具体实施方式

本实施方式部分涉及与用CD40L、CXCL13和/或CD93转导的树突状细胞相关的方法和组合物。CD40L、CXCL13和/或CD93可以是人的。在一些实施方式中，CD40L、CXCL13和/或CD93是啮齿动物(小鼠或大鼠)或猪。包括异源表达的蛋白质的细胞可以称为重组细胞。组合物可以是独立的重组DC(树突状细胞)组合物，或在替代的实施方式中，重组DC细胞可以通过使细胞与肿瘤裂解物接触而被抗原激活，这也可以称为“负载”，或者替代地，用同种异体(“一般性的”)肿瘤裂解物负载，作为疫苗和/或免疫佐剂用于具有实体瘤和恶性肿瘤的受试者。在一些实施方式中，相对于树突状细胞的来源，肿瘤裂解物是同种异体的。在一些实施方式中，相对于树突状细胞的来源，肿瘤裂解物是自体的。

树突状细胞(DC)是专业的抗原加工细胞。它们具有增强抗原摄取的许多受体，并且它们专用于将这些抗原转化为可被淋巴细胞识别的MHC-肽复合物。

尽管不希望受到理论的约束，但本发明的组合物和方法至少部分基于重组(或转基因)树突状细胞在注射部位建立混合白细胞反应(MLR)的能力。当在众所周知的临床测定-MLR中测试时，如本文所述的重组alloDC是主要的刺激物并且异常有效力。在一些实施方式中，DC对受试者可以是同种异体的。在这样的实施方式中，DC可以被称为alloDC。相对于被给药的受试者，alloDC是同种异体的细胞。

在一些实施方式中，用CD40L和/或CXCL13转导DC，以使患者的T细胞和B细胞的吸引最大化，并生成抗肿瘤细胞和体液免疫应答的级联。在一些实施方式中，用CD40L和CXCL13转导DC。在一些实施方式中，用CD40L、CXCL13和CD93转导DC。在一些实施方式中，用CD40L和CD93转导DC。在一些实施方式中，用CXCL13和CD93转导DC。在一些实施方式中，细胞未被CD93转导。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在任选的进一步的实施方式中，用CD93转导CD40L+和CXCL13+alloDC促进同种异体DC与宿主DC之间的交叉传达(cross-talk)，从而生成稳定且持续的宿主抗肿瘤免疫原性。

在一些实施方式中，用如本文所述的编码CD40L和CXCL13(和任选地CD93)或其任何组合的重组载体转染人CD14+单核细胞，以使其在人单核细胞上稳定表达。可以选择阳性转导的单核细胞，以及然后可以将单核细胞体外分化为未成熟和/或成熟DC。对于切除并活检的恶性肿瘤患者，可以产生自体肿瘤裂解物，并且可以将肿瘤裂解物呈递给未成熟重组alloDC(重组im alloDc)，以供重组im alloDc加工自体肿瘤裂解物。在一些实施方式中，对切除的肿瘤样品和活检样品的蛋白质表达谱进行筛选。如果表达谱表明至少有3个片段与GMP-MCV共享，则在DC体外成熟之前，用GMP-MCV负载重组imDC。对于任何不可切除且不可活检的患者，重组CD40L+CXCL13+alloDC(或任选地进一步包括CD93+)可以在无抗原负载的情况下作为免疫佐剂向患者给药。使用这种CD40L+CXCL13+(任选的)CD93 AlloDC方法，晚期癌症患者可以针对肿瘤抗原发起新的抗肿瘤细胞和体液免疫应答并且，在不受任何特定机制的约束的情况下，增强免疫应答。

可以用于激活重组DC的另一种肿瘤裂解物包括DDM-1.7和/或DDM-1.13。DDM-1.7和DDM-1.13的描述可以在美国专利号7,771,998和7,723,107(包括可公开获得的保藏信息：分别为ECACC 01112339和ECACC 01112338)中找到，将它们各自其全文通过援引并入本文。

本文所用的未成熟的树突状细胞是具有以下标记物特征的那些：CD1a阳性、CD14阴性和CD83阴性/低。

在一些实施方式中，树突状细胞的来源可以来自供体外周血，并且包括源自CD14+单核细胞或CD34+细胞的树突状细胞。在一些实施方式中，供体与用本文所述的树突状细胞和组合物治疗的受试者不同。

近年来，已经认识到将抗原递送至T细胞，特别是至幼稚T细胞的有效的方式是通过树突状细胞。树突状细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞，并且基于DC的免疫治疗已在不同的环境中用于治疗癌症((Kugler et al.,2000,Nat.Med.,v.6,pp.332-336；Nestle etal.,1998,Nature(Med.),v.4,pp.328-332；Thurner et al.,1999,J.Exp.Med.,v.190,pp.1669-1678))证明了这种免疫方式的高效力。

DC的独特特性之一是它们通过内吞作用摄取外源蛋白质的能力，然后将其加工并与MHC I类抗原共同以肽表位呈现在其表面上。抗原呈递树突状细胞可以被细胞毒性T细胞识别。当肿瘤细胞抗原以外源添加的肿瘤裂解物或凋亡小体的形式应用时，这一特性是重要的。基于未成熟DC与成熟DC的比较，据信高内吞活性与DC分化的未成熟状态相关(Sallusto et al.,1995,J.Exp.Med.,v.182,pp.389-400)。

在一些实施方式中，在用肿瘤细胞裂解物/和或抗原负载重组树突状细胞之前或期间，用干扰素-α(IFN-α)和/或5'-氮杂-2'脱氧胞苷(Aza)处理重组树突状细胞。参见，https://doi.org/10.1101/531616。

在一些实施方式中，用重组载体，诸如包括人CD40L和CXCL13以及任选的CD93构建体的腺病毒或慢病毒载体转导纯化的人CD14+单核细胞，允许重组分子在纯化的人单核细胞上表达。然后选择阳性转导的单核细胞，以及然后将其体外分化为未成熟DC(imDC)，并且称为重组同种异体DC(重组alloDC)。在一些实施方式中，表达是稳定表达。在一些实施方式中，表达是过表达。“过表达”是指超出天然表达水平的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的水平。天然表达水平是指尚未被载体转导以表达一种或多种感兴趣的异源蛋白质，诸如CD40L、CXCL13和/或CD93的细胞的表达水平。

树突状细胞的各个阶段和成熟/激活因子的描述在图1D中示出(参见FrontImmunol.2013；4:438，将其全文通过援引并入本文)。

在一些实施方式中，通过使细胞在负载肿瘤细胞裂解物和/或抗原之后与成熟因子接触来使重组DC成熟。这些成熟因子至少包括：IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2或其任何组合。在一些实施方式中，通过使细胞在与肿瘤细胞裂解物和/或抗原接触之前与成熟因子接触来使重组DC成熟。在一些实施方式中，用成熟因子使DC成熟，并且不与肿瘤细胞裂解物和/或抗原接触。在一些实施方式中，将重组树突状细胞与选自由以下组成的组中的细胞因子一起培养或孵育：IL-4、GM-CSF、IL-13、IFN-γ、Flt-31、SCF和TNF-α。

缩写

WBC：白细胞

IPA：70％异丙醇

QA：品质保证

QC：质量控制

Vol.：体积

RT：室温

DC：树突状细胞

imDC：未成熟树突状细胞

mDC：成熟树突状细胞

AlloDC：同种异体树突状细胞

MCV：MalCancerVac

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

IL-4：白介素4

IL-1β：白介素1β

IL-15：白介素15

TNFα：肿瘤坏死因子α

pIC：聚肌苷：聚胞苷酸

IFN-α：干扰素α

IFN-γ:干扰素γ

CXCL13：C-X-C基序趋化因子配体13

CD40L：CD40配体

MAGE：黑素瘤相关抗原

MOI：感染复数

如在本申请和权利要求书中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数形式。另外，术语“包括(include)”意指“包括(comprise)”。

术语“患者”和“受试者”是可互换的，并且可以被理解为意指可以用本发明的化合物治疗的任何活生物体。这样，术语“患者”和“受试者”可以包括但不限于任何非人哺乳动物、灵长类动物或人。在一些实施方式中，“患者”或“受试者”是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马、灵长类动物或人。在一些实施方式中，患者或受试者是成人、儿童或婴儿。在一些实施方式中，患者或受试者是人。

除非本公开的上下文另有规定或与这样的解释不一致，否则当在紧接数值之前时，术语“约”意指该值的正负10％的范围，例如，“约50”意指45至55，“约25,000”意指22,500至27,500等。例如，在诸如“约49、约50、约55”的数值列表中，“约50”意指扩展到小于前值与后值之间的间隔的一半的范围，例如大于49.5至小于52.5。此外，应当鉴于本文所提供的术语“约”的定义来理解短语“小于约”或“大于约”。另外，如果范围被书写为“约X至Y”，则除非上下文另有规定，否则“约”将同时修饰X和Y值。

本文所用术语“给药(administer)”、“给药(administering)”或“给药(administration)”是指直接给药化合物、细胞、组合物或药物组合物，其也可以称为感兴趣的药剂。在一些实施方式中，将组合物灭菌或过滤以去除任何病毒或细菌颗粒。

术语“共给药”等意指涵盖向单个患者给药选择的多种治疗剂，并且意在包括其中通过相同或不同给药途径或在相同或不同的时间来给药药剂的治疗方案。

组合物的“治疗有效量”是足以实现期望的效果，即减轻、预防或改善患者的不良病症、疾病或症状的量。本方法设想的活性可以适当包括治疗性和/或预防性治疗。特定剂量可以由围绕病例的具体情况，包括例如给药的治疗剂、给药途径和所治疗的病症来确定。可以由医师根据相关情况，包括要治疗的病症、要给药的治疗剂的选择以及选择的给药途径来确定给药的有效量。

术语“抑制”包括给药本文实施方式的治疗剂以预防症状发作，减轻症状或消除疾病、病症或疾患。

通过“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与治疗剂的其他成分相容并且对其接受者无害。

本文所用术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是抑制、预防或减慢(减轻)不期望的生理状况、疾患或疾病，或改善、抑制或以其他方式获得有益或期望的临床结果。有益或理想的临床结果包括但不限于症状的改善或缓和；减小病症、疾患或疾病的程度；病症、疾患或疾病状态的稳定(即不恶化)；延缓病症、疾患或疾病的发作或减慢其进展；减轻病症、疾患或疾病状态；以及缓解(无论是部分还是全部)，无论病症、疾患或疾病是可检测的还是不可检测的，或是加强或改善。治疗包括引起临床上显著的应答而没有过多水平的副作用。与未接受治疗的预期生存期相比，治疗还包括延长生存期。

与“包括”、“包含”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包括性的或开放式的，并且不排除其他未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”排除在权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及实质上不影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。在其中术语“包括”用作过渡短语的实施方式或权利要求中，也可以设想在这样实施方式中用术语“由……组成”或“基本上由……组成”来替换术语“包括”。

本文公开了用于通过给药表达异源蛋白的树突状细胞引起免疫应答来治疗癌症的方法和组合物。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，树突状细胞对于给药其的受试者将是同种异体的，并且因此不受HLA表达的限制。相对于受试者的细胞的同种异体性质是增强改进的抗肿瘤作用的额外的优势。

在一些实施方式中，树突状细胞对于给药其的受试者可以是自体的。

因此，尽管不希望受理论约束，但本发明的方面涉及向患者提供表达异源蛋白(例如重组alloDC)的树突状细胞，以引起患者对癌症(肿瘤)的改善的免疫应答。本文所述的方法和组合物相比于先前的组合物和方法具有许多优点，包括没有在饲养细胞上的共培养，以及由于重组alloDC的体外培养/孵育时间短以及任选地负载自体或“一般性的(off theshelf)”抗原而使细胞组合物被污染的风险最小化，并且易于和快速地制备细胞组合物并将其递送给患者，同时细胞组合物的副作用非常小，通常只有1级(或更小的副作用)。这些重组同种异体DC细胞和组合物提供了在患者中引发细胞和体液免疫应答的额外的益处。此外，宿主对HLA不匹配的DC的同种异体反应将放大肿瘤特异性免疫应答。这些方法还可以用来提供“疫苗效应”以训练宿主、患者免疫细胞以类似方式识别并杀死癌症靶标，并增强宿主细胞和体液应答。在一些实施方式中，接受细胞的受试者将细胞视为外来物，并将增加针对该细胞的免疫应答，这可以称为排斥细胞。这种“排斥”可以放大受试者的肿瘤特异性免疫应答。

本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整的免疫球蛋白，并且可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文所用的术语“抗原”定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生，或特定免疫学组分细胞的激活，或两者。抗原也可以体外使用以激活DC，这与免疫应答相当。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，实施方式包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。而且，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以合成产生或可以来源于生物学样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。如本文所述，抗原可以是肿瘤细胞裂解物。肿瘤细胞裂解物的实例包括但不限于本文所述的那些从肿瘤活检或肿瘤切除术制备的裂解物。制备裂解物的方法是已知的，并且可以使用任何方法。

本文所用的术语“癌症”定义为特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

可以治疗的癌症包括未血管化或尚未实质上血管化肿瘤以及血管化肿瘤。用本文所述的重组树突状细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤，诸如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤(诸如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、施万细胞瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。

本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指可以通过肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、转移瘤数目减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善而表现的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过重组细胞和治疗性组合物首先预防肿瘤发生的能力来表现。

