一种低钛酸钡含量骨修复3d打印材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种低钛酸钡含量骨修复3d打印材料及其制备方法和应用 (Bone repair 3D printing material with low barium titanate content and preparation method and application thereof ) 是由 周苗 谌斯 郭凯 李树祎 耿远明 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种低钛酸钡含量骨修复3D打印材料及其制备方法和应用。该材料将羟丙基甲基纤维素、聚乙烯亚胺、钛酸钡、磷酸三钙、分散剂等按照一定的配比组合制备,在保证压电性能的前提下,可以大幅降低TCP/BT材料体系中BT的含量(≤40％),获得更好的生物活性、成骨性能和降解性能。达到了在LIPUS的协同作用下对细胞的增殖与分化等功能形成有效刺激,主动干预骨缺损修复过程。并且,配置成的浆料还可结合3D打印技术,满足临床使用中不同患者的个性化需求,制备出个性化的TCP/BT骨修复材料。(The invention belongs to the technical field of biomedical materials, and particularly relates to a bone repair 3D printing material with low barium titanate content, and a preparation method and application thereof. The material is prepared by combining hydroxypropyl methyl cellulose, polyethyleneimine, barium titanate, tricalcium phosphate, a dispersing agent and the like according to a certain proportion, and can greatly reduce the content of BT (less than or equal to 40%) in a TCP/BT material system on the premise of ensuring the piezoelectric performance, thereby obtaining better bioactivity, osteogenic performance and degradation performance. Achieves effective stimulation on functions of proliferation, differentiation and the like of cells under the synergistic action of LIPU, and actively intervenes in the bone defect repair process. In addition, the prepared slurry can also be combined with a 3D printing technology to meet the individual requirements of different patients in clinical use, and the individual TCP/BT bone repair material is prepared.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域。更具体地，涉及一种低钛酸钡含量骨修复3D打印材料及其制备方法和应用。
背景技术
大段骨缺损的修复一直是临床上较为棘手的问题，通过组织工程的方式对缺损的骨组织进行重建是目前较为理想的解决方案。其中，磷酸三钙(TCP)具有良好的生物相容性、可降解性和骨诱导性能，是较为理想的骨组织工程支架材料；但是TCP植入体内后生物响应性弱，难以完成大段骨组织缺损的修复。电活性材料钛酸钡具有较高的压电性能，可响应机械刺激形成电荷，材料表面的电荷可影响其对蛋白质、纤维素等活性物质的吸附，促进细胞在材料表面的粘附，还可改变膜电位，影响细胞离子通道，同时还具有良好的生物安全性。
