具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有禽流感病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽流感的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽流感病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

“简并序列”：在分子生物学中，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)，这样的序列就叫简并序列。

“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。

“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

“转导(transduction)”是指当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导。

术语“预防和/或治疗”在涉及禽流感病毒感染时是指抑制禽流感病毒的复制、抑制禽流感病毒的传播或防止禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 H5亚型禽流感病毒样颗粒的表达

1、载体改造

以商品化载体pFastBac I为模板，在4413-4414位处依次插入NdeI、NotI、SalI和XbaI限制性酶切位点。PCR产物加入D pn I酶1μl消化掉模板质粒，取5μl按照常规方法转化DH 5α，改造成功的质粒命名为pFastBac mut。

2、三表达盒供体质粒的构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.1所示的HA基因、Seq IDNO.2所示的NA基因、Seq ID NO.3所示的M1基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII酶切位点。分别将合成的HA基因、NA基因、M1基因通过BamHI和HindIII酶切，和同样酶切的pFastBac mut进行连接，连接产物转化DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac mut-HA-1、pFastBac mut-NA-1和pFastBac mut-M1-1。

以pFastBac mut-HA-1和pFastBac mut-NA-1为模板，分别扩增HA和NA表达盒，将HA表达盒插入pFastBac mut-M1-1质粒中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA-1；再将NA表达盒插入pFastBac mut-M1-HA-1中，质粒命名为pFastBac mut-M1-HA-NA-1。

3、重组Bacmid构建及鉴定

将2μl pFastBac mut-M1-HA-NA-1质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为Bacmid-M1-1。

4、重组杆状病毒的获得及传代

将重组杆粒Bacmid-M1-1转染昆虫细胞sf9。参照Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-M1-1 P1。

将对数生长期的sf9细胞按照0.9×10⁶cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。

5、蛋白的表达及鉴定

将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

同上述方法，由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.4所示的HA基因、Seq ID NO.5所示的NA基因、Seq ID NO.6所示的M1基因，构建重组杆状病毒，命名为rBac-M1-2。将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例2 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1收获的病毒样颗粒分别加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表1。

表1 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

实施例3 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第1组～第6组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的疫苗1～疫苗6，第7组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H5HA含量均为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第8组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表2、3。

表2 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果1

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，第1组、第2组、第5组、第6组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护，超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第7组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护；第1组、第5组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第2组、第6组免疫组和第7组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第2组、第6组免疫反应产生更快，14日即可达到第7组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第5组、第6组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第1组、第2组单组分免疫组。表明本发明实施例2制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗1、疫苗2)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)免疫效果更好。

表3 H5亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，第3组、第4组、第5组、第6组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护，超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第7组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护；第3组、第5组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第4组、第6组免疫组和第7组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第2组、第6组免疫反应产生更快，14日即可达到第7组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第5组、第6组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第3组、第4组单组分免疫组。表明本发明实施例2制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗3、疫苗4)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)免疫效果更好。

表明，本发明提供的病毒样颗粒疫苗均具有较好的免疫效果，多组分的病毒样颗粒疫苗产生了协同作用，免疫效果更好。

实施例4 H7亚型禽流感病毒样颗粒的表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.7所示的HA基因、Seq IDNO.8所示的NA基因、Seq ID NO.9所示的M1基因，参照实施例1的方法构建重组杆状病毒，命名为rBac-M1-3。将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例5 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1、实施例4收获的病毒样颗粒分别加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表1。

表4 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

实施例6H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第9组～第12组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗7～疫苗10，第13组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H7HA含量为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第14组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表5、6、7。

表5 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果1

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，第9组、第10组、第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护；第9组、第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第10组、第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第10组、第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

表6 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护；第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

表7 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果3

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护；第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗9、疫苗10)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

综上，本发明提供的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗，还是多组分的病毒样颗粒疫苗均能提供理想的免疫效力，且本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。实施例7禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验

取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第15组经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗9，第16组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H5、H7HA含量均为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第17组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日、56日、84日、112日、140日、168日、196日、224日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表8、9、10。

表8禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果1

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H5亚型2.3.4.4d分支的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

表9禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H5亚型2.3.2.1d分支的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