本文所用的术语“自体”意指源自同一个体，随后将其重新引入该个体的任何材料。

“同种异体”是指源自相同物种的不同动物，随后将样品引入所述相同物种的样品(移植物、细胞或细胞群)。在一些实施方式中，相对于接受重组树突状细胞的受试者，重组树突状细胞是完全HLA错配的，这不同于其中匹配HLA-A、-B和-DR对移植物存活有利的肾脏和骨髓移植的情况。在用于治疗癌症和/或增加和/或改善免疫应答的本发明方法中，表达CD40L、CXCL13和任选地CD93的重组树突状细胞可以吸引T细胞，并且例如生成体液免疫应答，用于靶向癌细胞并与它们结合，以及杀死它们，释放出肿瘤细胞抗原。这种循环用同种异体重组树突状细胞重复，直到它们被宿主细胞免疫应答杀死。例如，这可以发生在约4至约7天之内(并且可能在约4至约15天的扩展范围内)。因此，对于具有如此短的寿命的同种异体重组DC，GVHD(移植物抗宿主病)的风险降低或没有。然而，在约4至约7天的跨度识别和杀死肿瘤细胞并释放抗原的过程中，在一些实施方式中，同种异体细胞可用于使宿主树突状细胞和其他免疫细胞产生免疫力以识别和杀死肿瘤细胞。另请参阅文章CancerSci.2019Jan；110(1):16-22，将其全文通过援引并入本文。诱导抗肿瘤免疫力是可以自我传播的循环过程。它可以放大和扩展针对癌细胞的T细胞应答。当靶细胞(癌细胞)被根除时，它本身也包含若干种抑制因子以停止循环。如图1C所示，该循环可以分为7个步骤，开始于癌细胞释放癌细胞抗原，结束于杀死癌细胞。APC，抗原呈递细胞；DC，树突状细胞。

“疾病”是受试者的健康方面的状态，其中受试者不能维持体内稳态，并且其中如果疾病没有得到减轻，则动物的健康将继续恶化。相比之下，受试者中的“疾患”是其中受试者能够维持体内平衡的健康方面的状态，但是其中受试者的健康状况比没有疾患时的健康状况更不利。未经治疗，疾患不一定会引起受试者的健康状况进一步下降。

“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列，诸如基因、cDNA或mRNA用作模板在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链两者都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。本文所用的编码感兴趣的蛋白质的载体是指包含编码该一种或多种蛋白质的核苷酸序列的载体。

本文所用的术语“外源”是指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在生物、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。称为异源蛋白质的蛋白质由已引入到生物体、细胞、组织或系统中的外源材料(载体、核苷酸序列等)表达。为避免疑问，异源蛋白质、异源载体或异源核苷酸分子与可能存在于生物体、细胞、组织或系统的天然未修饰基因组中的异源蛋白质、异源载体或异源核苷酸分子不同。可能具有与生物体、细胞、组织或系统中已经存在的序列相同或相似的序列的异源蛋白质、载体或核苷酸序列是由与在生物体、细胞、组织或系统的基因组中发现的天然序列不同的位置或序列表达。

本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的顺式作用元件以用于表达；其他表达元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些载体，诸如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“同源”或“同源性”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当某个位置在两个比较序列中都被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每个位置都被腺嘌呤占据，则该分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数目除以所比较的位置数目再X 100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么所述两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC与TATGGC具有50％的同源性。通常，当两个序列对准以给出最大同源性时进行比较。

本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起抗体的作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白质中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。

“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，而与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。“分离的”生物组分(诸如核酸、蛋白质或细胞)已与其他生物组分(诸如细胞碎片、其他蛋白质、核酸或细胞类型)基本上分离或纯化出来。经“分离”的生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。

预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病开始发展后减轻其征兆或症状或病理学病症的治疗性干预。“减轻”是指疾病的征兆或症状的数目或严重程度的降低。

化疗包括用具有治疗效用的化学药剂(诸如细胞毒性剂)治疗，以治疗以异常细胞生长为特征的疾病，诸如肿瘤、赘生物、癌症和银屑病。化疗的实例包括但不限于本文所述的那些。

本文所用的重组通常指以下：重组核酸或蛋白质是具有非天然存在的序列或具有由两个以其他方式分离的序列片段的人工组合制成的序列的核酸或蛋白质。通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术，来实现这种人工组合。

如本文所用，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是尿苷。

本文所用的术语“白细胞”或“白血细胞”是指任何免疫细胞，包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞。本文所用的术语“淋巴细胞”是指通常在淋巴中发现的细胞，并且包括天然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞和B细胞。本领域技术人员将认识到，以上列出的免疫细胞类型可以分为进一步的亚群。

本文所用的术语“肿瘤浸润性白细胞”是指存在于实体瘤中的白细胞。

本文所用的术语“血液样品”是指从血液，诸如血浆、从血液分离的血细胞等制备的任何样品。

本文所用的术语“纯化的样品”是指其中一个或多个细胞亚群被富集的任何样品。可以通过基于特征，诸如大小、蛋白质表达等移出或分离细胞来纯化样品。

药学上可接受的载体：可用于本公开中的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)描述了适合用于药物递送一种或多种治疗性组合物以及额外的药剂的组合物和制剂。

通常，用于递送的合适的载体或媒介物的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，肠外制剂通常包括可注射的流体，所述可注射的流体包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体以外，待给药的药物组合物可以包含少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

在一些实施方式中，组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式都可以包括以下中的一种或多种：DMSO、无菌稀释剂，诸如注射用水，盐溶液，优选地生理盐水、林格溶液、等渗氯化钠、固定油，诸如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。

本文所用的免疫缺陷意指缺乏免疫系统的至少一种基本功能。本文所用的“免疫缺陷”受试者(诸如人)是缺乏免疫系统的特定组分或缺乏免疫系统的特定组分(诸如，例如，B细胞、T细胞、NK细胞或巨噬细胞)的功能的受试者。在一些情况下，免疫缺陷受试者包括阻止或抑制功能性免疫细胞(诸如B细胞、T细胞或NK细胞)发展的一种或多种遗传改变。在一些实例中，该遗传改变在IL17或IL17受体中。

本文所用的免疫抑制的是指免疫系统活性或功能降低。例如，由于用免疫抑制剂化合物治疗或作为疾病或疾患的结果(例如，由于HIV感染或由于遗传缺陷导致的免疫抑制)，受试者可以是免疫抑制的。在一些情况下，作为阻止或抑制功能性免疫细胞，诸如T细胞发展的基因突变的结果，发生免疫抑制。

可以用有效量的本文所述的重组树突状细胞组合物和相关方法治疗的癌症和增殖性疾患的实例包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因肿瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肾细胞癌、肝癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、异型增生和增生。癌症的治疗和/或预防包括但不限于缓解与癌症相关的一种或多种症状、抑制或减少癌症的进展、促进癌症的消退和/或促进免疫应答。

在某些其他实施方式中，“治疗有效量”是相对于未给药本发明的组合物和细胞的患者(或动物)或患者(或动物)组的肿瘤生长或癌症扩散，在给药本文所述的组合物和细胞的患者或动物中导致肿瘤生长或癌症扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的重组树突状细胞组合物的量。

在一些实施方式中，重组树突状细胞组合物可以与抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂同时给药。替代地，可以在给药抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂的时间之前的选定时间给药重组树突状细胞组合物。

与抗体联合

在一些实施方式中，重组树突状细胞组合物可以与对所选癌症类型具有特异性的抗体同时给药。替代地，可以在给药对选定的癌症类型具有特异性的抗体的时间之前的选定时间给药重组树突状细胞组合物。对选定的癌症类型具有特异性的抗体包括批准用于治疗癌症的任何抗体。实例包括用于乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))、用于淋巴瘤的利妥昔单抗(美罗华(Rituxan))、用于头颈部鳞状细胞癌的西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))。

这样的抗体剂的额外的实例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，诸如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)和派姆单抗/帕博利珠单抗，也称为MK-3475(来自默克公司的可瑞达)、匹地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)，和抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(默克公司)。其他检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，诸如抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体是由Bristol-Myers Squibb市售的Yervoy^TM(伊匹木单抗)。其他示例性CTLA-4抗体包括曲美木单抗(辉瑞(Pfizer))、地西林单抗(Ticilimumab)(AstraZenec)或AMGP-224(Glaxo Smith Kline)。在某些情况下，还可以指定这些抗体中的任何两种的组合。

在一些实施方式中，从各种来源，包括外周血单核细胞分离树突状细胞。

“外周血单核细胞”、“PBMC”或“单核细胞”是指从外周血分离的通常用于抗癌免疫治疗的单核细胞。可以从使用已知方法，诸如Ficoll-Hypaque密度梯度法收集的人血液中获得外周血单核细胞。

根据一种示例性实施方式，可以从任何合适的人获得“外周血单核细胞”。在一些实施方式中，供体细胞的来源，包括如本文所述的外周血单核细胞的来源相对于受体患者可以是同种异体的，以分离树突状细胞，用于本文所述的癌症治疗和免疫刺激方法。因此，在一些实施方式中，供体抑制性配体与患者(例如宿主)HLA不匹配。

在替代的实施方式中，供体细胞的来源，包括如本文所述的外周血单核细胞的来源相对于受体患者是自体的，以分离树突状细胞，用于本文所述的癌症治疗和免疫刺激方法。

细胞来源

可以通过样品的Ficoll-Hypaque密度梯度离心来分离PBMC，所述样品是从丢弃的、去除标识的白细胞减少过滤器(美国红十字会)获得的或者从来自知情同意的健康志愿者的血液捐献中获得的。细胞群、来源以及用于选择或富集期望的细胞类型的方法的描述可以在例如美国专利号9,347,044中找到。用于本文所述的治疗哺乳动物的方法中的细胞群必须是物种匹配的，诸如人细胞。细胞可以从动物，例如人患者获得。如果细胞是从动物获得的，则它们可能首先在培养中建立，例如通过转化；或更优选地，它们可能已经进行了初步纯化方法。例如，可以基于细胞表面标志物的表达通过阳性选择或阴性选择来操纵细胞群；用一种或多种抗原体外或体内刺激；用一种或多种生物改性剂体外或体内处理；或这些中的全部或任何组合。在说明性实施方式中，对细胞群进行阴性选择以排除非T细胞和/或特定T细胞亚群。可以基于多种分子，包括B细胞标记物，诸如CD19和CD20；单核细胞标记物CD14；NK细胞标记物CD56的细胞表面表达来进行阴性选择。替代地，可以对细胞群进行阴性选择以排除非CD34⁺造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。可以基于多种分子的细胞表面表达进行阴性选择，诸如可以用于例如经由MACS或柱分离其他类型的细胞的抗体(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a)的组合。

细胞群包括外周血单核细胞、包含混合群的全血或其部分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、通过白细胞去除术获得的细胞、活检组织、淋巴结，例如从淋巴管排出的淋巴结。合适的供体包括免疫的供体、未免疫的(天然)供体、处理或未处理的供体。“处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物改性剂的供体。“未处理的”供体尚未暴露于一种或多种生物改性剂。

获得包括单核细胞(待成熟成DC)或树突状细胞的细胞群的方法是本领域众所周知的。例如，可以根据本领域已知的方法如所述获得外周血单核细胞(PBMC)。这样的方法的实例描述于例如Nair,Smita et al.Current protocols in immunology vol.Chapter 7(2012):Unit7.32.doi:10.1002/0471142735.im0732s99。

还可以从受试者获得细胞样品，以及然后使其富集以得到期望的细胞类型。例如，可以从血液中分离PBMC，如本文所述。可以使用逆流离心(淘析)以从PBMC中富集单核细胞或树突状细胞。也可以使用以下多种技术将细胞与其他细胞分离：诸如用与期望的细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或激活，例如，一些T细胞分离试剂盒使用抗体缀合的珠子以既激活细胞又然后用相同的珠子允许柱分离。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标记物的抗体进行阴性选择，以在不通过受体接合来激活细胞的情况下选择性富集特定的细胞类型。

骨髓细胞(BM细胞)可以获自髂骨、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他骨髓腔。可以从患者体内取出骨髓，并通过各种分离和清洗程序进行分离。用于分离骨髓细胞的已知程序包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离成三个级分，并收集中间级分或血沉棕黄层(buffycoat)；b)将来自步骤(a)的血沉棕黄层级分在通常为Ficoll(Pharmacia FineChemicals AB的商标)的分离流体中再次离心，并收集包含骨髓细胞的中间级分；c)洗涤来自步骤(b)的收集的级分，以回收可再输注的骨髓细胞。另外，可以通过动员后进行白细胞分离术来收集BM细胞。

树突状细胞(DC)是免疫系统的前哨抗原呈递细胞。这些细胞具有从其环境中获取抗原物质并随后引发剧烈免疫反应的能力，而且是为癌症免疫疗法提供疫苗的理想候选者。树突状细胞包括具有区别形态和广泛组织分布的异质细胞群。DC展现细胞表面标记物，诸如CD1c⁺、CD14⁺、CD141⁺、CD16⁺或HLA-DR⁺。

特别地，树突状细胞通过外源性蛋白质的内吞作用而充当抗原呈递细胞，所述外源蛋白质随后被加工并与MHC I类和II类抗原共同在其表面上作为表位呈递。抗原呈递树突状细胞可以被细胞毒性T细胞和T辅助细胞识别。树突状细胞的成熟状态对其吞噬/内吞活性至关重要。未成熟的树突状细胞通常是用于负载抗原的最有效细胞。

未成熟的树突状细胞是指其中某些细胞标志物CD1a、CD14和CD83的表达的特征在于以下的树突状细胞：CD1a的高表达(群体中多于50％的DC是CD1a阳性)、CD14的不表达或低表达(群体中少于15％的DC是CD14阳性)和CD83的低表达(群体中少于25％的DC是CD83阳性)。

在一些实施方式中，DC从它们所驻留的任何组织，包括非淋巴组织，诸如皮肤的表皮(朗格汉斯(Langerhans)细胞)和淋巴组织，诸如脾、骨髓、淋巴结和胸腺，以及包括血液和外周血的循环系统中获得。由于DC在它们所驻留的任何组织中都以低数目出现，因此可以将DC富集或分离以供使用。包含重复的密度梯度分离、阳性选择、阴性选择或其组合的许多程序中的任何一种都可以用来获得富集的DC群。一旦获得了DC，就可以在适当的培养基中对其进行培养以扩增细胞群和/或将DC维持在最佳抗原摄取、加工和呈递的状态。