因此，现有技术常将钛酸钡与磷酸三钙等生物活性材料组合使用。如中国专利申请CN104557057A公开了一种仿生骨植入材料，该材料由生物活性陶瓷颗粒和压电相陶瓷组成，其中生物活性陶瓷颗粒为羟基磷灰石、β-磷酸三钙等的混合物；压电相陶瓷为钛酸钡、氧化锌等，占陶瓷颗粒总质量的50～99％。该陶瓷具有良好的生物相容性，能够与骨形成牢固键合；但是该陶瓷为了保证压电性能对细胞形成有效刺激，体系中压电相钛酸钡含量通常都在50％以上，而钛酸钡在体内难以降解，其化学成分与天然骨组织差距太大，不利于骨组织形成。
因此，迫切需要提供一种低钛酸钡含量仍具有较好电活性，促进骨组织成长及血管形成，生物安全性好的骨修复材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有骨修复材料钛酸钡添加量高不利于骨组织形成，钛酸钡含量低无法达到相应电活性的缺陷和不足，提供一种低钛酸钡含量仍具有较好电活性，促进骨组织成长及血管形成，生物安全性好的骨修复3D打印材料。
本发明的目的是提供一种低钛酸钡含量骨修复3D打印材料。
本发明另一目的是提供所述低钛酸钡含量骨修复3D打印材料在制备骨修复支架中的应用。
本发明另一目的是提供一种低钛酸钡含量骨修复3D打印支架。
本发明另一目的是提供所述低钛酸钡含量骨修复3D打印支架的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种低钛酸钡含量骨修复3D打印材料，包括以下材料及其重量百分数：
羟丙基甲基纤维素水溶液0.5～5％、聚乙烯亚胺水溶液0.5～5％、分散剂2～5％、磷酸三钙和钛酸钡粉体65～75％和余量水；
其中，所述羟丙基甲基纤维素水溶液的羟丙基甲基纤维素质量浓度为5～15％，所述聚乙烯亚胺水溶液的聚乙烯亚胺质量浓度为5～15％。
由磷酸三钙(TCP)构成的骨组织工程支架植入体内后会在巨噬细胞的介导下逐步降解，降解过程中释放的钙、磷离子则会为新骨组织的形成提供原料，是理想的骨修复材料。但是TCP促成骨能力有限，难以完成大段骨组织缺损的修复与再生工作；并且，当TCP支架植入体内后，缺乏对促进骨组织再生过程有效的主动干预手段，限制了其大段骨缺损修复中的应用。
钛酸钡(BT)具有良好的生物相容性和生物安全性，同时也是一种生物压电材料，具有将受到的机械力刺激转化为电信号的能力，钛酸钡受到力的作用后会产生电荷，刺激成骨相关细胞的迁移、增殖和分化。但对钛酸钡等传统压电生物材料而言，生物体内并不具备其降解的条件，因此压电材料在植入后会长期存在于人体内，不仅阻碍新组织的生长，还会导致慢性炎症即“异物反应”，带来许多不必要的麻烦。
通过将BT与TCP进行结合可制备出具有压电性能的可降解骨修复材料，并结合数字建模以及3D打印技术科制备成个性化的骨组织工程支架。但是实践中发现，BT与TCP因表面性能的差异，在混合过程中容易团聚，造成体系表面自由能降低的问题，因此TCP/BT材料体系通常需要添加较高的比例BT(＞50％)以保证足够的压电性能，存在难以降解、阻碍新组织的生长、导致慢性炎症等问题。
本发明人经过大量的创造性劳动发现，在本发明材料的配比条件下，在保证压电性能的前提下，可以大幅降低TCP/BT材料体系中BT的含量(≤40％)，获得更好的生物活性、成骨性能和降解性能。达到了在LIPUS的协同作用下对细胞的增殖与分化等功能形成有效刺激，主动干预骨缺损修复过程。
并且，配置成的浆料还可结合3D打印技术，满足临床使用中不同患者的个性化需求，制备出个性化的TCP/BT骨修复材料。
优选地，包括以下材料及其重量百分数：
羟丙基甲基纤维素水溶液2～5％、聚乙烯亚胺水溶液2～5％、分散剂2～5％、磷酸三钙和钛酸钡粉体65～75％和余量水；
其中，所述羟丙基甲基纤维素水溶液的羟丙基甲基纤维素质量浓度为5～12％，所述聚乙烯亚胺水溶液的聚乙烯亚胺质量浓度为8～12％。
进一步地，所述钛酸钡(BT)为四方晶体结构，粒径为100～500nm。
更进一地，所述磷酸三钙的粒径为50～200nm。采用该范围下的纳米级磷酸三钙，能形成有效的BT连续相与压电网络，同时BT在纳米级磷酸三钙中分布更加均匀，而在微米级磷酸三钙中可能出现磁暴得不到有效刺激的情况。
进一步地，所述磷酸三钙和钛酸钡的重量比为(6～9):(1～4)。
更进一步地，所述分散剂选自柠檬酸钠、乙二胺四乙酸钠、二乙酸钠中的一种或多种。
另外的，本发明还提供了所述低钛酸钡含量骨修复3D打印材料在制备骨修复支架中的应用。
另外的，本发明还提供了一种低钛酸钡含量骨修复3D打印支架，由所述低钛酸钡含量骨修复3D打印材料制备得到。
另外的，本发明还提供了所述低钛酸钡含量骨修复3D打印支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备分散剂水溶液，加入生物陶瓷粉末混合均匀，再加入羟丙基甲基纤维素水溶液和聚乙烯亚胺水溶液，混合均匀，得3D打印浆料；
