＝8.1Hz,1H),7.11(d,J＝4.9Hz,3H),6.97–6.72(m,2H),4.67(d,J＝7.0Hz,1H),4.09(dd,J＝5.7,2.4Hz,2H),3.27(s,3H),3.16(s,1H),3.08–2.91(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.62,166.28,166.01,158.54,154.19,141.78,138.30,134.44,134.39,133.55,130.73,130.50,129.21,128.84,128.61,127.10,126.91,125.66,123.82,122.58,81.67,73.43,53.13,38.05,37.10,29.05.
C28H24N4O3S[M+H]+(497.16),ESI-MS m/z:497.06[M+H]+
相应取代的脂肪胺选用2-甲氧基乙胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(2-甲氧基乙基)间苯二甲酰胺(7n)，白色粉末状固体，收率为80％。熔点:105-106℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.50(s,1H),8.85(d,J＝7.6Hz,1H),8.60(d,J＝5.7Hz,1H),8.28(d,J＝14.2Hz,2H),8.07(s,1H),7.95(dd,J＝13.1,7.7Hz,2H),7.54(t,J＝7.7Hz,1H),7.46(d,J＝8.3Hz,1H),7.10(d,J＝5.2Hz,3H),6.84(d,J＝6.2Hz,2H),4.67(d,J＝7.4Hz,1H),3.47(t,J＝5.1Hz,4H),3.31–3.21(m,6H),3.09–2.91(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.65,166.38,166.30,158.52,154.19,141.80,138.32,135.02,134.31,133.55,130.49,130.43,129.21,128.71,128.60,126.97,126.90,125.65,123.81,122.59,70.93,58.41,53.13,39.54,38.05,37.11.
C28H28N4O4S[M+H]+(517.18),ESI-MS m/z:517.04[M+H]+
相应取代的芳香胺选用4-氨基吡啶与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得(S)-N1-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-N3-(吡啶-4-基)间苯二甲酰胺(7o)，白色粉末状固体，收率为80％。熔点:143-145℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.75(s,1H),9.51(s,1H),8.97(d,J＝7.5Hz,1H),8.51(d,J＝5.4Hz,2H),8.43(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(dd,J＝16.3,7.5Hz,3H),7.82(d,J＝5.5Hz,2H),7.65(t,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝8.5Hz,1H),7.11(d,J＝5.3Hz,3H),6.86(d,J＝6.2Hz,2H),4.70(t,J＝7.6Hz,1H),3.28(s,3H),3.02(dq,J＝23.0,12.8,10.9Hz,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.64,166.55,166.19,158.54,154.20,150.79,146.37,141.80,138.33,134.90,134.48,133.57,131.33,131.15,129.21,128.99,128.61,127.64,126.92,125.66,123.82,122.60,114.53,53.25,38.06,37.04.
C30H25N5O3S[M+H]+(536.17),ESI-MS m/z:536.05[M+H]+
相应取代的脂肪胺选用N-叔丁氧羰基-哌嗪与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得叔丁基(S)-4-(3-(((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酰基)苯甲酰基)哌嗪-1-羧酸盐(7p)，白色粉末状固体，收率为77％。熔点:152-153℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.51(s,1H),8.89(d,J＝7.7Hz,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.11(s,1H),7.98–7.81(m,2H),7.66–7.42(m,3H),7.09(d,J＝5.3Hz,3H),6.82(d,J＝6.3Hz,2H),4.65(d,J＝9.4Hz,1H),3.62(s,8H),3.27(s,3H),3.01(td,J＝16.9,15.4,7.5Hz,2H),1.42(s,9H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.62,169.08,166.05,158.49,154.33,138.37,136.17,134.27,130.27,129.17,129.01,128.56,126.86,126.42,122.58,79.73,53.17,38.71,38.06,36.98,28.50.
C34H37N5O5S[M+H]+(628.25),ESI-MS m/z:628.13[M+H]+
相应取代的脂肪胺选用N-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得叔丁基(S)-4-(3-((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酰基)苯甲酰胺基)哌啶-1-羧酸盐(7q)，白色粉末状固体，收率为73％。熔点:138-140℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.52(s,1H),8.90(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,J＝7.8Hz,1H),8.35–8.20(m,2H),8.11(s,1H),7.95(t,J＝7.9Hz,2H),7.52(dt,J＝15.8,8.1Hz,2H),7.10(d,J＝5.3Hz,3H),6.97–6.79(m,2H),4.65(q,J＝7.2,6.1Hz,1H),3.98(dd,J＝27.4,9.6Hz,3H),3.27(s,3H),3.05–2.79(m,4H),2.00(s,1H),1.81(dd,J＝13.1,3.9Hz,2H),1.42(s,9H),1.18(t,J＝7.1Hz,1H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.69,166.50,165.61,158.59,154.41,154.19,141.80,138.38,135.25,134.27,133.57,130.62,130.37,129.19,128.60,127.15,126.90,125.67,123.84,122.61,79.12,53.25,47.05,38.03,36.93,31.76,28.56.