在一些实施方式中，DC相对于患有癌症的受试者可以是自体的，即，被给药到受试者的DC可以从所述同一受试者中分离。在其他实施方式中，DC相对于患有癌症的受试者可以是同种异体的。在一些实施方式中，本文公开的DC可以是任何亚型，诸如髓样DC、浆细胞样DC、间质DC、淋巴样组织驻留DC、卵泡DC、CD14⁺DC等。

在一些实施方式中，提供了开发可以用于癌症治疗的表达CD40L、CXCL13和任选地CD93的基因工程/重组树突状细胞的方法。

CD40L是35kDa的II型膜蛋白，而且是肿瘤坏死因子(TNF)基因家族的成员，其在抗原识别后在T细胞的表面上表达。CD40L关键涉及诱导抗肿瘤自身抗原的有效保护性免疫所必需的T细胞激活。(参见，Front Immunol.2011；2:31,将其全文通过援引并入本文)。人CD40L的完整序列信息可以在NCBI,Gene ID:959中找到。

CXCL13是在淋巴器官的卵泡基质细胞、腹膜和胸膜腔中的巨噬细胞和髓样树突状细胞中表达的趋化因子。已经示出它主要结合至G蛋白偶联受体CXCR5。CXCR5在B细胞和T细胞的某些亚群(包括卵泡辅助性T细胞、循环记忆CD4 T细胞的亚群，以及未完全分化为T-辅助性1(Th1)或T-辅助性2(Th2)的其他T细胞群。CXCL13已被证实通过以下在B细胞和T细胞共定位中具有生理作用：影响自反应性B1细胞归巢于派伊尔结(Peyer's patche)和其他炎症部位，以及将Th细胞募集到用于T依赖性抗体产生的次级淋巴器官中而发挥作用。(参见，Front Immunol.2016；7:225,将其全文通过援引并入本文)。人CXCL13的完整序列信息可以在NCBI,Gene ID:10563中找到。

人CD93(hCD93)是位于20号染色体，p11.21上的1型跨膜糖蛋白。这种蛋白在B细胞发育和吞噬作用期间参与细胞-细胞间相互作用。CD93在骨髓谱系、造血干细胞、NK细胞、血小板、小胶质细胞和内皮细胞中表达。人CD93的完整序列信息可以在NCBI,Gene ID:22918中找到。

在一些实施方式中，树突状细胞包括编码CD40L和/或CXCL13的一种或多种异源核酸分子。编码CD40L的异源核酸分子可以来自任何来源，诸如人、小鼠、大鼠或猪或任何其他哺乳动物。人CD40L核酸序列如SEQ ID NO:1所公开。类似地，编码CXCL13的异源核酸分子可以来自任何来源，诸如人、小鼠、大鼠或猪或任何其他哺乳动物。人CXCL13核酸序列如SEQID NO:2所公开。

在一些实施方式中，树突状细胞可以进一步包含编码CD93的异源核酸分子。编码CD93的异源核酸分子可以来自任何来源，诸如人、小鼠、大鼠或猪或任何其他哺乳动物。人CD93核酸序列如SEQ ID NO:3所公开。

然而，由于遗传密码的简并性质，编码蛋白质的核酸序列可以是其他序列。这些核酸序列是非限制性实例，并且可以使用其他核酸序列。

相应的人氨基酸序列如下：人CD40L：SEQ ID NO:4；人CXCL13：SEQ ID No:5；以及人CD93：SEQ ID NO:6。在一些实施方式中，蛋白质包括保守置换。

以下序列可以适当地在本申请全文中用作参考：

在一些实施方式中，人CD40L由以下编码：

ATGATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCCATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGGGTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGATCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGATATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTGATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCTGTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGCCAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTGCTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACGTCCTTTGGCTTACTCAAACTC(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方式中，人CXCL13由以下编码：

ATGAAGTTCATCTCGACATCTCTGCTTCTCATGCTGCTGGTCAGCAGCCTCTCTCCAGTCCAAGGTGTTCTGGAGGTCTATTACACAAGCTTGAGGTGTAGATGTGTCCAAGAGAGCTCAGTCTTTATCCCTAGACGCTTCATTGATCGAATTCAAATCTTGCCCCGTGGGAATGGTTGTCCAAGAAAAGAAATCATAGTCTGGAAGAAGAACAAGTCAATTGTGTGTGTGGACCCTCAAGCTGAATGGATACAAAGAATGATGGAAGTATTGAGAAAAAGAAGTTCTTCAACTCTACCAGTTCCAGTGTTTAAGAGAAAGATTCCC(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方式中，人CD93由以下编码：

ATGGCCACCTCCATGGGCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGACCCAGCCCGGGGCGGGGACGGGAGCTGACACGGAGGCGGTGGTCTGCGTGGGGACCGCCTGCTACACGGCCCACTCGGGCAAGCTGAGCGCTGCCGAGGCCCAGAACCACTGCAACCAGAACGGGGGCAACCTGGCCACTGTGAAGAGCAAGGAGGAGGCCCAGCACGTCCAGCGAGTACTGGCCCAGCTCCTGAGGCGGGAGGCAGCCCTGACGGCGAGGATGAGCAAGTTCTGGATTGGGCTCCAGCGAGAGAAGGGCAAGTGCCTGGACCCTAGTCTGCCGCTGAAGGGCTTCAGCTGGGTGGGCGGGGGGGAGGACACGCCTTACTCTAACTGGCACAAGGAGCTCCGGAACTCGTGCATCTCCAAGCGCTGTGTGTCTCTGCTGCTGGACCTGTCCCAGCCGCTCCTTCCCAGCCGCCTCCCCAAGTGGTCTGAGGGCCCCTGTGGGAGCCCAGGCTCCCCCGGAAGTAACATTGAGGGCTTCGTGTGCAAGTTCAGCTTCAAAGGCATGTGCCGGCCTCTGGCCCTGGGGGGCCCAGGTCAGGTGACCTACACCACCCCCTTCCAGACCACCAGTTCCTCCTTGGAGGCTGTGCCCTTTGCCTCTGCGGCCAATGTAGCCTGTGGGGAAGGTGACAAGGACGAGACTCAGAGTCATTATTTCCTGTGCAAGGAGAAGGCCCCCGATGTGTTCGACTGGGGCAGCTCGGGCCCCCTCTGTGTCAGCCCCAAGTATGGCTGCAACTTCAACAATGGGGGCTGCCACCAGGACTGCTTTGAAGGGGGGGATGGCTCCTTCCTCTGCGGCTGCCGACCAGGATTCCGGCTGCTGGATGACCTGGTGACCTGTGCCTCTCGAAACCCTTGCAGCTCCAGCCCATGTCGTGGGGGGGCCACGTGCGTCCTGGGACCCCATGGGAAAAACTACACGTGCCGCTGCCCCCAAGGGTACCAGCTGGACTCGAGTCAGCTGGACTGTGTGGACGTGGATGAATGCCAGGACTCCCCCTGTGCCCAGGAGTGTGTCAACACCCCTGGGGGCTTCCGCTGCGAATGCTGGGTTGGCTATGAGCCGGGCGGTCCTGGAGAGGGGGCCTGTCAGGATGTGGATGAGTGTGCTCTGGGTCGCTCGCCTTGCGCCCAGGGCTGCACCAACACAGATGGCTCATTTCACTGCTCCTGTGAGGAGGGCTACGTCCTGGCCGGGGAGGACGGGACTCAGTGCCAGGACGTGGATGAGTGTGTGGGCCCGGGGGGCCCCCTCTGCGACAGCTTGTGCTTCAACACACAAGGGTCCTTCCACTGTGGCTGCCTGCCAGGCTGGGTGCTGGCCCCAAATGGGGTCTCTTGCACCATGGGGCCTGTGTCTCTGGGACCACCATCTGGGCCCCCCGATGAGGAGGACAAAGGAGAGAAAGAAGGGAGCACCGTGCCCCGTGCTGCAACAGCCAGTCCCACAAGGGGCCCCGAGGGCACCCCCAAGGCTACACCCACCACAAGTAGACCTTCGCTGTCATCTGACGCCCCCATCACATCTGCCCCACTCAAGATGCTGGCCCCCAGTGGGTCCCCAGGCGTCTGGAGGGAGCCCAGCATCCATCACGCCACAGCTGCCTCTGGCCCCCAGGAGCCTGCAGGTGGGGACTCCTCCGTGGCCACACAAAACAACGATGGCACTGACGGGCAAAAGCTGCTTTTATTCTACATCCTAGGCACCGTGGTGGCCATCCTACTCCTGCTGGCCCTGGCTCTGGGGCTACTGGTCTATCGCAAGCGGAGAGCGAAGAGGGAGGAGAAGAAGGAGAAGAAGCCCCAGAATGCGGCAGACAGTTACTCCTGGGTTCCAGAGCGAGCTGAGAGCAGGGCCATGGAGAACCAGTACAGTCCGACACCTGGGACAGACTGC(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方式中，人CD40L包括以下氨基酸序列：

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID NO:4)。

在一些实施方式中，人CXCL13包括以下氨基酸序列：

MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQGVLEVYYTSLRCRCVQESSVFIPRRFIDRIQILPRGNGCPRKEIIVWKKNKSIVCVDPQAEWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID N:5)。

在一些实施方式中，人CD93包括以下氨基酸序列：

MATSMGLLLLLLLLLTQPGAGTGADTEAVVCVGTACYTAHSGKLSAAEAQNHCNQNGGNLATVKSKEEAQHVQRVLAQLLRREAALTARMSKFWIGLQREKGKCLDPSLPLKGFSWVGGGEDTPYSNWHKELRNSCISKRCVSLLLDLSQPLLPSRLPKWSEGPCGSPGSPGSNIEGFVCKFSFKGMCRPLALGGPGQVTYTTPFQTTSSSLEAVPFASAANVACGEGDKDETQSHYFLCKEKAPDVFDWGSSGPLCVSPKYGCNFNNGGCHQDCFEGGDGSFLCGCRPGFRLLDDLVTCASRNPCSSSPCRGGATCVLGPHGKNYTCRCPQGYQLDSSQLDCVDVDECQDSPCAQECVNTPGGFRCECWVGYEPGGPGEGACQDVDECALGRSPCAQGCTNTDGSFHCSCEEGYVLAGEDGTQCQDVDECVGPGGPLCDSLCFNTQGSFHCGCLPGWVLAPNGVSCTMGPVSLGPPSGPPDEEDKGEKEGSTVPRAATASPTRGPEGTPKATPTTSRPSLSSDAPITSAPLKMLAPSGSPGVWREPSIHHATAASGPQEPAGGDSSVATQNNDGTDGQKLLLFYILGTVVAILLLLALALGLLVYRKRRAKREEKKEKKPQNAADSYSWVPERAESRAMENQYSPTPGTDC(SEQ ID NO:6)。

在一些实施方式中，蛋白质与本文提供的序列至少或大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

可以通过本领域已知的任何已知重组技术，例如脂质体转染、化学转染、转基因DNA重组、病毒感染、转座子插入、跳跃基因插入、微注射、电穿孔、基因枪穿透及其组合将异源核酸分子引入树突状细胞中。在一些实施方式中，可以使用重组腺病毒载体、重组腺相关载体、重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体或其组合以引入异源核酸分子。

在一些实施方式中，可以使用表达期望的基因-CD40L、CXCL13和CD93的方法。这样的方法包括递送CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指核酸酶。例如，可以使用TALEN和CRISPR/Cas系统在天然基因的上游和下游插入特定的转录调节元件。TALEN和CRISPR/Cas9在特定位点能够生成单链或双链DNA断裂。这可以从外源模板刺激同源性定向修复(HDR)，从而允许转录调控元件的精确插入以激活天然基因。可以通过使用任何基因递送载体，诸如腺病毒载体、腺相关载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或其组合来递送CRISPR/Cas核酸酶。

在一些实施方式中，本文公开的基因工程DC可以在常规营养培养基中在环境条件(诸如温度、pH等)下培养，并且对于本领域技术人员是显而易见的。

在一些实施方式中，过表达CD40L、CXCL13和CD93的DC可以被抗原激活或冲击。在一些实施方式中，所述抗原可以是肿瘤抗原或病毒抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括由以下细胞表达的抗原：结直肠癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、头颈癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、黑素瘤细胞、胃肠癌细胞、前列腺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、肉瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、T细胞和B细胞淋巴瘤细胞、子宫内膜癌细胞或宫颈癌细胞。

在一些实施方式中，抗原可以是癌(肿瘤)细胞裂解物，并且癌细胞裂解物可以是相对于树突状细胞同种异体的或自体的。在一些实施方式中，癌细胞裂解物可以是黑素瘤癌细胞裂解物，诸如DDM-1.7细胞裂解物、DDM-1.13细胞裂解物或其组合。

用抗原冲击或激活树突状细胞的许多方法是本领域已知的。在一些实施方式中，可以在促进细胞生存力的条件下将抗原添加到培养的树突状细胞中，然后允许细胞有足够的时间摄取和加工抗原，并在细胞表面上与I类或II类MHC联合表达抗原肽，约24小时的时间段(约18至约30小时，优选地24小时)。也可以通过用编码抗原的DNA转染来使树突状细胞暴露于抗原。DNA被表达，并且抗原可能经由细胞溶质/I类途径被加工。

在一些实施方式中，分离的肽可以用于冲击或激活DC。通过以下多种方法中的任何一种对肽进行冲击：包括将肽与树突状细胞孵育、将包含肽的蛋白质与DC孵育、用编码肽的基因(或包含肽的蛋白质)等转导DC(或祖细胞扩增的单核细胞群)。用作肽的典型抗原源自在靶细胞，诸如转化细胞、癌细胞、细菌细胞、寄生虫感染的细胞或病毒感染的细胞等中表达的那些。实例包括但不限于碳水化合物，诸如粘蛋白、肿瘤抗原、源自选自由以下组成的组的蛋白质的肽：HIV Gag、HIV Env、HER-2、MART-1、gp-100、PSA、HBVc、HBVs、HPV E6、HPVE7、酪氨酸酶、MAGE-1、trp-1、分枝杆菌抗原和CEA，以及许多其他抗原。适合于呈递的肿瘤抗原包括但不限于c-erb-β-2/HER2/neu、PEM/MUC-1、Int-2、Hst、BRCA-1、BRCA-2、截短的EGFRvIII、CEA、p53、ras、RK、Myc、Myb、OB-1、OB-2、BCR/ABL、GIP、GSP、RET、ROS、FIS、SRC、TRC、WTI、DCC、NF1、FAP、MEN-1、ERB-B1、MAGE-抗原和独特型免疫球蛋白(例如，来自非霍奇金淋巴瘤患者的B细胞)。可以通过与某些细胞因子，诸如TNF-α或IL-1α或IL-1β共培养来增强树突状细胞的抗原呈递活性。