S2、设定3D打印参数，将步骤S1所得3D打印浆料打印成型，得毛坯；
S3、将步骤S2所得毛坯在900～1300℃温度下进行煅烧，极化，即得。
进一步地，步骤S3中，所述极化场强为3～10kv/mm。
更进一步地，步骤S3中，所述极化温度为100～130℃。
进一步地，步骤S1中，所述羟丙基甲基纤维素水溶液的质量体积浓度为8～15％，所述聚乙烯亚胺水溶液的质量体积浓度为8～15％。
本发明具有以下有益效果：
本发明一种低钛酸钡含量骨修复3D打印材料，将羟丙基甲基纤维素、聚乙烯亚胺、钛酸钡、磷酸三钙、分散剂等按照一定的配比组合制备，在保证压电性能的前提下，可以大幅降低TCP/BT材料体系中BT的含量(≤40％)，获得更好的生物活性、成骨性能和降解性能。达到了在LIPUS的协同作用下对细胞的增殖与分化等功能形成有效刺激，主动干预骨缺损修复过程。并且，配置成的浆料还可结合3D打印技术，满足临床使用中不同患者的个性化需求，制备出个性化的TCP/BT骨修复材料。
附图说明
图1为实验例1中不同磷酸三钙钛酸钡比例支架外观及表面形貌图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝10/0，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，c-磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，d-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3。
图2为实验例2中不同磷酸三钙钛酸钡比例支架EDS图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝10/0，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，c-磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，d-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3。
图3为实验例3中900℃煅烧温度得到支架的断面形貌图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，c-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3，d-磷酸三钙/钛酸钡＝6/4。
图4为实验例3中1100℃煅烧温度得到支架的断面形貌图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，c-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3，d-磷酸三钙/钛酸钡＝6/4。
图5为实验例3中1200℃煅烧温度得到支架的断面形貌图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，c-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3，d-磷酸三钙/钛酸钡＝6/4。
图6为实验例3中1300℃煅烧温度得到支架的断面形貌图；其中，a-磷酸三钙/钛酸钡＝9/1，b-钛磷酸三钙/钛酸钡＝8/2，c-磷酸三钙/钛酸钡＝7/3，d-磷酸三钙/钛酸钡＝6/4。
图7为实验例4中不同制备工艺得到支架的压电常数数据统计图；其中，图a为1100℃下不同磷酸三钙钛酸钡比例(TCP/BT为8/2、7/3、6/4)的TCP/BT材料d33检测结果统计图，图b为1300℃下不同磷酸三钙钛酸钡比例(TCP/BT为8/2、7/3、6/4)的TCP/BT材料d33检测结果。
图8为实验例5中LIPUS协同作用下BMSC细胞在不同比例的支架材料表面增殖与分化情况数据统计图；其中，a-LIPUS协同作用下BMSC细胞在不同比例(其中，10/0、9/1、8/2、7/3为磷酸三钙与钛酸钡的比例，10/0L、9/1L、8/2L、7/3L为接受LIPUS刺激的实验组)的支架材料表面培养1、4、7天后cck-8检测结果，b-LIPUS协同作用下BMSC细胞在不同比例的支架材料表面培养7、14天后碱性磷酸酶活性检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种低钛酸钡含量骨修复3D打印支架