表10禽流感病毒样颗粒疫苗免疫持续期试验结果3

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，疫苗9免疫组在免疫持续期时间较商品化疫苗免疫组长，在32周(224天)时HI抗体效价平均值依然高于6log2，能达到针对H7亚型的完全保护。表明本发明提供的高效表达的病毒样颗粒疫苗不仅免疫原性好，同时维持长时期的免疫。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 1

atggaaaaga tcgtgctgct gctcagcgtg gtgtccctgg ttaagtccga ccagatctgc 60

atcggatacc acgccaacaa ctccactgaa caagtggaca ccatcatgga gaagaacgtt 120

accgttactc acgctcagga catcctggag aagacccaca acggcaagct gtgtgacctg 180

aacggtgtga agcccctgat cctgaaggac tgtagcgtgg ctggatggct gctcggtaac 240

ccaatgtgtg acgagttcat ccgtgtgcca gagtggtcct acatcgtcga acgcgctaac 300

ccttccaacg acctgtgcta ccctggcaac ctgaacgact acgaagaact gaagcacctg 360

ctctctcgca ttaaccactt cgaaaaaacc cagatcatcc ccaagagatc ctggtctaac 420

cacacttcat ccggtgtgag cgctgcctgc ccataccagg gtgtggcctc cttcttccgc 480

aacgttgttt ggctgaccaa gaaaaacgac gcctacccta caatcaagat gtcatacaac 540

aacactaaca aggaggacct cctgatcttg tggggaatcc accactccaa ctccgctgaa 600

gaacagacta acctgtacaa gaaccctacc acctacgtga gcgtgggtac ctctaccctg 660

aaccaacgtc tggtgcctaa gatcgccact cgtagccaag tcaacggaca gaggggccgt 720

atggacttct tctggacaat cctccgccct aacgacgcca tccacttcga gtccaacggt 780

aacttcatcg ctcctgaata cgcctacaag atcatcaaga caggagacag cactatcatg 840

aagagcgaaa tcgaatacgg taactgtaac actaagtgcc agactcccat cggcgctatc 900

aactcatcca tgcctttcca caacatccac ccactcacta tcggtgaatg ccctaagtac 960

gtgaagagca acaagctggt gctggccaca ggcctgcgta actcccctct gcgtgaaaag 1020

aggggcctgt tcggtgctat cgctggcttc atcgagggcg gctggcaggg aatggttgac 1080

ggctggtacg gctaccacca ctctaacgag cagggtagcg gttacgctgc tgaccgtgag 1140

tccacacaga aggctatcga cggtgtgaca aacaaggtga actccatcat cgataagatg 1200

aacacccagt tcgaagccgt gggccgtgag ttcaactccc tcgaacgtcg catcgagaac 1260

ctcaacaaga agatggaaga cggtttcctc gacgtgtgga cctacaacgc cgaactgttg 1320

gtgctcatgg aaaacgagcg cactctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac 1380

gacaaggtgc gtttgcagct ccgcgacaac gctaaggagt tgggaaacgg ttgtttcgag 1440

ttctaccaca agtgtgacaa cgaatgtatg gagtcagtgc gcaacggtac atacgactac 1500

cctcaatact ctgaagaggc ccgtctcaag cgtgaggaaa tctctggagt taagctggag 1560

tctatcggta cctaccagat cctgtccatc tactccacag ttgcttcctc cttggtcttg 1620

gctatcatcg tcgccggcct cagcctctgg atgtgttcca acggttccct ccagtgtcgc 1680

atctgcatct aa 1692

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA

<213> H5亚型禽流感病毒

<400> 2

atgaacccta accagaagat cacctgtatc agcgctacag gtgttacatt gagcgttgta 60

agcctgctga tcggtatcgc caacctgggt ctgaacatcg gactgcacta caaggtttct 120

gattctacca caatcaacat ccctaagact aacgaaacta acccaacaac cactaacatc 180

acaaacatca tcgttaacaa gaacgaggaa aagacattcc tgaagttgac taagcctctg 240

tgtgaagtga actcatggca catcttgtct aaggacaacg ccatccgtat cggcgaagac 300

gctcacatcc tcgttacacg cgaaccatac ctgagctgtg acccccaggg ttgccgtatg 360

ttcgccctga gccaaggcac caccctccgt ggccagcacg ctaacggtac tatccacgac 420

cgtagcccat tccgcgctct catcagttgg gaaatgggtc aggctccttc cccttacaac 480

acccgtgtgg aatgcatcgg ctggtcctcc acaagctgtc acgacggcat cagccgcatg 540

agcatctgta tctcaggtcc gaacaacaac gcttccgccg tggtctggta ccgtggtcgt 600

cctgtgaccg agatccctag ctgggccggc aacatcctgc gtacacacga gtccgagtgc 660

gtgtgccata agggcatctg ccccgtggtt atgactgacg gccccgccaa caacaaggcc 720

gctaccaaga tcatctactt caaggagggc atgatccaga aggctgaaga actgcagggt 780

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<213> H5亚型禽流感病毒

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