本文公开的激活的树突状细胞可以存在于包括生理学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂的组合物中。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当的稀释剂。合适的载体包括水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与预期受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方式中，组合物可以包括肿瘤抗原或病毒抗原。在一些实施方式中，组合物不含任何异源抗原。在一些实施方式中，组合物包括至少约10⁵个树突状细胞/mL、至少约10⁶个细胞/mL、至少约10⁷个细胞/mL或更多的群。

在一些实施方式中，在向受试者给药之前，可以将激活的DC冷冻(冷冻保存)。在一些实施方式中，可以通过以下来冷冻激活的DC，将细胞悬浮在包含至少30％人源血清和/或血浆的培养基中并将悬浮液的温度降低到至少-80℃，从而冷冻DC。在一些实施方式中，冷冻介质是约30％人源血清和/或血浆，以及约10％的防止冷冻期间冰晶形成的试剂，例如DMSO。在另一种实施方式中，将DC悬浮液保持在-80℃下至少24小时，以及然后在储存期间将其转移至液氮中。在另一种实施方式中，将DC悬浮液在34℃至41℃范围内的温度下解冻。

本文还公开了用于从单核细胞发展未成熟DC并用同种异体或自体肿瘤细胞裂解物激活未成熟DC的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)从受试者中分离单核细胞；(b)在分离的单核细胞中过表达选自CD40L、CXCL13和CD93的一种或多种基因；以及(c)将表达选自CD40L、CXCL13和CD93的一种或多种基因的单核细胞体外分化为未成熟的树突状细胞。在一些实施方式中，单核细胞是CD14⁺单核细胞。在一些实施方式中，方法包括：将异源表达CD40L、CXCL13和/或CD93的单核细胞体外分化为未成熟的树突状细胞。在一些实施方式中，单核细胞是CD14⁺单核细胞。在一些实施方式中，细胞是被转导和分化或扩增成单核细胞以及然后成熟的CD34+细胞，如本文所提供的。本文还描述了异源表达的蛋白质的不同组合。

在一些实施方式中，单核细胞获自各种来源，诸如来自患者的外周血单核细胞的白细胞去除术，紧接着淘析分离的外周血以提供分离的单核细胞。可以通过本文公开的技术，诸如脂质体转染、化学转染、转基因DNA重组、病毒感染、转座子插入、跳跃基因插入、微注射、电穿孔、基因枪穿透及其组合在遗传上操纵分离的单核细胞，以表达异源CD40L、CXCL13和CD93蛋白中的任何一种或组合。在一些实施方式中，可以使用重组腺病毒载体、重组腺相关载体、重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体或其组合。也可以使用诸如递送CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指核酸酶的方法以过表达异源蛋白CD40L、CXCL13和CD93中的任何一种或组合。

在一些实施方式中，表达CD40L、CXCL13和任选地CD93的重组单核细胞在IL-3存在下生长，引起单核细胞增殖，产生扩增的单核细胞群。单核细胞的扩增群可以分化为未成熟的树突状细胞，例如，通过用GM-CSF和IL-4(以产生基线或I型DC)以及任选地TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ和PGE₂培养扩增的细胞群。

在一些实施方式中，重组同种异体未成熟树突状细胞可以被抗原激活或冲击。在一些实施方式中，所述抗原可以是肿瘤抗原或病毒抗原。在一些实施方式中，抗原可以是癌细胞裂解物，并且癌细胞裂解物相对于未成熟的树突状细胞可以是同种异体或自体的。在一些实施方式中，癌细胞裂解物可以是黑素瘤癌细胞裂解物，诸如DDM-1.7细胞裂解物、DDM-1.13细胞裂解物或其组合。在一些实施方式中，细胞未被抗原激活或冲击。

在一些实施方式中，本文公开的激活的未成熟DC可以存在于包括生理学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂的组合物中。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当的稀释剂。在一些实施方式中，在向受试者给药之前，可以将激活的未成熟DC冷冻。可以在向受试者给药之前将细胞解冻。

本文还公开了治疗受试者中癌症的方法。在一些实施方式中，一种治疗受试者癌症的方法包括向受试者给药包括重组树突状细胞的组合物，其中所述树突状细胞异源表达选自CD40L、CXCL13和任选地CD93的一种或多种蛋白质。如本文所述，细胞相对于受试者可以是同种异体的。在一些实施方式中，细胞相对于受试者可以是自体的。

在一些实施方式中，在患有癌症的受试者中引发免疫应答的方法包括向受试者给药包括树突状细胞的组合物，其中所述树突状细胞异源表达选自CD40L、CXCL13和任选地CD93的一种或多种蛋白质。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，向患有癌症的受试者提供癌症疫苗的方法包括向受试者给药包括树突状细胞的组合物，其中所述树突状细胞异源表达选自CD40L、CXCL13和任选地CD93的一种或多种蛋白质。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，给药的树突状细胞(异源表达CD40L、CXCL13和/或CD93)相对于受试者是同种异体的。在一些实施方式中，给药的树突状细胞(异源CD40L、CXCL13和/或CD93)相对于受试者是自体的。在一些实施方式中，给药的树突状细胞是异源表达CD40L、CXCL13和/或CD93的未成熟树突状细胞。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，受试者患有选自由以下组成的组的癌症：结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、梅克尔细胞癌、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链疾病及其组合。

在额外的实施方式中，所述癌症是选自由以下组成的组中的实体瘤：纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤(诸如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、施万细胞瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。

在额外的实施方式中，在给药重组树突状细胞后的4-14天的时间范围内，向患者给药免疫检查点抑制剂，包括包含以下的两种免疫检查点抑制剂的任一种或组合：PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，诸如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)、派姆单抗/帕博利珠单抗，也称为MK-3475(来自默克公司的可瑞达)、匹地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)或抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(默克公司)、CTLA-4的拮抗剂，诸如抗CTLA-4抗体，包括抗CTLA4抗体YervoyTM(伊匹木单抗，Bristol-MyersSquibb)、曲美木单抗(Pfizer)、地西林单抗(AstraZenec)或AMGP-224(Glaxo SmithKline)，或针对乳腺癌的肿瘤特异性抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)，针对淋巴瘤的利妥昔单抗(美罗华)或西妥昔单抗(爱必妥)。

在额外的实施方式中，只要患者表现出改善或稳定的/非进展疾病，就定期重复治疗、给药或增加免疫应答，时间范围为诸如实施例1-3中的那些。

在额外的实施方式中，只要所述患者表现出改善或稳定/非进展性疾病，在以下时间范围内定期重复所述治疗，给药或增加免疫应答作为维持治疗：从每5天、每周一次，每14天一次、至每月一次，至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次，或每7个月一次，或每8个月一次，或每9个月一次，或每10个月一次，或每11个月一次，或每年一次。

在一些实施方式中，在给药之前，向受试者给药的重组树突状细胞(异源CD40L、CXCL13和/或CD93)未被抗原激活或冲击。在一些实施方式中，可以以包括佐剂、细胞因子和白介素的组合物给药树突状细胞，所述佐剂、细胞因子和白介素可以帮助引发免疫应答。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括：(a)获得来自受试者的切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱；

(b)将所述切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱与黑素瘤细胞裂解液的蛋白质表达谱进行比较；以及

(c)如果所述切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱中的至少三个标记物与所述黑素瘤细胞裂解物的蛋白表达谱匹配，则将过表达CD40L、CXCL13和任选地CD93的所述树突状细胞与所述黑素瘤细胞裂解物共同培养以激活所述树突状细胞以及向所述受试者给药包括激活的树突状细胞的组合物；以及

(d)如果所述切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱中的至少三个标记物与所述黑素瘤细胞裂解物的蛋白表达谱不匹配，则将过表达CD40L、CXCL13和任选地CD93的所述树突状细胞与所述肿瘤或活检样品共同培养以激活所述树突状细胞以及向所述受试者给药包括激活的树突状细胞的组合物。

在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括，在给药之前，筛选来自所述受试者的切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱以与同种异体肿瘤裂解物的蛋白质表达谱交叉匹配；以及如果所述切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱的至少三个片段与所述同种异体肿瘤裂解物的蛋白质表达谱交叉匹配，则给药同种异体肿瘤裂解物激活的树突状细胞或激活的树突状细胞组合物。本文所用的术语“交叉匹配”是指将一个样品的蛋白质表达谱与另一个比较，诸如将肿瘤裂解物与活检或切除的肿瘤样品进行比较。如果在裂解液和样品中均发现蛋白质片段，则称其为匹配。

在上述方法的一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CXCL13。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L、CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CD40L和CD93。在一些实施方式中，DC异源表达CXCL13和CD93。在一些实施方式中，DC不异源表达CD93。

在一些实施方式中，通过本领域众所周知的技术，诸如蛋白质阵列、蛋白质组学、质谱法(MALDI-MS)等来测量或比较蛋白质表达谱。在一些实施方式中，可以使用基因表达谱替代蛋白质表达谱用于比较。可以使用本领域众所周知的技术，诸如基因阵列、微阵列、RT-PCR等获得基因表达谱。

在一些实施方式中，在切除的肿瘤或活检样品的蛋白质表达谱与黑素瘤细胞裂解物的蛋白质表达谱之间进行比较的标志物是MAGE抗原。参见，例如Scanlan,Matthew J.etal.,Immunological Revs.2002,188:22-32和Weon JL,Potts PR.The MAGE proteinfamily and cancer.Curr Opin Cell Biol.2015；37:1–8.doi:10.1016/j.ceb.2015.08.002,将它们各自其全文通过援引并入本文。

在一些实施方式中，黑素瘤细胞裂解物源自选自由以下组成的组的细胞系：DDM-1.7、DDM-1.13或其组合。在一些实施方式中，黑素瘤细胞裂解物是MCV肿瘤裂解物，或与MCV肿瘤裂解物表达谱的某些部分匹配的裂解物。

在一些实施方式中，所述给药途径经由瘤内、瘤周、皮内、皮下、肌内、腹膜内注射。给药组合物以刺激免疫应答，并且可以通过团注、连续输注、从植入物的持续释放或其他合适的技术给予。

仅出于说明目的，可以通过在输注之前从受试者获取并保存血液样品以进行后续分析和比较来实践该方法。通常地，在大致60-120分钟内，至少约10⁴至10⁶个，以及典型地在1×10⁸与1×10¹⁰之间的细胞通过静脉内或腹膜内输注进入70kg的患者体内。

在一些方面，本文所述的治疗方法中的任何一种可以进一步包括向个体施用一种或多种额外的抗癌治疗。可以使用各种类别的抗癌剂。非限制性实例包括：辐射疗法、烷基化剂(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)、抗代谢物(例如硫唑嘌呤或巯嘌呤)、蒽环类、植物生物碱(包括例如长春花生物碱(诸如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛)和紫杉烷类(诸如紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)、多西他赛))、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱、伊立替康、拓泊替康、安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐或替尼泊苷)、鬼臼毒素(及其衍生物，诸如依托泊苷和替尼泊苷)、抗体(例如单克隆或多克隆)、酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(或))、激素治疗、可溶性受体和其他抗肿瘤药(例如放线菌素D、多柔比星、表柔比星、博来霉素、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环磷酰胺)。

另外，在一些实施方式中，本文提供的细胞和组合物可以辅助具有抗癌特性的其他药剂或治疗使用或与其他药剂或治疗一起使用(参见，美国专利号9,914,783，将其通过援引并入本文)。当辅助使用时，重组DC和相关组合物及其他药剂可以配制成单一的组合药物制剂，也可以分别配制成单一的给药方案或不同的剂量方案。与重组DC和相关组合物辅助给药或与重组DC和相关组合物辅助给药的试剂通常将具有与重组DC和相关组合物互补的活性，使得细胞和其他试剂不会相互不利影响。

可以辅助抗PD-1抗体使用的药剂包括但不限于烷基化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢药、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)，死亡受体途径激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞结合体)抗体、抗体药物缀合物、生物反应修饰剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫学、凋亡蛋白(IAP)抑制剂的抑制剂、插入抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、雷帕霉素抑制剂的哺乳动物靶标、微RNA、促分裂原激活的细胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非类固醇抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类胡萝卜素植物生物碱、小的抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂等，以及这些试剂中的一种或多种的组合。

BiTE抗体是通过同时结合两个细胞来指导T细胞攻击癌细胞的双特异性抗体。然后，T细胞攻击靶癌细胞。BiTE抗体的实例包括阿德木单抗(Micromet MT201)、兰妥莫单抗(Micromet MT103)等。不受理论的限制，T细胞引发靶癌细胞凋亡的机制之一是通过对包括穿孔素和颗粒酶B的溶细胞性颗粒组分的胞吐作用。

siRNA是具有内源RNA碱基或化学修饰的核苷酸的分子。修饰不会消除细胞活性，而是赋予增加的稳定性和/或增加的细胞效力。化学修饰的实例包括硫代磷酸酯基团、2'-脱氧核苷酸、含2'-OCH₃的核糖核苷酸、2'-F-核糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核糖核苷酸、其组合等。siRNA可以具有变化长度(例如10-200bps)和结构(例如发夹、单链/双链、凸起、缺口/空隙、错配)，并在细胞中加工以提供活性基因沉默。双链siRNA(dsRNA)在每条链(平端)或不对称末端(突出端)上可以具有相同数目的核苷酸。1-2个核苷酸的突出端可以存在于有义和/或反义链上，以及存在于给定链的5'-和/或3'-端上。