所述低钛酸钡含量骨修复3D打印支架由以下材料及其重量百分数制成：
10wt％羟丙基甲基纤维素水溶液5％、10wt％聚乙烯亚胺水溶液1.7％、钛酸钡7％、磷酸三钙63％、分散剂2％和余量水；
支架设计：获取患者骨缺损部位的影像学数据，三维重建后镜像设计缺损部位的形貌。
制备方法：
S1、制备10％w/w的二乙酸钠水溶液，加入磷酸三钙粉末(粒径300nm)和钛酸钡(粒径100nm)混合均匀，再依次加入10％w/v的羟丙基甲基纤维素水溶液和10％w/v的聚乙烯亚胺水溶液，混合均匀，使悬浮液成凝胶状，得3D打印浆料；
S2、步骤S1所得3D打印浆料放入打印机，设置锥状喷头恒定喷出直径250μm的柱状墨水，然后层层堆积形成块状支架材料，使支架材料柱状结构中心至中心的距离为500μm，相邻两层之间柱状结构间相互垂直，两层间的距离为175μm，得毛坯；
S3、将步骤S2所得毛坯干燥24h，升温(升温速度为1℃/分钟)至400℃温度下煅烧1h去除有机质，再升温(升温速度为3℃/分钟)至1300℃温度下煅烧2h成型；在成型材料表面喷金后，在极化场强为10kv/mm，极化时间为15min，极化温度为130℃条件下进行极化，即得。
使用型准静态d33测试仪测试极化后实施例1支架的压电常数d33，结果显示经过极化后的实施例1支架材料的压电常数d33为3.8p/CN。
实施例2一种低钛酸钡含量骨修复3D打印支架
所述低钛酸钡含量骨修复3D打印支架由以下材料及其重量百分数制成：
10wt％羟丙基甲基纤维素水溶液3.3％、10wt％聚乙烯亚胺水溶液5％、钛酸钡14％、磷酸三钙56％、分散剂3％和余量水；
支架设计：获取患者骨缺损部位的影像学数据，三维重建后镜像设计缺损部位的形貌。
制备方法：
S1、制备13％w/w的柠檬酸钠水溶液，加入磷酸三钙粉末(粒径300nm)和钛酸钡(粒径100nm)混合均匀，再依次加入3.3％w/v羟丙基甲基纤维素水溶液和5％w/v聚乙烯亚胺水溶液，混合均匀，使悬浮液成凝胶状，随后超声30min，得3D打印浆料；
S2、步骤S1所得3D打印浆料放入打印机，设置锥状喷头恒定喷出直径150μm的柱状墨水，然后层层堆积形成块状支架材料，使支架材料柱状结构中心至中心的距离为400μm，相邻两层之间柱状结构间相互垂直，两层间的距离为125μm，得毛坯；
S3、将步骤S2所得毛坯干燥24h，升温(升温速度为10℃/分钟)至400℃温度下煅烧1.5h去除有机质，再升温(升温速度为1℃/分钟)至1200℃温度下煅烧2h成型；在成型材料表面喷金后，在极化场强为7kv/mm，极化时间为20min，极化温度为110℃条件下进行极化，即得。
使用型准静态d33测试仪测试极化后实施例2支架的压电常数d33，结果显示经过极化后的实施例1支架材料的压电常数d33为9.6p/CN。
对比例1一种骨修复3D打印支架
所述骨修复3D打印支架的制备包括以下步骤：
I、称取磷酸三钙(300nm)和钛酸钡(100nm)，并使磷酸三钙和钛酸钡的重量比为2∶7，置于干净的球磨罐中，放入氧化锆球和一定量的水，球磨48h，球磨完成后置于90℃烘箱中干燥24h，得混合粉体；
II、于步骤I所得混合粉体中添加4％的多聚甲醛，同时均匀搅拌，进行造粒后将所得材料放入模具中，以10MPa的压力利用压片机成型；
III、将步骤II所得成型的圆片升温(升温速率为1℃/min)至1200℃下煅烧2h，所得材料表面喷金后，在极化场强为10kv/mm，极化时间为15min，极化温度为130℃条件下进行极化，即得。
使用型准静态d33测试仪测试极化后对比例1支架的压电常数d33，结果显示经过极化后的对比例1支架材料的压电常数d33为2～3p/CN。
对比例2一种骨修复3D打印支架
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2使用13％w/w卵磷脂水溶液作为分散剂，其他参数及步骤，参考实施例1。
3D打印浆料配置完成后，在打印过程中支架结构保持性较差，经常出现塌陷的情况。
实验例1不同钛酸钡添加量支架外观及表面形貌测定
参考实施例1的参数及制备方法，改变其中磷酸三钙和钛酸钡的比例(磷酸三钙/钛酸钡分别为10/0、9/1、8/2、7/3)制备支架，并测定支架的外观及表面形貌，结果参见图1。
由图1可见，随着体系中钛酸钡(BT)含量的增加，支架表面变得更加光滑，孔隙变少；这是因为BT颗粒较小，可以填充在TCP颗粒中的空隙中，从而导致支架表面孔隙减少，更加平整。此外，煅烧后的支架中磷酸三钙(TCP)颗粒粒径也有随着BT含量增加而减少的趋势，这可能是因为在煅烧过程中，TCP颗粒间的BT阻碍了TCP晶体的生长，从而导致煅烧后的支架中TCP颗粒平均粒径下降。
