海绵来源杂萜类化合物etherianones及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 海绵来源杂萜类化合物etherianones及其制备方法与应用 (Sponge source heteraianones and preparation method and application thereof ) 是由 焦伟华 林厚文 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,公开了两种海绵来源杂萜类化合物etherianone A和etherianone B,化学结构式如下：本发明还公开了制备上述两种化合物的方法。本发明化合物etherianone A和etherianone B能够在体内抑制转基因斑马鱼的血管生成,etherianone A还对多种肿瘤细胞株具有很强的细胞毒性。这两个化合物可用于抗炎药物和抗肿瘤药物的开发。(The invention relates to the technical field of medicines, and discloses two sponge source diterpenoid compounds, namely, etherianone A and etherianone B, which have the following chemical structural formulas:)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及海绵来源杂萜类化合物etherianones及其制备方法与应用。
背景技术
倔海绵(Dysidea ethria)为海绵属寻常纲(Demospongiae)网角海绵(Dictyoceratida)掘海绵科(Dysideidae)海绵。近半个世纪以来，国内外学者已经对该属海绵中所含的特征倍半萜醌类杂萜类化合物进行了系统的化学成分和生物活性研究，该类型化合物含有一个C15单位的倍半萜片段和一个C6单位的对苯醌或氢醌相连，从而构成了含有21个碳的杂萜骨架，是倔海绵属海绵最重要的一类代谢产物，其多变的重拍骨架和丰富多样的生物活性引起了国内外学者持续的广泛关注。这些杂萜类化合物具有广泛的生物活性，包括抗菌1、抗真菌2、抗肿瘤3、抗氧化4、抗炎5、抗过敏活性6以及PTP1B酶抑制活性7。该类型化合物广泛的生物活性和多变的结构引起了化学家和生物学家的持续关注。
血管生成(angiogenesis)是指在原有的毛细血管基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖，从已存在的血管处形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程8。血管生成是许多促进或抑制血管生成的分子参与调节的一个平衡过程。大量研究表明，血管生成对恶性肿瘤的生长和转移起着至关重要的作用，抑制肿瘤新生血管生成已经成为肿瘤生物靶向治疗的重要研究方向9。天然产物正成为新型血管生成抑制剂的重要来源。
参考文献：
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发明内容
本发明的第一目的在于公开一种海绵来源杂萜类化合物etherianone，化学结构式如下：
本发明的第二目的在于公开所述的海绵来源杂萜类化合物etherianone的制备方法，其包括步骤：
(a)用甲醇冷浸提取海绵，再将提取液浓缩得到浸膏；
(b)将浸膏用水混悬，然后用二氯甲烷或三氯甲烷萃取，萃取液减压浓缩后依次经：
减压硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并含有倍半萜醌类化合物的馏分；
反相中压ODS柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，获得含有倍半萜类化合物的精细馏分；
高效液相色谱法分离，采用95％乙腈水洗脱，得到化合物etherianone。
较佳的，步骤(a)中，海绵样本浸提前先经冷冻并切碎。
较佳的，步骤(b)中，反相中压ODS柱采用的甲醇-水系统梯度为50:50～100:0。进一步的，甲醇-水系统梯度变化为50:50、70:30、80:20、90:10和100:0。
较佳的，高效液相色谱法分离时，流速2.0mL/min，检测波长240nm。
本发明的第三目的在于公开海绵来源杂萜类化合物etherianone的应用，尤其是在制备抗炎药物和抗肿瘤药物中的应用。
活性试验证明，本发明化合物etherianone A在体外对4种人源肿瘤细胞显示出很强的细胞毒性，etherianone A和etherianone B在体内对斑马鱼模型的血管生成具有很强的抑制活性，因此可用于制备抗肿瘤药物的开发。