多价结合蛋白是包括两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。将多价结合蛋白工程化为具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两种或更多种相关或不相关靶标的结合蛋白。双可变结构域(DVD)结合蛋白是包括两种或更多种抗原结合位点的四价或多价结合蛋白结合蛋白。这样的DVD可以是单特异性的(即，能够结合一种抗原)或多特异性的(即，能够结合两种或更多种抗原)。包括两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包括重链DVD多肽、轻链DVD多肽和两个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点共有6个CDR参与抗原结合。

烷基化剂包括但不限于六甲蜜胺、AMD-473、AP-5280、阿帕奇醌(apaziquone)、苯达莫司汀、溴他利星(brostallicin)、白消安、卡波醌、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、(拉罗莫司汀，VNP 40101M)、环磷酰胺、达卡巴嗪、雌莫司汀、福莫司汀、葡膦酰胺、异环磷酰胺、KW-2170、洛莫司汀(CCNU)、马磷酰胺、美法仑、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、尼莫司汀、氮芥N-氧化物、雷莫司汀、替莫唑胺、塞替派、(苯达莫司汀)、曲奥舒凡和曲磷胺。

血管生成抑制剂包括但不限于内皮特异性受体酪氨酸激酶(Tie-2)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGF)抑制剂、δ样配体4(DLL4)抑制剂、胰岛素生长因子2受体(IGFR-2)抑制剂、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抑制剂、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抑制剂、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)抑制剂、血小板应答蛋白类似物和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂。

抗体药物缀合物包括但不限于靶向以下的那些：c-Met激酶(例如，在美国专利号7,615,529中描述的ADC)、LRRC15、CD30(例如，(维布妥昔单抗))、CS1(例如，在美国公开号20160122430中描述的ADC)、DLL3(例如，rovalpituzumab tesirine(ROVA-T))、HER2(例如，(恩特曲妥珠单抗))、EGFR(例如，在美国公开号20150337042中描述的ADC)以及催乳素受体(例如，在美国公开号20140227294中描述的ADC)。

抗代谢物包括但不限于(培美曲塞二钠，LY231514，MTA)、5-阿扎胞苷、(卡培他滨)、卡莫氟、(克拉立滨)、氯法拉滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)、胞嘧啶阿糖胞苷、地西他滨、去铁胺、去氧氟尿苷、依氟鸟氨酸、EICAR(5-乙炔基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺)、依诺他滨、乙炔基胞苷(ethnylcytidine)、氟达拉滨、单独或与亚叶酸结合的5-氟尿嘧啶、(吉西他滨)、羟基脲、(美法仑)、巯嘌呤、6-巯嘌呤核糖苷、甲氨蝶呤、麦考酚酸、奈拉滨、诺拉曲特、十八烷基磷酸钠酯(ocfosfate)、吡利曲索、喷司他丁、雷替曲塞、利巴韦林、triapine、三甲曲沙、S-I、噻唑呋林、替加氟、TS-1、阿糖腺苷、UFT等。

抗病毒剂包括但不限于利托那韦、阿昔洛韦、西多福韦、更昔洛韦、膦甲酸、齐多夫定、利巴韦林和羟氯喹。

极光激酶抑制剂包括但不限于ABT-348、AZD-1152、MLN-8054、VX-680、极光A特异性激酶抑制剂、极光B特异性激酶抑制剂和泛极光激酶抑制剂。

Bcl蛋白抑制剂包括但不限于ABT-263(那维克拉)、AT-101((-)棉酚)、(G3139或奥利美生(Bcl-2-靶向反义寡核苷酸))、IPI-194、IPI-565、N-(4-(4-((4'-氯(1,1'-联苯基)-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(二甲基氨基)-1-((苯基硫烷基)甲基)丙基)氨基)-3-硝基苯磺酰胺)、N-(4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己-1-烯-1-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(吗啉-4-基)-1-((苯基硫烷基)甲基)丙基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯磺酰胺、维奈托克(venetoclax)、GX-070(obatoclax)等。

Bcr-Abl激酶抑制剂的实例包括但不限于(BMS-354825)和(伊马替尼)等。

BTK抑制剂包括但不限于依鲁替尼(ibrutinib)和阿卡替尼(acalabrutinib)。

CDK抑制剂包括但不限于AZD-5438、BMI-1040、BMS-032、BMS-387、CVT-2584、flavopyridol、GPC-286199、MCS-5A、PD0332991、PHA-690509、塞利西利(CYC-202、R-罗斯科维汀(R-roscovitine))、阿贝西利(abemaciclib)、帕博西尼(palbociclib)和ZK-304709。

COX-2抑制剂包括但不限于ABT-963、(依托考昔)、(伐地考昔)、BMS347070、(塞来昔布)、COX-189(芦米考昔)、CT-3、(地拉考昔)、JTE-522、4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰基苯基-1H-吡咯)、MK-663(依托考昔)、NS-398、帕瑞考昔、RS-57067、SC-58125、SD-8381、SVT-2016、S-2474、T-614和(罗非考昔)。EGFR抑制剂包括但不限于ABX-EGF、抗EGFR免疫脂质体、EGF疫苗、EMD-7200、(西妥昔单抗)、HR3、IgA抗体、(吉非替尼)、(厄洛替尼或OSI-774)、(奥希替尼(osimertinib))、TP-38、EGFR融合蛋白和(拉帕替尼)。

ErbB2受体抑制剂包括但不限于CP-724-714,CI-1033(卡纽替尼)、(曲妥珠单抗)、(拉帕替尼)、(2C4,珀妥珠单抗)、TAK-165、GW-572016(ionafarnib)、GW-282974、EKB-569、PI-166、dHER2(HER2疫苗)、APC-8024(HER-2疫苗)、抗HER/2neu双特异性抗体、B7.her2IgG3、AS HER2三官能双特异性抗体、mAB AR-209以及mAB 2B-1。

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂包括但不限于缩酚酸肽、LAQ-824、MS-275、trapoxin、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、TSA和丙戊酸。

HSP-90抑制剂包括但不限于17-AAG-nab、17-AAG、CNF-101、CNF-1010、CNF-2024、17-DMAG、格尔德霉素、IPI-504、KOS-953、(对HSP-90的人重组抗体)、NCS-683664、PU24FCl、PU-3、根赤壳菌素(radicicol)、SNX-2112、STA-9090和VER49009。

凋亡蛋白的抑制剂包括但不限于HGS1029、GDC-0145、GDC-0152、LCL-161和LBW-242。

死亡受体途径的激活剂包括但不限于TRAIL、靶向TRAIL或死亡受体的抗体或其他试剂(例如DR4和DR5)，诸如Apomab、conatumumab、ETR2-ST01、GDC0145(来沙木单抗)、HGS-1029、LBY-135、PRO-1762和曲妥珠单抗。

驱动蛋白抑制剂包括但不限于Eg5抑制剂，诸如AZD4877、ARRY-520；和CENPE抑制剂，诸如GSK923295A。

JAK-2抑制剂包括但不限于CEP-701(来他替尼(lesaurtinib))、XL019和INCB018424。

MEK抑制剂包括但不限于ARRY-142886、ARRY-438162、PD-325901和PD-98059。

mTOR抑制剂包括但不限于AP-23573、CCI-779、依维莫司、RAD-001、雷帕霉素、坦罗莫司(temsirolimus)、ATP竞争性TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103、PP242、PP30和Torin 1。

非类固醇抗炎药包括但不限于括(双水杨酸酯(salsalate))、(二氟尼柳)、(布洛芬)、(酮洛芬)、(萘丁美酮)、(吡罗昔康)、布洛芬乳膏、(萘普生)和(萘普生)、(双氯芬酸)、(消炎痛(indomethacin))、(舒林酸)、(托美丁)、(依托度酸)、(酮咯酸)和(奥沙普秦)。

PDGFR抑制剂包括但不限于C-451、CP-673和CP-868596。

铂化疗剂包括但不限于顺铂、(奥沙利铂)艾铂、洛铂、奈达铂、(卡铂)、沙铂和吡铂。

Polo类激酶抑制剂包括但不限于BI-2536。

磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于渥曼青霉素、LY294002、XL-147、CAL-120、ONC-21、AEZS-127、ETP-45658、PX-866、GDC-0941、BGT226、BEZ235和XL765。

血小板应答蛋白类似物包括但不限于ABT-510、ABT-567、ABT-898和TSP-1。

VEGFR抑制剂包括但不限于ABT-869、AEE-788、ANGIOZYME^TM(一种抑制血管生成的核酶(核酶药物(Boulder,Colo.)和Chiron(Emeryville，CA.))、阿昔替尼(AG-13736)、AZD-2171、CP-547,632、(雷莫芦单抗)、IM-862,(pegaptamib)、(索拉非尼(sorafenib)，BAY43-9006)、帕唑替尼(GW-786034)、伐他拉尼(PTK-787、ZK-222584)、(舒尼替尼，SU-11248)、(瑞戈非尼)、VEGF捕获剂和ZACTIMA^TM(凡德他尼，ZD-6474)。

抗生素包括但不限于插层抗生素阿柔比星、放线菌素D、氨柔比星、蒽环霉素(annamycin)、阿霉素、(博来霉素)、柔红霉素、或(脂质体多柔比星)、依沙芦星、表柔比星、glarbuicin、(伊达比星)、丝裂霉素C、奈柔比星、新制癌菌素、培洛霉素、吡柔比星、蝴蝶霉素、stimalamer、链佐星、(戊柔比星)和净司他丁。

拓扑异构酶抑制剂包括但不限于阿柔比星、9-氨基喜树碱、氨萘非特、安吖啶、巴特卡令、贝洛替康、BN-80915、(伊立替康盐酸盐)、喜树碱、(右旋丙亚胺)、二氟替康、艾特咔林、或(表柔比星)、依托泊苷、依沙替康、10-羟基喜树碱、吉马替康、勒托替康、米托蒽醌、Onivyde^TM(脂质体伊立替康)、pirarbucin、orathecin、匹杉琼(pixantrone)、卢比替康、索布佐生、SN-38、他氟泊苷和拓泊替康。

抗体包括但不限于(贝伐珠单抗)、CD40-特异性抗体、chTNT-1/B、地舒单抗、(西妥昔单抗)、(扎木单抗)、IGF1R-特异性抗体、林妥珠单抗、OX-40特异性抗体、(依决洛单抗)、(WX G250)、(利妥昔单抗)、替西木单抗(ticilimumab)、曲妥珠单抗、珀妥珠单抗、(帕木单抗)和CD20I和II型抗体。

激素疗法包括但不限于(阿那罗唑)、(依西美坦)、阿佐昔芬、(比卡鲁胺)、(西曲瑞克)、地加瑞克、地洛瑞林、(曲洛司坦)、地塞米松、(氟他胺)、(雷洛昔芬)、AFEMA^TM(法罗唑)、(托瑞米芬)、(氟维司群)、(来罗唑)、福美坦、糖皮质激素、(度骨化醇)、(碳酸司维拉姆)、拉索昔芬、醋酸亮丙瑞林、(甲地孕酮)、(米非司酮)、NILANDRON^TM(尼鲁米特)、(柠檬酸他莫昔芬)、PLENAXIS^TM(阿巴瑞克)、泼尼松、(非那雄胺)、rilostane、(布舍瑞林)、(促黄体素释放激素(LHRH))、(Histrelin植入物)、(曲洛司坦或modrastane)、(fosrelin、戈舍瑞林)。

三角肌和类视黄醇包括但不限于西奥骨化醇(EB1089、CB1093)、来沙骨化醇(KH1060)、芬维A胺、(阿利维A酸)、(脂质体维A酸)、(贝沙罗汀)和LGD-1550。

PARP抑制剂包括但不限于ABT-888(维立帕利)、KU-59436、AZD-2281(奥拉帕利)、AG-014699(芦卡帕利)、MK4827(niraparib)、BMN-673(talazoparib)、伊尼帕利、BSI-201、BGP-15、INO-1001和ONO-2231。

植物生物碱包括但不限于长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨。

蛋白酶体抑制剂包括但不限于(硼替佐米)、(卡非佐米)、MG132、NPI-0052和PR-171。

免疫药的实例包括但不限于干扰素、免疫检查点抑制剂、共刺激剂和其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、(干扰素γ-1b)或干扰素γ-n1，其组合等。免疫检查点抑制剂包括靶向PD-L1的抗体(例如德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、MEDI4736、MSB0010718C和MPDL3280A)和CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4；例如伊匹木单抗、曲美木单抗)。共刺激剂包括但不限于针对CD3、CD40、CD40L、CD27、CD28、CSF1R、CD137(例如，乌瑞芦单抗)、B7H1、GITR、ICOS、CD80、CD86、OX40、OX40L、CD70、HLA-DR、LIGHT、LIGHT-R、TIM3、A2AR、NKG2A、KIR(例如，lirilumab)、TGF-β(例如，非苏木单抗)及其组合的抗体。

其他药剂包括但不限于(IFN-α)、BAM-002(氧化的谷胱甘肽)、(他索纳明)、(托西莫单抗)、(阿仑珠单抗)、达卡巴嗪、地尼白介素、依帕珠单抗、(来格司亭)、香菇多糖、白细胞α干扰素、咪喹莫德、黑素瘤疫苗、米妥莫单抗、莫拉司亭、MYLOTARG^TM(吉妥珠单抗奥加米星)、(非格司亭)、OncoVAC-CL、(奥戈伏单抗)、pemtumomab(Y-muHMFG1)、(sipuleucel-T)、沙格司亭(sargaramostim)、裂裥多糖(sizofilan)、特西白介素、(Bacillus Calmette-Guerin)、乌苯美司、Z-100(Maruyama的特异性物质(SSM))、WF-10(Tetrachlorodecaoxide(TCDO))、(阿地白介素)、(胸腺法新)、(达克珠单抗高产法)和(90Y-替伊莫单抗)。