C35H39N5O5S[M+H]+(642.27),ESI-MS m/z:642.13[M+H]+
相应取代的芳香胺选用N-叔丁氧羰基-对苯二胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得叔丁基(S)-(4-(3-((1-(苯并噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-n-基)氨甲酰基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸酯(7r)，白色粉末状固体，收率为76％。熔点:162-163℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.29(s,1H),9.52(s,1H),9.32(s,1H),8.94(d,J＝7.6Hz,1H),8.40(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.17–8.03(m,2H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(d,J＝8.5Hz,2H),7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.6Hz,3H),7.10(d,J＝5.2Hz,3H),6.85(d,J＝6.4Hz,2H),4.68(d,J＝6.8Hz,1H),3.28(s,3H),3.01(qd,J＝14.0,7.3Hz,2H),1.49(s,9H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.65,166.34,165.21,158.48,154.20,153.32,141.82,138.32,135.99,135.69,134.38,133.95,130.83,130.68,129.22,128.79,128.60,127.34,126.90,125.65,123.80,122.60,121.42,118.84,79.38,53.18,38.71,38.06,28.64.
C36H35N5O5S[M+H]+(650.24),ESI-MS m/z:[M+H]+
相应取代的芳香胺选用N-叔丁氧羰基-间苯二胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得叔丁基(S)-(3-(3-((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙正-2-基)氨基甲酰基)苯甲酰胺)苯基氨基甲酸酯(7s)，白色粉末状固体，收率为72％。熔点:151-152℃。
波谱数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.36(s,1H),9.52(s,1H),9.41(s,1H),8.94(d,J＝7.6Hz,1H),8.39(s,1H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),8.17–8.05(m,2H),8.06–7.94(m,2H),7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.47(dd,J＝18.2,8.3Hz,2H),7.23(t,J＝8.1Hz,1H),7.12(t,J＝8.4Hz,4H),6.97–6.77(m,2H),4.68(d,J＝7.2Hz,1H),3.28(s,3H),3.15–2.92(m,2H),1.49(s,9H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.33,165.52,158.55,154.20,153.23,141.80,140.28,139.81,138.34,135.63,134.31,133.56,130.97,130.79,129.22,129.07,128.78,128.61,127.47,126.91,125.68,123.83,122.61,114.93,114.46,111.09,79.44,53.20,38.05,37.05,28.63.
C36H35N5O5S[M+H]+(650.24),ESI-MS m/z:650.06[M+H]+
相应取代的芳香胺选用N-叔丁氧羰基-1,2-苯二胺与中间体6、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺反应制得叔丁基(S)-(2-(3-((1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷正-2-基)氨基甲酰基)苯甲酰胺)苯基氨基甲酸酯(7t)，白色粉末状固体，收率为69％。熔点:104-105℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.93(s,1H),9.51(s,1H),8.98(d,J＝7.6Hz,1H),8.69(s,1H),8.45(s,1H),8.29(d,J＝8.5Hz,1H),8.06(dd,J＝20.3,7.6Hz,3H),7.67–7.44(m,4H),7.26–7.08(m,5H),6.86(d,J＝6.2Hz,2H),4.69(d,J＝6.8Hz,1H),3.28(s,3H),3.10–2.92(m,2H),1.44(s,9H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.64,166.24,165.48,158.55,154.21,153.82,141.79,138.34,135.01,134.47,132.50,131.01,130.91,129.93,129.22,128.92,128.61,127.47,126.91,126.71,126.22,125.65,124.44,124.19,123.82,80.07,53.22,38.05,37.05,28.51.