所述的海绵来源杂萜类化合物etherianone A和etherianone B的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的药物中的一种或多种，是抗肺癌药物、抗宫颈癌药物和抗结肠癌药物中的一种或多种；所述的肿瘤是肺癌、宫颈癌或结肠癌中的一种或多种。
所述的抗肺癌药物是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肺癌及其直接相关疾病的药物中的一种或多种，所述的肺癌是指非小细胞肺癌和小细胞肺癌中的一种或多种，所述的非小细胞肺癌是磷癌、腺癌或大细胞肺癌中的一种或多种。
所述的抗宫颈癌药物是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究宫颈癌及其直接相关疾病的药物中的一种或多种，所述的宫颈癌是非典型增生、原位癌、镜下早期浸润癌或浸润癌中的一种或多种。
所述的抗结肠癌药物是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究结肠癌及其直接相关疾病的药物中的一种或多种，所述的结肠癌是指左半结肠癌、右半结肠癌或直肠癌中的一种或多种。
本发明的有益效果在于：本发明制备方法简单，通过该方法制备得到的化合物etherianone A和etherianone B在体内对转基因斑马鱼血管生成具有明显的抑制活性，同时etherianone A对多种人源肿瘤株具有很强的细胞毒性。本发明为研究和开发新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。
附图说明
图1为etherianone A的二维核磁数据关键相关示意图；
图2为etherianone A的实测碳谱数据和计算碳谱数据的相关图；
图3为etherianone A的实测ECD谱和两种构型计算ECD谱的比对图；
图4为etherianone A和PTK787在转基因斑马鱼体内抑制新生血管生成实验的荧光显微镜照片；
图5为etherianone A和PTK787在转基因斑马鱼体内抑制新生血管生成实验的ISV的定量分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1化合物etherianone A和etherianone B的制备
取预先冷冻并切碎的倔海绵(湿重514g)，分别用甲醇(500mL)冷浸提取5次，合并提取液，提取液经减压浓缩得总浸膏，将总浸膏混悬到60％甲醇水中，再用等体积的二氯甲烷进行萃取5次，合并萃取液，减压浓缩，得到二氯甲烷萃取物(2.6g)，LC-DAD/MS在二氯甲烷萃取物中检测到etherianone A和etherianone B的存在。
将上述萃取物用减压硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，根据薄层色谱TLC分析结果，得到含有该类化合物的馏分，然后对该馏分再进行反相中压ODS柱色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱(50:50、70:30、80:20、90:10和100:0)，对于获得的含有倍半萜类化合物的精细馏分，再用高效液相色谱法进行分离(95％乙腈水，流速2.0mL/min，检测波长240nm)，得到化合物etherianone A(C25H30O2)和etherianone B(C25H30O2)。两个化合物的理化性质和核磁共振数据如下：
Etherianone A:无色油状物；[α]D 20-2.0(c 0.05,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)224(3.05),252(2.54)nm；CD(MeOH)λ(Δε)236(-3.00),266(-0.38),289(-0.89),338(+0.24)nm；DART-MS:m/z 363.2[M+H]+；DART-HRMS:m/z 363.2316[M+H]+(calcd for C25H31O2,363.2319)，1H NMR(600MHz,CDCl3)and 13C NMR(150MHz,CDCl3)见表1；
Etherianone B:无色油状物；[α]D 20-4.0(c 0.06,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)223(3.19),249(2.66)nm；CD(MeOH)λ(Δε)228(-4.21),265(+0.70),287(-0.73),337(+1.16)nm；DART-MS:m/z 363.2[M+H]+；DART-HRMS:m/z 363.2314[M+H]+(calcd for C25H31O2,363.2319)，1H NMR(600MHz,CDCl3)and 13C NMR(150MHz,CDCl3)见表1。
表1化合物etherianone A和etherianone B的核磁共振谱数据(CDCl3)
图1所示化合物etherianone A的二维核磁数据关键相关示意图的结构为：