生物应答调节剂是调节活生物体的防御机制或生物应答，诸如组织细胞的存活、生长或分化)以指导它们具有抗肿瘤活性的试剂，并且包括但不限于云芝胞内多糖(krestin)、香菇多糖、西佐喃、毕西巴尼(picibanil)PF-3512676(CpG-8954)和乌苯美司。

嘧啶类似物包括但不限于阿糖胞苷(ara C或阿拉伯糖苷C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、去氧氟尿苷、(氟达拉滨)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、氟尿苷、(吉西他滨)、(ratitrexed)和TROXATYL^TM(三乙酰尿苷曲沙他滨)。

嘌呤类似物包括但不限于(硫代鸟嘌呤)和(巯嘌呤)。

抗有丝分裂剂包括但不限于巴他布林、埃坡霉素D(KOS-862)、N-(2-(((4-羟苯基)氨基)吡啶-3-基)-4-甲氧基苯磺酰胺、伊沙匹隆(BMS 247550)、(紫杉醇)、(多西他赛)、PNU100940(109881)、帕妥匹隆、XRP-9881(拉罗他赛)、长春氟宁和ZK-EPO(合成埃博霉素)。

泛素连接酶抑制剂包括但不限于MDM2抑制剂，诸如nutlins和NEDD8抑制剂诸如MLN4924。

重组DC和相关组合物还可以用于增强辐射治疗的功效。放射治疗的实例包括外部束辐射治疗、内部辐射治疗(即近距离辐射治疗)和全身辐射治疗。

重组DC和相关组合物可以与以下其他化学治疗剂辅助或一起给药：诸如ABRAXANE^TM(ABI-007)、ABT-100(法尼基转移酶抑制剂)、(Ad5CMV-p53疫苗)、或(洛伐他汀)、(聚I:聚C12U、合成RNA)、(依昔舒林)、(帕米膦酸)、阿格拉宾(arglabin)、L-天冬酰胺酶、阿他美坦(1-甲基-3,17-二酮-雄甾-1,4-二烯)、(他扎罗汀)、AVE-8062(考布他汀(combreastatin)衍生物)BEC2(米妥莫单抗)、恶病质素或cachexin(肿瘤坏死因子)、canvaxin(疫苗)、(癌症疫苗)、(西莫白介素)、(组胺二盐酸盐)、(人乳头瘤病毒)、(C:(环磷酰胺)；(羟基多柔比星)；O:长春新碱P:泼尼松)、CYPAT^TM(醋酸环丙孕酮)、combrestatin A4P、DAB(389)EGF(通过His-Ala接头与人表皮生长因子融合的白喉毒素的催化和易位结构域)或反式MID-107R^TM(白喉毒素)、达卡巴嗪、放线菌素、5,6-二甲基呫吨酮-4-醋酸(DMXAA)、恩尿嘧啶、EVIZON^TM(角鲨胺乳酸盐)、(T4N5脂质体洗剂)、圆皮海绵内酯、DX-8951f(依沙替康甲磺酸盐)、恩扎妥林(enzastaurin)、EPO906(epithilone B)、(四价人乳头瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗)、GMK(神经节苷脂缀合物疫苗)、(前列腺癌疫苗)、卤夫酮、组氨瑞林、羟基脲、伊班膦酸、IGN-101、IL-13-PE38、IL-13-PE38QQR(cintredekin besudotox)、IL-13-假单胞菌外毒素、干扰素-α、干扰素-γ、JUNOVAN^TM或MEPACT^TM(米法莫肽)、氯那法尼、5,10-亚甲基四氢叶酸、米替福新(十六烷基磷酸胆碱)、(AE-941)、(葡醛酸三甲曲沙(trimetrexateglucuronate))、(喷司他丁)、(a核糖核酸酶)、(黑素瘤疫苗治疗)、(IL-2疫苗)、ORATHECIN^TM(卢比替康)、(基于抗体的细胞药物)、MAb(鼠单克隆抗体)、紫杉醇、PANDIMEX^TM(来自人参的苷元皂苷(aglycone saponin)，包括20(S)原人参萜二醇(aPPD)和20(S)原人参萜三醇(aPPT))、帕木单抗、(研究性癌症疫苗)、培门冬酶、PEG干扰素A、脱氢雌马酚(phenoxodiol)、丙卡巴肼、瑞马司他、(卡妥索单抗)、(来那度胺)、RSR13(乙法昔罗)、LA(兰瑞肽)、(阿维A)、星孢菌素(链霉菌属星形孢子)、他波司他(PT100)、(贝沙罗汀)、(DHA-紫杉醇)、(canfosfamide、TLK286)、temilifene、(替莫唑胺)、替米利芬、沙利度胺、(STn-KLH)、thymitaq(2-氨基-3,4-二氢-6-甲基-4-氧-5-(4-吡啶基硫代)盐酸喹唑啉)、TNFERADE^TM(腺载体：包含肿瘤坏死因子-α基因的DNA载体)、或(波生坦)、维A酸(维生素A酸)、粉防己碱、(三氧化二砷)、ukrain(来自大白屈菜植物的生物碱的衍生物)、vitaxin(抗αvβ3抗体)、(莫特沙芬钆)、XINLAY^TM(阿曲生坦)、XYOTAX^TM(紫杉醇poliglumex)、(曲贝替定)、ZD-6126、(右雷佐生)、(唑仑膦酸)和佐柔比星，以及这些药剂中的任何的组合。

试剂盒

另外，可以在试剂盒中提供这些重组树突状细胞组合物的某些组分或实施方式。例如，将重组树突状细胞组合物以及自体或其他肿瘤细胞裂解物组合物中的任何一种冷冻地或包装地提供为试剂盒，单独地或与与来自预调理或后调理步骤的其他试剂中的任何一种的单独的容器以及使用说明书一起。

一些实施方式还涉及试剂盒中的前述细胞组合物中的任何一种。在一些实施方式中，试剂盒可以包括安瓿、一次性注射器、胶囊、小瓶、管等。在一些实施方式中，试剂盒可以包括单剂量容器或多剂量容器，所述单剂量容器或多剂量容器包括本文实施方式的局部制剂。在一些实施方式中，每个剂量容器可以包含一个或多个单位剂量。在一些实施方式中，试剂盒可以包括施用器。在一些实施方式中，试剂盒包括调理/治疗阶段所需的所有组分。在一些实施方式中，细胞组合物可以具有防腐剂或不含防腐剂(例如在单次使用的容器中)。在一些实施方式中，可以制备表达CD40L、CXCL13或CD93中的任何一种或多种的重组树突状细胞组合物并将其在不成熟阶段冷冻，以适合于运送到医院或治疗中心。在一些实施方式中，可以制备用于负载自体或例如源自细胞系诸如DDM-1.7、DDM-1.13或其组合的黑素瘤细胞裂解物的抗原，并使用标准方法与重组树突状细胞组合物分开冷冻，使得可以将这些组合物运送到医院或治疗中心以进一步处理和向患者给药。在又进一步的实施方式中，可以制备表达CD40L、CXCL13或CD93中的任何一种或多种的重组树突状细胞组合物，并与期望的自体或例如源自细胞系诸如DDM-1.7、DDM-1.13或其组合的黑素瘤细胞裂解物混合，以促进用肿瘤抗原负载树突状细胞组合物，其后可以将这些混合物冷冻，使得将这些组合物运送到医院或治疗中心，以进一步加工和向患者给药。

另外，在某些患者中，预期将定期重复方法或治疗方案中的任何一种以增强免疫系统对肿瘤或感染剂的应答。只要患者需要，这样的定期治疗的范围可以是每周、每月一次、至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次或每7个月一次，或每8个月一次，或每9个月一次，或每10个月一次，或每11个月一次，或每年一次以维持治疗。

治疗概述

在一些实施方式中，用CD40L和CXCL13转导alloDC，以最大化吸引患者的T细胞和B细胞，并生成抗肿瘤细胞和体液免疫应答的级联。

在任选的进一步的实施方式中，用CD93转导CD40L+和CXCL13+alloDC还促进同种异体DC与宿主DC之间的交叉传达(cross-talk)，从而生成稳定且持续的宿主抗肿瘤免疫原性。

在其肿瘤能够被活检或切除的患者中，对切除的肿瘤样品和活检样品的蛋白质表达谱进行筛选。如果表达谱表明至少有3个片段与GMP-MCV共享，则在DC体外成熟之前，用GMP-MCV(同种异体或“一般性的”肿瘤裂解物)负载重组imDC。

对于其样品缺乏与同种异体/一般性的裂解物共享的任何肿瘤片段的患者，产生自体肿瘤裂解物，并将肿瘤裂解物呈递给未成熟重组alloDC，以用于加工自体肿瘤裂解物并由重组未成熟alloDc呈递。

对于任何不可切除且不可活检的患者，重组CD40L+CXCL13+alloDC(或任选地进一步包括CD93+)细胞组合物将在无抗原负载的情况下作为免疫佐剂向患者给药。使用这种CD40L+CXCL13+(任选的)CD93 AlloDC方式，晚期癌症患者可以通过快速、有效和低成本的治疗增加对肿瘤新抗原的新抗肿瘤细胞和体液免疫应答，并增强现有的免疫应答。

这些选项的概述如下：

选项1：筛选切除的肿瘤样品和活检样品的蛋白质表达谱，以与MelCancerVac(MCV)肿瘤裂解物表达谱进行交叉匹配。如果表达谱表明至少3个与GMP-MCV肿瘤裂解物相同的片段，则可以对患者使用一般性的产品，MCV肿瘤裂解物冲击的增强/激活重组同种异体DC疫苗(alloDC/MCV肿瘤裂解物)。

选项2：如果蛋白质表达谱与MCV裂解物谱不匹配，则将自体肿瘤裂解物呈递给未成熟重组alloDC，以使其在体外冲击后成熟。

选项3：对于不可切除和不可活检患者，可以将CD40L+CXCL13(以及任选地CD93)重组alloDC在不进行抗原冲击或激活的情况下作为免疫佐剂给药。

制备重组DC细胞的选项是使用重组腺病毒载体/CRISPR Cas9而不是慢病毒载体或逆转录病毒载体将CD40L和CXCL13转导至纯化的人CD14+单核细胞中。将评估转导的单核细胞的转导效率和功能，包括迁移、分化和细胞因子分泌，以确保重组/转基因单核细胞可以分化为功能性DC和免疫原性DC。

出于多种原因，使用腺病毒(AdV)是有益处的，包括对许多细胞类型(包括与它们的有丝分裂状态无关的造血起源细胞)具有高转导效率。其他好处是复制缺陷型AdV已在临床上证明了其安全性。此外，AdV可以提供高水平的转基因表达，并且AdV转导的DC可以有效地呈递抗原蛋白。重组腺病毒载体可以成功转染未成熟DC，效率达到95％。(参见：LeiZhong,et al.Eur.J.Immunol.1999.29:964-972.)然而，预期可以利用其他病毒载体系统，包括慢病毒载体。(参见，commercial sources such as Vectalys(Toulouse France)andrelated methods in U.S.Patent No.10,272,111)。

趋化因子(C-X-C基序)配体13(CXCL13)，也称为B淋巴细胞趋化因子(BLC)或B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)，是由CXCL13基因编码的人中的蛋白质配体。CXCR5是CXCL13的受体。趋化因子表达启动淋巴细胞募集和刺激的正向环。肠上皮细胞中过表达的CXCL13促进固有层中的B细胞数目的显著增加以及小肠中淋巴滤泡的大小和数目的增加。(参见，F.Marchesi et al.Mucosal Immunology.2009.2(6):486-494.)

这些结果表明在炎症条件期间肠中CXCL13的过表达有利于B细胞以及具有免疫调节和修复功能的LTi和NK细胞的动员。

CD40配体(CD40L)，也称为CD154，是一种作为分子的TNF超家族成员的蛋白质。它与抗原呈递细胞(APC)上的CD40结合，取决于靶细胞类型，将导致许多作用。CD40L总共具有三个结合伴侣：CD40、α5β1整联蛋白和αIIbβ3。CD154充当共刺激分子，并在称为T滤泡辅助性细胞(TFH细胞)的T细胞亚群上尤其重要。在TFH细胞上，CD40L通过将CD40接合在B细胞表面上来促进B细胞成熟和功能，以及因此促进细胞之间的通讯。CD40L稳定表达允许DC产生IL-12来克服免疫抑制并触发记忆T细胞分化。

CD93是在造血系统内在髓系谱系的细胞上选择性表达的约120kDa的O-唾液酸糖蛋白。它的主要结构和功能直到最近才为人所知。利用逆转录病毒表达克隆以分离CD93cDNA。序列分析显示，CD93与人类吞噬细胞上称为C1q受体(C1qRp)的蛋白质相同。先前示出C1qRp介导单核细胞吞噬作用的增强，并被认为是C1q和两个其他结构相关分子的受体。研究CD93转导子和对照细胞时，发现表达CD93的细胞具有增强的与C1q结合能力。此外，示出未成熟树突状细胞(DC)表达CD93/C1qRp，而已知具有降低的抗原摄取能力并已失去吞噬的能力的成熟DC则显示弱至阴性的CD93/C1qRp表达。

用作本文提供的异源蛋白质转导的细胞来源的细胞可以是任何供体。在一些实施方式中，筛选供体以建立从供体分离的细胞将被认为相对于其给药的受试者是同种异体的。在一些实施方式中，供体筛选标准可以包括供体人口统计学，包括：供体年龄、供体性别、供体种族、供体ABO/Rh；供体BMI(体重和身高)、供体HLA高分辨率分型。

另外，在一些实施方式中，供体样品可以在白细胞去除术材料(或任何来源的材料)上进行全盘输血(FDA)测试，包括：CMV测试；梅毒血清学检测和抗体筛查；以及包括以下测试中的一项或多项的传染病组：乙型肝炎核心抗体(Anti-HBs EIA)；乙型肝炎表面抗原(HBsAg EIA)；丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV EIA)；人类免疫缺陷病毒抗体(HIV1/2加O)；人T淋巴细胞病毒抗体(HTLV-I/II)；HIV-1/HGV/HBV核酸检测；WNV核酸检测；克氏锥虫抗体；和寨卡。因此，在一些实施方式中，供体细胞或向患者给药的细胞源自无CMV、梅毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV-I/II、西尼罗河病毒(WNV)、克氏锥虫和/或寨卡的供体。