另一方面，当BT含量过多时，BT对磷酸三钙颗粒的包裹会导致支架的降解性能下降。因此在保证压电性能的前提下，BT含量越低越好，结合后期实验结果，体系中的钛酸钡含量应不大于40％。
实验例2支架EDS检测结果
参考实施例1的参数及制备方法，改变其中磷酸三钙和钛酸钡的比例(磷酸三钙/钛酸钡分别为10/0、9/1、8/2、7/3)制备支架，并测定支架的EDS，结果参见图2。
由图2可见，随着BT所占比例的增加，Ba元素的特征峰逐渐升高，证明了支架中BT的存在。
实验例3不同煅烧温度得到支架的外观及表面形貌测定
参考实施例1的参数及制备方法，改变其中磷酸三钙和钛酸钡的比例(磷酸三钙/钛酸钡分别为9/1、8/2、7/3、6/4)，并且分别在不同的煅烧温度条件下(900℃、1100℃、1200℃、1300℃)制备支架，并测定支架的外观及表面形貌，结果参见图3～6。
由图3～6可见，磷酸三钙在煅烧过程中发生了相互融合，当煅烧温度过低时，支架内部中仍有大量孔隙存在；而随着钛酸钡含量的增加，可观察到的较小的钛酸钡颗粒逐渐增多，并主要分布在磷酸三钙之间的孔隙中。说明BT在体系中得到了较为均匀的分散，同时分部较为集中。
当煅烧温度升高时，支架中的孔隙消失，磷酸三钙与钛酸钡之间的结合也更为紧密；但是磷酸三钙与钛酸钡表面性能的差异较大，结合力较弱，磷酸三钙与钛酸钡两相交界处容易发生断裂，因此断面上观察到的粗糙处可反应钛酸钡在断面上的大致分布情况。由图4、5可观察到，随着体系中钛酸钡含量的升高，断面变得更加粗糙，同时粗糙部分呈现出连续分布(图中红色线条标记)。由此可认为钛酸钡在支架中形成了连续相。同样的钛酸钡含量下，钛酸钡形成的连续相之间的距离随着温度的升高而增加，但是连续相的宽度则变宽了许多，这可能是因为微米级的磷酸三钙比表面积更小，从而导致钛酸钡分布更加集中。
结合实验数据分析可知，在900～1300℃煅烧温度条件下制备的支架的外观及表面形貌均较好。
实验例4不同制备工艺得到支架的压电常数
参考实施例1的参数及制备方法，分别改变其中的磷酸三钙和钛酸钡的比例(磷酸三钙/钛酸钡分别为9/1、8/2、7/3、6/4)，极化场强(分别为3kv/mm、5kv/mm、7kv/mm)，煅烧温度(900℃、1100℃、1300℃)制备支架，并测定支架的压电常数，结果参见图7。
当TCP/BT比例为9/1时各烧结温度均检测不出d33值，因此未在图中标出。如图7a所示，经过900℃烧结的nTCP/BT支架仅在7Kv的电场强度下才能检测出非常低的d33值。这可能是因为支架内部孔隙较多，BT分布不够集中。当烧结温度为1100℃时支架的d33值最高，d33值随着极化电场强度和BT含量的升高而升高。6/4组达到38.7±1.4pC/N，8/2组也达到28.75±3.1pC/N。而在文献报道中，磷酸钙/钛酸钡复合材料的d33值基本都在10pC/N一下，同时BT所占比例须在50％w/w以上。本研究制备的TCP/BT支架不仅d33值比文献报道中的高出许多，同时BT含量降低至20％w/w。
实验例5LIPUS协同作用下BMSC细胞在不同比例的支架材料表面增殖与分化情况
取一定量BMSC细胞种植于48孔板中，每天分别用LIPUS超声刺激5min，结果参见图8。
由图8a中可以看出，经过7天的培养后，各组材料上的BMSC细胞均出现不同程度的增殖，且增殖速率在未接受LIPUS刺激的材料便面并未显现出显著差异，说明BMSCs细胞可在材料表面粘附及增殖，无论是TCP、BT还是TCP/BT都具有较好的细胞相容性。同时，接受LIPUS刺激后，BMSC细胞的增殖速率明显快于未受刺激的对照组，说明LIPUS可在一定程度上促进BMSC细胞的增殖，这与之前的研究结果相符合。此外还可观察到BMSC细胞在接受LIPUS刺激的TCP/BT材料表面拥有最快的增殖速率。这可能是因为通过LIPUS激发了TCP/BT材料的压电效应，在材料表面形成了电荷并对细胞形成了有效的刺激。在图8b中，可以观察到在LIPUS与TCP/BT支架的共同作用下，7天和14天两个时间点的ALP活性得到了显著的增强。这说明可促进BMSC细胞增殖的TCP/BT压电材料体系的成功构建。
综上所述，本发明制备的TCP/BT材料可协同LIPUS进一步促进BMSC细胞在支架上的增值及成骨分化。为骨组织的修复提供了一种主动干预手段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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