图2示出了etherianone A的实测碳谱数据和计算碳谱数据的相关性，相关系数r2＝0.9973，提示计算碳谱数值与是测试具有高度的一致性；图3示出了化合物etherianoneA的实测ECD(电子圆二色谱)曲线(1)以及两种构型的计算ECD曲线(1a和1b)，确定该化合物的绝对构型为1S,5S,8S,9R,10S,16S，其结构式如下：
实施例2转基因斑马鱼体内抑制新生血管生成实验
对本发明化合物etherianone A和etherianone B进行转基因斑马鱼体内抑制新生血管生成实验，同时以Vatalanib(瓦他拉尼，PTK787)作为阳性对照药进行平行实验。样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内(终浓度<0.1％)。每个样品在测试中均设置5个复孔。
具体实验步骤：
斑马鱼胚胎的获取与培养：雌雄斑马鱼分开喂养，以照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄比例1:1或1:2的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水(含5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.4mmol/L CaCl2，0.16mmol/L MgSO4)中，28℃下控光培养。
抑制血管生成活性实验：在受精卵发育24h时，使用1g/L Pronase E溶液(Sigma，US)脱除卵膜。在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔8个。将两个化合物etherianone A和etherianone B用DMSO配成母液，并用蒸馏水稀释，取一定体积至培养孔中，然后用培养水加至2mL，使两个化合物的浓度分别为1.25、2.5、5.0μM/L，对照组(control)为1％DMSO，阳性药为PTK787。然后加盖，置于光培养箱在28℃条件下让胚胎继续发育。在48hpf(hours post fertilization,受精后时间)时，荧光显微镜观察并计数斑马鱼体节间血管(intersegmental vessels，ISV)数，计算抑制率，并观察胚胎死亡获畸形情况。
抑制率/％＝(正常对照组血管数－给药组血管数)/正常对照组血管数×100％。
并计算两个化合物对新生血管抑制活性的半数抑制浓度IC50值。
结果如下：
图4和图5中示出了化合物etherianone A在转基因斑马鱼Tg(VEGFR2:GFP)胚胎模型中的抗血管生成活性(n＝5)。具体的，图4示出了斑马鱼幼苗躯干侧面观察显示出加入不同浓度etherianone A经过24小时后节间血管ISV的变化图；采用瓦他拉尼Vatalanib(PTK787)作为阳性对照药；白色箭头标示ISV，白色星号标示新生血管ISV的消失。图5示出了斑马鱼模型中添加化合物etherianone A后ISV的定量分析。数据来源于5次单独实验，用标准偏差来表示±SD，**p<0.05，##p<0.01与对照组比较。
图4和图5显示化合物etherianone A对转基因斑马鱼体内抑制新生血管生成具有很强的抑制活性，IC50值分别为2.4μM，且具有良好的剂量依赖关系；采用同样的方法测试出etherianone B抑制新生血管生成活性的IC50值为8.7μM。
实施例3体外细胞毒实验
对本发明采用MTT法测试化合物etherianone A进行体外细胞毒活性。化合物用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。每个样品在测试中均设置3个复孔。
具体实验步骤：
选用4种人源肿瘤细胞株，骨髓瘤NCI-H929细胞、肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞以及卵巢癌SK-OV-3细胞(中国科学院上海生命科学研究院)，在RPMI 1640培养液中、在5％CO2和95％空气中培养，温度为37℃，并添加10％(V/V)的胎牛血清和80U·mL-1的青霉素/链霉素。细胞加到96孔板中，加入3个浓度的(1.25，5，20μM)etherianone A分别培养48h。选用5-氟尿嘧啶然后在490nm条件下在MAX 340分光光度仪测试吸收度OD值，并计算出抑制率和IC50值。
结果如下：
化合物etherianone A对骨髓瘤NCI-H929细胞、肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞以及卵巢癌SK-OV-3细胞均显示出很强的细胞毒性，IC50值分别为8.3、12.2、7.4和9.4μM。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
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