可以评估样品的单核细胞百分比，并通过血液分析仪和流式细胞术计数。

可以通过单采术(apheresis)或通过全血收集来收集样品，并进行标准检查。在某些情况下，将通过Optia白细胞分离术收集进行收集。将分析样品的生存力和CD14+％，并且对CD14+单核细胞进行计数。

根据标准程序，使用CliniMACS进行单核细胞阴性分离是另一种选择。

分离后纯度和细胞计数

在一些实施方式中，用包括CD40L和CXCL13(以及对于某些实施方式CD40L、CXCL13和CD93)的腺病毒载体转染纯化的单核细胞。

在一些实施方式中，用包括CD40L和CXCL13(以及对于某些实施方式CD40L、CXCL13和CD93)的慢病毒载体转染纯化的单核细胞。

暴露于病毒载体后，可以选择阳性转导的单核细胞。例如，可以使用以下一种或多种阳性或阴性标记物选择细胞：阴性谱系(CD3-、CD56-、CD19-、CD66b-)、CD45+、CD14+,CD40L+、CXCL13+、CD1c+、CD11b+、CD11c+、HLA-DR+、CD86+、CD80低、CD83-、CD16低、CD33+、CD163-、CD206+或CD209。

在某些情况下，将在阳性分选之前评估细胞的转导效率，使得可以计算产量。需要转导效率/转导效率用于确定CD40L+CXCL13+或CD40L+CXCL13+CD93+单核细胞的预期产量。

如本文所提供的，细胞可以是单核细胞，其可以体外分化成未成熟树突状细胞。在一些实施方式中，将细胞(转导的或非转导的)离心以分离细胞。细胞可以例如在室温下(RT)以400x g低破碎下离心10分钟。可以将离心的细胞与其上清液分离。可以用X-VIVO15、重组人GM-CSF，诸如(1000单位/ml)和IL-4(1000单位/ml))将离心的细胞重悬于细胞培养瓶中，并可以允许细胞在培养箱中分化单核细胞至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些实施方式中，允许细胞分化约4至约8天。

在一些实施方式中，然后可以从细胞培养基中收集分化的细胞并离心。例如，在一些实施方式中，将细胞培养基从培养瓶收集到离心管中。可以将PBS置于细胞培养瓶中以覆盖瓶的表面。可以将细胞培养瓶与PBS在37℃、5％CO₂培养箱中孵育约30分钟。在一些实施方式中，在温育后通过敲击烧瓶将烧瓶的内容物收集到离心管中。可以冲洗烧瓶并将其收集到离心管中。在一些实施方式中，可以将收集的细胞例如在RT下以400×g在低破碎情况下离心10分钟。离心之后，将细胞与其上清液分离并分离细胞。可以将细胞重悬并分析生存力。

在一些实施方式中，分析样品以进行相关生物标志物的计数和流式细胞术鉴定。它们可以通过以下一种或多种阳性或阴性标记物进行分析或选择：阴性谱系(CD3-、CD56-、CD19-、CD66b-)、CD45+、CD14+,CD40L+、CXCL13+、CD1c+、CD11b+、CD11c+、HLA-DR+、CD86+、CD80低、CD83-、CD16低、CD33+、CD163-、CD206+或CD209。

如本文提供的，可以用病毒载体诸如慢病毒或腺病毒转导单核细胞。可以使用用于病毒转导的任何方案。例如，可以在培养基混合物中培养细胞。在一些实施方式中，培养基包括100ng/mL的mFlt3L/mTPO/mSCF和30ng/mL的mIL-3。例如，可以在这种培养基中培养细胞，然后在37℃且5％CO₂中孵育24小时或直到激活。激活后，可以用PGE2预处理细胞。然后可以用适当的载体转导细胞。在一些实施方式中，以10、100或100的MOI(感染复数)添加病毒。转导后，可以使用例如与由载体编码异源蛋白质中的一种或多种结合的珠子或纯化产物分离细胞。例如，可以在转导过程后使用CD40L微珠(Miltenyi)收集细胞，以纯化表达CD40L的细胞。

在一些实施方式中，为了分化转导的单核细胞，诸如将CD34+慢病毒+转导的细胞分化成CD14+CD16+单核细胞，纯化的CD34+Lv+细胞可以通过在以下扩增培养基中培养1×10⁵CD34⁺个细胞/ml来扩增3-10天：G-Rex 10M(X-VIVO 10培养基；人AB血清10％；rhSCF50ng/ml(R&D系统)；TPO 15ng/ml(R&D系统)；IL-3 30ng/ml(R&D系统)；Flt-3L 30ng/ml(R&D系统)。细胞扩增后(1-10天)，可以将细胞移动到在G-Rex 100M中的分化培养基中，持续14天。分化培养基的一个非限制性实例包括但不限于具有20％的人AB血清的IMDM；SCF 25ng/ml(R&D系统)；M-CSF 30ng/ml(R&D系统)；IL-3 30ng/ml(R&D系统)；以及Flt-3L 30ng/ml(R&D系统)。然后可以将细胞在分化混合物中孵育约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。分化混合物的非限制性实例是RPMI-1640；3％人AB血清；GM-CSF 900IU/ml；IL-4 1000IU/ml；TNFα400IU/ml；以及TGFβ1 0.2ng/ml。分化混合物可以增强单核细胞向未成熟树突状细胞的分化。

在一些实施方式中，为了进一步增强未成熟树突状细胞的成熟，可以将细胞在成熟混合物中孵育。在一些实施方式中，成熟混合物包括抗原、肿瘤裂解物或活肿瘤细胞。本文提供了这些实例。成熟混合物可以包括，例如，GM-CSF 500IU/ml；IL-15 400ng/nl；IFNγ100ng/ml；TNFα2ng/ml；以及PgE2 2mcg/ml。该量仅是示例性的，并且不限于这样的量。因此，在一些实施方式中，成熟组合物(混合物)包括GM-CSF、IL-15、IFNγ、TNFα和/或PgE2。可以将细胞在成熟组合物中孵育约12至约48小时、约20至约40小时、约30至约38小时、约或至少12、16、18、20、24、28、32、36、40、44或48小时。成熟混合物还可以包括TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-γ和/或pIC。

使用这些实施方式中的一种或多种的实验结果在图2A-F中示出，使用CliniMACS分离的CD14+单核细胞的代表性表型分型和纯度评估。

显示未成熟重组DC展现吞噬能力，在图4A-B中示出。对于在图4A-B所示出的结果，通过流式细胞术观察未成熟DC产物对荧光标记的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)颗粒的吞噬作用。图4A是阴性对照；而图4B示出86.13％的产物已经吞噬了荧光标记的大肠杆菌颗粒。使用的测定可以是任何吞噬测定。

另外，图5A-D示出，如通过稀释羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)所表明的，重组DC刺激了同种异体T细胞增殖。对于图5A-D示出的结果，用CFSE标记同种异体T细胞，并与重组alloDC共培养。通过稀释CFSE可以观察到T细胞的增殖。左列(图5A和图5C)示出了在第4天的增殖，以及右列(图5B和图5D)示出了在第7天的增殖。这些结果说明重组alloDC刺激了同种异体T细胞增殖。

本发明组合物和方法的有用方面包括使重组DC建库以提供在当地医院使用一般性的疫苗的能力，从而易于治疗患者。这样的重组DC可以用三种不同的方式处理：1)可以将它们用自体肿瘤裂解物负载，或(2)在其他情况下，可以将它们用MCV肿瘤裂解物(DandritGMP，如果患者肿瘤中≥3个表位存在于MCV抗原库中)或其他市售的同种异体肿瘤裂解物负载；或(3)对于不可切除的肿瘤的情况，可能没有抗原负载。

在重组DC疫苗制备的下一步骤中，用重组人细胞因子(诸如上述那些)的混合物使重组alloDC成熟。

然后，对细胞进行表型分析并进行功能评估(如图4-5所示出的)，以及以评估相关转基因(例如CD40L、CXCL13和CD93)的表达。最后，将重组DC冷冻或更具体地，通常以受控速率冷冻保存进行冷冻保存，然后在解冻后用于临床环境。这样的细胞用作用于治疗癌症、肿瘤和恶性肿瘤的重组DC生物疫苗/免疫佐剂的基础。图9示出了处理、细胞制备和疫苗接种过程的示意图。

在一些实施方式中，将细胞冷冻，这可以称为冷冻保存。例如，可以使用CryoStorCS5(冷冻介质)冷冻细胞。然而，这是冷冻介质的非限制性实例，并且可以使用其他冷冻介质。最初可以将细胞冷藏至4℃。然后可以进一步将细胞冷却至约-20℃。可以将细胞离心或重悬于额外的冷冻介质中，以及然后以逐步的方式冷却至-90℃。然后可以将细胞储存在液氮中。在一些实施方式中，将细胞冷冻在冷冻袋中。

可以通过在37℃水浴中解冻来解冻细胞。在一些实施方式中，在不移动水浴中的细胞的情况下将细胞解冻，没有8字形运动或轻弹。然后可以使细胞与血浆和温热的解冻介质接触。然后可以在向受试者给药之前分析细胞的生存力。本文及以上提供了标记物的实例。

在一些实施方式中，用细胞因子混合物使树突状细胞成熟和/或用自体肿瘤裂解物/MCV负载DC。例如，可以将活的未成熟DC与肿瘤裂解物或MCV与DC细胞一起培养。这可以在如上文所述的成熟混合物或例如包括TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-γ和pIC的组合物的存在下进行。可以将细胞与这种组合物孵育约12至约36小时，诸如或约或至少20、22、24、26、28或30小时。然后可以收集和分析成熟细胞。还可以使用冷冻介质和逐步冷冻方法来冷冻成熟细胞，诸如本文所述的。

如本文所述的，可以将细胞孵育或用肿瘤裂解物负载。可以以任何方式制备肿瘤裂解物。例如，在一些实施方式中，提供(分离、获得、切除等)肿瘤材料。可以在液氮中快速冷冻样品。在一些实施方式中，样品不含非恶性组织。这可能意指在没有任何非恶性组织的情况下，或者已经对样品进行了进一步处理以去除这样的非恶性组织后去除样品。然后可以将样品解冻并快速冷冻1-5次以帮助裂解细胞。可以将裂解物离心并过滤以制备肿瘤裂解物。裂解物可以冷冻保存，例如在-80℃冻结装置中。

现在参考以下实施例描述实施方式。仅出于说明的目的提供这些实施例，并且这些实施方式不应当被解释为限于这些实施例，而应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相似结果的各种非关键参数。

实施例1

患有不可切除的转移性结直肠癌患者

一名男性患者在29岁时被诊断患有结直肠癌，被诊断后即去除了6cm的原发性结直肠肿瘤。该患者选择退出辅助性化疗。该患者在初次外科手术后18个月呈现为原发性肿瘤病变复发，并伴有多处肠系膜和肝转移。由于原发性肿瘤复发(16cm)阻塞了结直肠通道，患者接受了紧急结肠造口术外科手术。在结肠造口术外科手术期间，从患者的原发肿瘤中进行了芯活检。外科手术后三周，患者开始接受用呈现CD40L的自体肿瘤细胞冲击并用成熟混合物使其成熟的同种异体DC，如上文所述的。该患者未接受其他治疗。疫苗剂量时间表是每15天皮下注射1x10⁶个Allo-DC CD40L+负载的细胞。图6A-B是CAT/PET扫描(CT)图像，示出了在Allo-DC CD40L+细胞治疗后的6个月(12次注射)，肿瘤块显著减少。用负载有自体肿瘤细胞的alloDC CD40L+疫苗治疗6个月后，原发性肿瘤从12cm萎缩至17.3mm x 34.5mm(图6B)。这些细胞被转导以表达CD40L，并且预期进一步被CXCL13和任选地CD93转导的alloDC细胞与alloDC CD40L+细胞系一起进一步增大抗肿瘤作用(负载有自体肿瘤)。

实施例2：患有不可切除的转移性结直肠癌的69岁男性

一名男性患者在68岁时被诊断为患有结直肠癌。在诊断后即去除了五厘米(5cm)的原发性结直肠癌。患者接受了6个月的FOLFOX方案。在FOLFOX治疗后的随访评估中，该患者呈现出原发性肿瘤复发，并伴有肝和肺转移。随访后，患者开始接受FOLFIRINOX方案。FOLFIRINOX治疗六个月后，由于原发性肿瘤复发阻塞了结直肠通道，患者接受了紧急结肠造口术外科手术。患者开始接受用成熟混合物使其成熟的呈现CD40L的自体肿瘤冲击的alloDC疫苗，如上所述。

患者在疫苗治疗期间仅接受卡培他滨。疫苗剂量时间表是每15天皮下注射2x10⁶个细胞。图7A-D中的CT/PET图像示出了在负载有自体肿瘤细胞治疗的alloDC CD40L+疫苗后六个月(12次注射)后，肝和肺肿块显著减小。这些细胞被转导以表达CD40L，并且预期进一步被CXCL13和任选地CD93转导的alloDC细胞与alloDC CD40L+细胞系一起进一步增大抗肿瘤作用(负载有自体肿瘤)。

实施例3：患有转移性浸润性导管型乳腺癌的45岁女性

一名女性患者被诊断为HER-2阳性、ER和PR阴性乳腺癌，并且在2008年进行了乳房切除术(T1cN2M0)。该患者接受了TAC治疗6个月并获得缓解。在2010年，PET显示有转移的证据。患者接受吉西他滨、卡铂、曲妥珠单抗(Trastuuzmab)但病情进展。然后患者接受了硼替佐米和拉帕替尼，但病情仍在进展。从2013年开始用ado-恩特曲妥珠单抗的三线治疗直到2015年。肺的病情进展继续。