C36H35N5O5S[M+H]+(650.24),ESI-MS m/z:650.06[M+H]+
实施例7：目标化合物(7u-w)的制备
于50mL圆底烧瓶中加入目标化合物7r(0.1g，0.1539mmol)，并加入15mL二氯甲烷使之溶解，随后将4ml三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH为7，并加入30mL水，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到目标化合物粗品，再经硅胶制备板纯化得目标化合物纯品(S)-N1-(4-氨基苯基)-N3-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯丙氨酸-2-基)间苯二甲酰胺(7u)，白色粉末状固体，收率为77％。熔点:131-132℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.98(s,1H),9.50(s,1H),8.88(d,J＝7.6Hz,1H),8.36(s,1H),8.28(d,J＝8.5Hz,1H),8.14–7.91(m,3H),7.57(t,J＝7.8Hz,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(s,3H),6.85(s,2H),6.67–6.50(m,2H),4.94(s,2H),4.68(s,1H),3.27(s,3H),3.00(dt,J＝23.5,13.5Hz,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.67,166.39,164.71,158.54,154.21,145.79,141.81,138.34,136.01,134.31,133.40,130.70,130.40,129.22,128.73,128.60,128.50,127.21,126.91,125.68,123.82,122.66,114.18,53.17,38.06,37.07.
C31H27N5O3S[M+H]+(550.18),ESI-MS m/z:550.04[M+H]+
于50mL圆底烧瓶中加入目标化合物7s(0.1g，0.1539mmol)，并加入15mL二氯甲烷使之溶解，随后将4mL三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH为7，并加入30mL水，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到目标化合物粗品，再经硅胶制备板纯化得目标化合物纯品(S)-N1-(3-氨基苯基)-N3-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯丙氨酸-2-基)间苯二甲酰胺(7v)，白色粉末状固体，收率为76％。熔点:129-130℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.05(s,1H),9.50(s,1H),8.89(d,J＝7.6Hz,1H),8.35(s,1H),8.28(d,J＝8.5Hz,1H),8.13–7.93(m,3H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.47(d,J＝8.4Hz,1H),7.23–7.06(m,4H),6.98(t,J＝7.9Hz,1H),6.87(t,J＝8.9Hz,3H),6.34(d,J＝7.9Hz,1H),5.09(s,2H),4.68(d,J＝7.0Hz,1H),3.27(s,3H),3.13–2.91(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.67,166.35,165.36,158.52,154.20,149.45,141.82,140.12,138.33,135.99,134.31,133.56,130.88,130.60,129.31,129.22,128.76,128.61,127.37,126.91,125.67,123.82,122.61,110.37,108.83,106.57,53.18,38.06,37.09.
C31H27N5O3S[M+H]+(550.18),ESI-MS m/z:584.18[M+Cl]-
于50mL圆底烧瓶中加入目标化合物7t(0.1g，0.1539mmol)，并加入15mL二氯甲烷使之溶解，随后将4mL三氟乙酸加入到反应体系中，室温反应4h。TLC监测反应毕，减压蒸除溶剂，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH为7，并加入30mL水，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗(20mL×2)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到目标化合物粗品，再经硅胶制备板纯化得目标化合物纯品(S)-N1-(2-氨基苯基)-N3-(1-(苯并[d]噻唑-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)间苯二甲酰胺(7w)，白色粉末状固体，收率为77％。熔点:169-171℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.76(s,1H),9.52(s,1H),8.92(d,J＝7.6Hz,1H),8.45(s,1H),8.29(d,J＝8.6Hz,1H),8.11(d,J＝9.4Hz,2H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝8.5Hz,1H),7.20(d,J＝7.9Hz,1H),7.11(d,J＝5.1Hz,3H),7.00(t,J＝7.7Hz,1H),6.86(d,J＝6.2Hz,2H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.62(t,J＝7.6Hz,1H),4.96(s,2H),4.69(d,J＝7.2Hz,1H),3.28(s,3H),3.13–2.90(m,2H).
13C-NMR(100Hz,DMSO-d6):δ171.66,166.32,165.53,158.50,154.19,142.51,141.80,138.28,135.25,134.29,131.05,130.74,129.23,128.77,128.62,127.51,127.19,127.11,126.92,125.65,124.19,123.80,122.58,117.61,117.17,53.12,38.07,37.18.
C31H27N5O3S[M+H]+(550.18),ESI-MS m/z:550.05[M+H]+
实施例8.目标化合物的体外抗HIV活性测试(MT-4细胞)实验
术语解释：MT-4细胞：人急性淋巴母细胞白血病细胞；MTT分析法：MTT即为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名:噻唑蓝；DMSO：二甲基亚砜。
测试原理
由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC50)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC50)，计算出选择系数(selectivity index，SI＝CC50/EC50)。
MTT分析法原理：MTT即溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮,可与活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快捷反映细胞活力的酶分析方法。
测试材料和方法
(1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)毒株：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供；
(2)MT-4细胞：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供；
(3)MTT：购自美国Sigma公司；
(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度；
(5)阳性对照：PF74；
(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度(A)值，计算出EC50、CC50以及SI；
(7)MTT染色法：加入样品培养一段时间后，再向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度。
具体操作如下：将化合物用DMSO或水溶解后用磷酸盐缓冲液稀释，将3×105MT-4细胞与100μL不同浓度的化合物溶液在37℃共同预孵育1h。然后向该混合物中加入100μL适当浓度的病毒稀释液，将细胞于37℃孵育1h。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含化合物的培养基质中。接着将细胞在5％CO2环境中，于37℃下再孵育7天，并于感染后的第三天用含有或不含化合物的培养基质补充原培养液。每种培养条件都重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。一般来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天发生细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒致细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(EC50)表示。值得强调的是，当化合物水溶性较差，需要用DMSO才能溶解时，DMSO体积比浓度相对于水来讲，一般会低于10％(DMSO在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为DMSO能影响测试化合物抗病毒活性，对含有相同浓度DMSO溶液的抗病毒活性对比空白实验也应该平行操作进行。另外，DMSO最终浓度(1/1000)远远低于影响HIV在MT-4细胞中复制所需浓度。
目标化合物的体外抗HIV-1(IIIB)及HIV-2(ROD)活性筛选数据由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供，所有的活性数据都经过至少两次独立、平行的实验测得，结果见表1。
表1.部分含有苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物抗HIV-1/2活性、毒性及选择指数(MT-4细胞)
aEC50：保护50％感染HIV-1的细胞免于细胞病变的化合物浓度；bCC50：使50％未感染HIV-1的细胞发生病变的化合物浓度；cSI：选择性系数，CC50/EC50的比值；dND:不能确定；PF74：已报道的一类HIV-1衣壳蛋白抑制剂，作为阳性对照。
实验结论分析：如表1所示，本发明新合成的含苯并噻唑的苯丙氨酸衍生物呈现出一定的抗HIV-1活性，其中化合物7u(EC50＝3.57±0.15μM,CC50＝57.36±9.82μM,SI＝16)和7m(EC50＝5.02±1.00μM,CC50＝133.61±4.8μM,SI＝27)展现出个位数微摩尔水平的抗HIV-1活性。值得注意的是，有16个化合物的抗HIV-2活性在0.85-3.85μM范围内，优于阳性对照PF74(EC50＝4.16±0.86μM,CC50＝32.27±1.25μM,SI＝8)，其中目标化合物7m的抗HIV-2活性和选择性(EC50＝0.85±0.24μM,CC50＝133.61±4.8μM,SI＝157)尤为突出，具有进一步研究的价值。
实施例9.代表性化合物7u和7m在人肝微粒体中的代谢稳定性研究
药物的最主要和最重要的代谢器官是肝脏，大多数药物的代谢主要在肝药酶系统完成，因此首先测试代表性化合物7u和7m在人肝微粒体(HLM)中的代谢稳定性。