接下来从2015年8月开始患者接受用曲妥珠单抗和长春瑞滨的第五线治疗，并且由于进展于2016年4月中断。从2016年4月开始用曲妥珠单抗、硼替佐米和艾瑞布林(eribulin)的第六线治疗，并且由于进展而于2016年7月中断。从2017年7月开始用ado-恩特曲妥珠单抗和pablociclib治疗，并且由于进展而于2018年1月中断。从2017年1月至2017年8月，给予用氟维司群、曲妥珠单抗和哌柏西利(pablociclib)的第八线治疗，并且由于进展而中断。

该患者在2017年10月被诊断为患有脑转移，并进行了右脑开颅术，并且通过立体定向放射外科手术治疗了全部5个脑病灶。该患者当时未接受任何其他脑部治疗。该患者于2018年2月开始接受曲妥珠单抗、伊沙匹隆和卡培他滨治疗，并由于进展而于2018年4月中断治疗。该患者于2018年8月接受了全脑辐射治疗，使得身体上适合接受免疫治疗。该患者在2018年9月进行支气管镜肿瘤活检之前接受过继细胞治疗作为初始治疗。

患者于2018年9月开始接受自体肿瘤细胞冲击的用成熟混合物使所述alloDC成熟的表达CD40L和CXCL13的alloDC，如本文所述的。接种剂量为皮下注射(sub-Q)10⁶个细胞。疫苗时间表如下：每7天注射#1-#4、每10天注射#5-#8、每15天注射#9-#12(总共在130天下进行12次sub-Q注射)。图8A-D的CT和PET/CT图像示出了用自体肿瘤细胞冲击的alloDCCD40L+CXCL13+细胞治疗后一个月，肺病灶显著减小。

参见在下图10-12中示出的协同的体外结果，这些细胞被转导以表达CD40L和CXCL13，并且预期alloDC细胞进一步被CD93转导，与alloDC CD40L+CXCL13+细胞系一起进一步增大抗肿瘤作用(负载有自体肿瘤)。

实施例4：体外测试

T细胞增殖(图10)

将从乳腺癌患者获得的肿瘤裂解物用于产生使用表达CD40L+CXCL13+CD93或CD40L+CXCL13或仅CD40L的慢病毒基因修饰的成熟DC。然后将成熟allo-DC(2x10⁴)在补充有500IU/ml IL-2(R&D系统)的TexMACS(Miltenyi)培养基中一式三份共培养外周血CD3+T细胞(1x10⁶)。接种后48小时，通过流式细胞术(CD86和CD1a)测量allo-DC的持久性。在每种条件下，共培养48h均未检测到活的allo-DC。

NK细胞增殖(图11)

将从乳腺癌患者获得的肿瘤裂解物用于产生使用表达CD40L+CXCL13+CD93或CD40L+CXCL13或仅CD40L的慢病毒基因修饰的成熟DC。然后将成熟allo-DC(1x10⁴)在存在500IU/ml IL2的NK细胞培养基(Miltenyi)中一式三份地共培养外周血CD16+CD56+NK细胞(5x10⁵)。接种后48小时，通过流式细胞术(CD86和CD1a)测量allo-DC的持久性。在每种条件下，共培养48h均未检测到活的allo-DC。

B细胞激活(图12)

将从乳腺癌患者获得的肿瘤裂解物用于产生使用表达CD40L+CXCL13+CD93或CD40L+CXCL13或仅CD40L的慢病毒基因修饰的成熟DC。然后将成熟allo-DC(1x10⁴)在具有％5人AB血清和1mM glutamax的RPMI 1640培养基中一式三份共培养外周血CD19+B细胞(2.5x10⁵)。通过确定第4天CD19+细胞中CD69表达水平的流式细胞术来检测B细胞的激活水平。

来自图10-12的结果示出了在重组DC上共表达全部三种受体的协同作用。在图10中，T细胞增殖被用作替代指标，以指示对重组DC的增加的细胞免疫应答。对于三重重组DC(CD40L+CXCL13+和CD93)，示出T细胞增殖的增加最大。同样，在图11中，与重组DC共培养的NK(天然杀伤)细胞增殖被用作体内增加细胞免疫应答的另一种替代指标。类似地，在图11中，对于三重构建体，示出NK细胞增殖的增加最大。最后，在图12中，共培养中B细胞的激活水平被用作体内B细胞激活的替代指标。通过分析第4天共培养细胞中CD19+细胞中的CD69表达来确定B细胞激活。在这些共培养物中，三重重组DC(CD40L+CXCL13+和CD93)也表现出最高水平的CD69+表达，类似地指示激活了体液免疫系统。

标准方法

分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&19892^nd Edition,2001 3^rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社，冷泉港,纽约；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3^rd ed.,冷泉港实验室出版社，冷泉港,纽约；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州)。标准方法也出现在Ausbel,et al.(2001)Current Protocols inMolecular Biology,Vols.1-4,约翰威利父子公司，纽约，纽约,which describes cloningin bacterial cells and DNA mutagenesis(Vol.1),cloning in mammalian cells andyeast(Vol.2),glycoconjugates and protein expression(Vol.3),and bioinformatics(Vol.4)。

描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,约翰威利父子公司，纽约)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如，Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,约翰威利父子公司，纽约；Ausubel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,约翰威利父子公司，纽约，纽约,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Productsfor Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan,et al.(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane,supra).用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见例如，Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,纽约)。

本文引用的所有参考文献通过援引并入，其程度就好像每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体地和单独地指示通过援引并入。本参考文献的加入声明旨在申请人根据37C.F.R.§1.57(b)(1)，涉及每一个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其中每一项均按照37C.F.R.§1.57(b)(2)，即使这样的引用与通过援引并入的专用声明并不紧邻。如果有的话，通过援引并入的专用声明涵盖，丝毫不削弱这种通过援引并入的一般性声明。本文引用的参考文献不旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

本发明的范围不受本文描述的具体实施方式的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 伊诺奇安生物制药公司(ENOCHIAN BIOPHARMA, INC.)

<120> 使用重组树突状细胞用于癌症治疗的方法和组合物

<130> 146616.00302

<140>

<141>

<150> 62/698,254

<151> 2018-07-15

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 1

atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60

atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120

ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180

gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240

ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300

aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360

caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420

gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480

ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540

cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600

ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660

caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720

gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780

ctc 783

<210> 2

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 2

atgaagttca tctcgacatc tctgcttctc atgctgctgg tcagcagcct ctctccagtc 60

caaggtgttc tggaggtcta ttacacaagc ttgaggtgta gatgtgtcca agagagctca 120

gtctttatcc ctagacgctt cattgatcga attcaaatct tgccccgtgg gaatggttgt 180

ccaagaaaag aaatcatagt ctggaagaag aacaagtcaa ttgtgtgtgt ggaccctcaa 240

gctgaatgga tacaaagaat gatggaagta ttgagaaaaa gaagttcttc aactctacca 300

gttccagtgt ttaagagaaa gattccc 327

<210> 3

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 3

atggccacct ccatgggcct gctgctgctg ctgctgctgc tcctgaccca gcccggggcg 60

gggacgggag ctgacacgga ggcggtggtc tgcgtgggga ccgcctgcta cacggcccac 120

tcgggcaagc tgagcgctgc cgaggcccag aaccactgca accagaacgg gggcaacctg 180

gccactgtga agagcaagga ggaggcccag cacgtccagc gagtactggc ccagctcctg 240

aggcgggagg cagccctgac ggcgaggatg agcaagttct ggattgggct ccagcgagag 300

aagggcaagt gcctggaccc tagtctgccg ctgaagggct tcagctgggt gggcgggggg 360

gaggacacgc cttactctaa ctggcacaag gagctccgga actcgtgcat ctccaagcgc 420

tgtgtgtctc tgctgctgga cctgtcccag ccgctccttc ccagccgcct ccccaagtgg 480

tctgagggcc cctgtgggag cccaggctcc cccggaagta acattgaggg cttcgtgtgc 540

aagttcagct tcaaaggcat gtgccggcct ctggccctgg ggggcccagg tcaggtgacc 600

tacaccaccc ccttccagac caccagttcc tccttggagg ctgtgccctt tgcctctgcg 660

gccaatgtag cctgtgggga aggtgacaag gacgagactc agagtcatta tttcctgtgc 720

aaggagaagg cccccgatgt gttcgactgg ggcagctcgg gccccctctg tgtcagcccc 780

aagtatggct gcaacttcaa caatgggggc tgccaccagg actgctttga agggggggat 840

ggctccttcc tctgcggctg ccgaccagga ttccggctgc tggatgacct ggtgacctgt 900

gcctctcgaa acccttgcag ctccagccca tgtcgtgggg gggccacgtg cgtcctggga 960

ccccatggga aaaactacac gtgccgctgc ccccaagggt accagctgga ctcgagtcag 1020

ctggactgtg tggacgtgga tgaatgccag gactccccct gtgcccagga gtgtgtcaac 1080

acccctgggg gcttccgctg cgaatgctgg gttggctatg agccgggcgg tcctggagag 1140

ggggcctgtc aggatgtgga tgagtgtgct ctgggtcgct cgccttgcgc ccagggctgc 1200

accaacacag atggctcatt tcactgctcc tgtgaggagg gctacgtcct ggccggggag 1260

gacgggactc agtgccagga cgtggatgag tgtgtgggcc cggggggccc cctctgcgac 1320

agcttgtgct tcaacacaca agggtccttc cactgtggct gcctgccagg ctgggtgctg 1380

gccccaaatg gggtctcttg caccatgggg cctgtgtctc tgggaccacc atctgggccc 1440

cccgatgagg aggacaaagg agagaaagaa gggagcaccg tgccccgtgc tgcaacagcc 1500

agtcccacaa ggggccccga gggcaccccc aaggctacac ccaccacaag tagaccttcg 1560

ctgtcatctg acgcccccat cacatctgcc ccactcaaga tgctggcccc cagtgggtcc 1620

ccaggcgtct ggagggagcc cagcatccat cacgccacag ctgcctctgg cccccaggag 1680

cctgcaggtg gggactcctc cgtggccaca caaaacaacg atggcactga cgggcaaaag 1740

ctgcttttat tctacatcct aggcaccgtg gtggccatcc tactcctgct ggccctggct 1800

ctggggctac tggtctatcg caagcggaga gcgaagaggg aggagaagaa ggagaagaag 1860

ccccagaatg cggcagacag ttactcctgg gttccagagc gagctgagag cagggccatg 1920

gagaaccagt acagtccgac acctgggaca gactgc 1956

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 4

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 5

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 5

Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser

1 5 10 15

Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg

20 25 30

Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile

35 40 45

Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu

50 55 60

Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln

65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro

100 105

<210> 6

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 6

Met Ala Thr Ser Met Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Gln Pro Gly Ala Gly Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val

20 25 30

Gly Thr Ala Cys Tyr Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu

35 40 45

Ala Gln Asn His Cys Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys

50 55 60

Ser Lys Glu Glu Ala Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu

65 70 75 80

Arg Arg Glu Ala Ala Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly

85 90 95

Leu Gln Arg Glu Lys Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys

100 105 110

Gly Phe Ser Trp Val Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp

115 120 125

His Lys Glu Leu Arg Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu

130 135 140

Leu Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp

145 150 155 160

Ser Glu Gly Pro Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu

165 170 175

Gly Phe Val Cys Lys Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala

180 185 190

Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala

210 215 220

Cys Gly Glu Gly Asp Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys

225 230 235 240

Lys Glu Lys Ala Pro Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu

245 250 255

Cys Val Ser Pro Lys Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His

260 265 270

Gln Asp Cys Phe Glu Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg

275 280 285

Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn

290 295 300

Pro Cys Ser Ser Ser Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Val Leu Gly

305 310 315 320

Pro His Gly Lys Asn Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu

325 330 335

Asp Ser Ser Gln Leu Asp Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Gln Asp Ser

340 345 350

Pro Cys Ala Gln Glu Cys Val Asn Thr Pro Gly Gly Phe Arg Cys Glu

355 360 365

Cys Trp Val Gly Tyr Glu Pro Gly Gly Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gln

370 375 380

Asp Val Asp Glu Cys Ala Leu Gly Arg Ser Pro Cys Ala Gln Gly Cys

385 390 395 400

Thr Asn Thr Asp Gly Ser Phe His Cys Ser Cys Glu Glu Gly Tyr Val

405 410 415

Leu Ala Gly Glu Asp Gly Thr Gln Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Val

420 425 430

Gly Pro Gly Gly Pro Leu Cys Asp Ser Leu Cys Phe Asn Thr Gln Gly

435 440 445

Ser Phe His Cys Gly Cys Leu Pro Gly Trp Val Leu Ala Pro Asn Gly

450 455 460

Val Ser Cys Thr Met Gly Pro Val Ser Leu Gly Pro Pro Ser Gly Pro

465 470 475 480

Pro Asp Glu Glu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gly Ser Thr Val Pro Arg

485 490 495

Ala Ala Thr Ala Ser Pro Thr Arg Gly Pro Glu Gly Thr Pro Lys Ala

500 505 510

Thr Pro Thr Thr Ser Arg Pro Ser Leu Ser Ser Asp Ala Pro Ile Thr

515 520 525

Ser Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Pro Ser Gly Ser Pro Gly Val Trp

530 535 540

Arg Glu Pro Ser Ile His His Ala Thr Ala Ala Ser Gly Pro Gln Glu

545 550 555 560

Pro Ala Gly Gly Asp Ser Ser Val Ala Thr Gln Asn Asn Asp Gly Thr

565 570 575

Asp Gly Gln Lys Leu Leu Leu Phe Tyr Ile Leu Gly Thr Val Val Ala

580 585 590

Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Leu Val Tyr Arg Lys

595 600 605

Arg Arg Ala Lys Arg Glu Glu Lys Lys Glu Lys Lys Pro Gln Asn Ala

610 615 620

Ala Asp Ser Tyr Ser Trp Val Pro Glu Arg Ala Glu Ser Arg Ala Met

625 630 635 640

Glu Asn Gln Tyr Ser Pro Thr Pro Gly Thr Asp Cys

645 650