实验方法
1.待测化合物和对照工作溶液的制备：
1.1中间溶液：将5μL化合物储备溶液(10mM，DMSO为溶媒)用495μL甲醇稀释至100μM(甲醇含量99％)。
1.2工作溶液：将50μL化合物中间溶液(100μM)用450μL100mM磷酸钾缓冲液稀释至10μM(甲醇含量9.9％)。
2.NADPH辅因子的制备：
2.1材料：
NADPH粉末：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式，四钠盐；NADPH·4Na(供应商：Chem-Impex International，目录号00616)
2.2准备步骤：
称取适量的NADPH粉末，并用10mM MgCl2溶液进行稀释(工作溶液浓度：10单位/mL；终浓度：1单位/mL)
3.肝微粒体制备：
用100mM磷酸钾缓冲液中制备适当浓度的微粒体工作溶液。
4.终止液的制备：
将含有100ng/mL甲苯磺丁酰胺和100ng/mL拉贝洛尔作为内标(IS)的冷(4℃)乙腈溶液用作终止溶液。
5.测定步骤：
5.1使用Apricot自动化工作站，将10μL/孔的化合物工作溶液添加到所有96孔反应板中，不包括空白对照(T0，T5，T10，T20，T30，T60和NCF60)。
5.2使用Apricot自动化工作站向所有反应板(空白，T0，T5，T10，T20，T30，T60和NCF60)添加80μL/孔的微粒体溶液。
5.3将所有包含化合物和微粒体混合物的反应板在37℃下预孵育10分钟。
5.4使用Apricot自动化工作站将10μL/孔的100mM磷酸钾缓冲液添加到反应板NCF60中。
5.5将反应板NCF60在37℃下孵育，并启动计时器1。
5.6预孵育后，使用Apricot自动化工作站向每个反应板，除了NCF60(空白，T0，T5，T10，T20，T30和T60)中添加10μL/孔的NADPH再生系统，以开始反应。
5.7将反应板在37℃下孵育，并启动计时器2。
5.8使用Apricot自动化工作站在适当的结束时间点向每个反应板中添加300μL/孔的终止溶液，以终止反应。
5.9将各板密封并摇动10分钟。
5.10摇动后，将每个板在4000rpm和4℃下离心20分钟。
5.11在离心过程中，使用Apricot自动化工作站将300μL/孔的HPLC级水添加到八个新的96孔板中。
5.12离心后，使用Apricot自动化工作站将100μL上清液从每个反应板转移至其相应的生物分析板。
5.13密封每个生物分析板并摇动10分钟，然后进行LC-MS/MS分析。结果见表2。
表2.代表性化合物7u和7m在人肝微粒体中的代谢稳定性结果
aR2：用于确定动力学常数的线性回归的相关系数；bT1/2：半衰期；cCLint(mic)：固有清除率；dCLint(liver)：肝微粒体中的清除率；eNCF：无辅助因子。在60分钟的孵育过程中，未将NADPH再生系统添加到NCF样品中(用缓冲液替换)。如果剩余量小于60％，则发生非NADPH依赖性反应。
实验结论分析：本实验选择在肝微粒体中具有中等代谢稳定性的睾酮(testosterone)、双氯芬酸(diclofenac)和普萘洛尔(propranolol)作为对照药。实验结果如表2所示，PF74在肝微粒体中可被快速代谢，60分钟后所剩无几，其半衰期为0.5分钟。而代表性化合物7u和7m的半衰期分别为54.6和25.7分钟，显著优于先导PF74。尤为突出的是，7u的半衰期较PF74提升109倍，可作为先导化合物进一步修饰以期得到活性和代谢稳定性均大幅提升的抗HIV抑制剂。
实施例10.代表性化合物7u和7m在人血浆中的代谢稳定性研究
口服药物经过肝脏代谢后进入体循环来发挥药理活性，所以化合物的血浆稳定性也是评价其成药性的一个关键因素。接下来将对代表性化合物7u和7m进行人血浆稳定性的测试。
实验方法
实验开始前，将混合的冷冻血浆在37℃的水浴中解冻。将血浆以4000rpm离心5分钟，如果有血块，将其去除。如有需要，可将pH值调节至7.4±0.1。将10μL储备液用90μLDMSO稀释以制备1mM中间溶液；通过用90μL超纯水稀释10μL储备液来制备1mM阳性对照溴丙胺太林(Propantheline)中间溶液。通过用180μL 45％MeOH/H2O溶液稀释20μL中间溶液(1mM)来制备100μM加液溶液。向98μL空白血浆中加入2μL加样溶液(100μM)加标，使最终浓度达到2μM(三份)，并将样品在37℃的水浴中孵育。在每个时间点(0、10、30、60和120分钟)，添加400μL终止溶液(200ng/mL甲苯磺丁酰胺和200ng/mL拉贝洛尔的50％乙腈/甲醇溶液)沉淀蛋白质并充分混合。以4000rpm离心样品板10分钟。从每个孔中转移等分的上清液(50μL)，并与100μL超纯水混合。在进行LC-MS/MS分析之前，将样品以800rpm的速度离心约10分钟。结果见表3.
表3.代表性化合物7u和7m在人血浆中的代谢稳定性结果
a％remaining：剩余百分比＝100×(指定孵育时间的PAR/时间T0的PAR)。PAR是测试化合物与内标物的峰面积比。精度应在指示值的80-120％之内。bT1/2：半衰期。
实验结论分析：代表性化合物7u和7m的人血浆稳定性实验结果如表3所示。孵育120分钟后，7u原药剩余量为98.7％，7m原药仍然可以完全保留(106.8％)，而PF74原药剩余量则降至85.2％。结果表明7u和7m的人血浆代谢稳定性相比PF74略有提升，且远优于对照溴丙胺太林(Propantheline bromide)(120min后原药剩余0.1％)。